方法論記事

自動3D追跡システムを使用して、成魚のゼブラフィッシュの個体群と群れを記録

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DOI：

10.3791/50681

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2013年12月5日

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1R&D, xyZfish

この記事について

サマリー

ゼブラフィッシュの個体やグループを追跡できる3D自動ビデオシステムの使用について説明しています。応用例として、NMDA受容体拮抗薬MK-801がゼブラフィッシュの群れに及ぼす影響について検討します。

要約

多くの水生動物と同様に、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は3D空間を動きます。したがって、その動作を研究するために3D記録システムを使用することが好ましい。提示された自動ビデオ追跡システムは、ミラーシステムと、水から空気への光の遷移によってもたらされるかなりの誤差を補正するキャリブレーション手順を使用してこれを実現します。このシステムにより、ゼブラフィッシュの単体と成体ゼブラフィッシュのグループの両方を記録することができます。使用する前に、システムを校正する必要があります。このシステムは、Recording、Path Reconstruction、Data Processingの3つのモジュールで構成されています。キャリブレーションと3つのモジュールの使用に関するステップバイステップのプロトコルを示します。実験のセットアップに応じて、このシステムは、新恐怖症、白人嫌悪、社会的結束、運動障害、新規物体探索などのテストに使用できます。これは、薬物や突然変異が基本的な行動パターンに及ぼす影響を研究するための最初のステップツールとして特に有望です。このシステムは、ゼブラフィッシュの垂直分布と水平分布、運動学的パラメータのxyz成分(移動運動、速度、加速度、回転角度など)に関する情報を提供し、浅瀬を試験する際に社会的結束のパラメータを計算するために必要なデータを提供します。

概要

ゼブラフィッシュは、生物学的および薬理学的研究の重要なモデルとなっています1-3。個々のゼブラフィッシュとゼブラフィッシュの群れの動きと空間分布パターンの追跡は非常に貴重です。古い研究では、記録された画像に基づいて手動による定量化が適用されています4。現在、2D自動ビデオトラッキングシステムが一般的に使用されています5。しかし、ゼブラフィッシュをはじめとする多くの水生動物や非水生動物が3次元空間を移動するため、3次元システムへの関心は高まっている6。記載されている3Dシステムは、20077で最初に公開されました。技術的な詳細と他のシステムとの比較については、8 を参照してください。このシステムの基本的な利点は、ミラーリングシステムを使用して 2 つ (オプションで 3 つ) の同期ビューと独立したビューを取得し、2 ステップのキャリブレーションプロトコルを使用することです。最初のステップでは、ステレオシステムの3Dジオメトリ(カメラとミラーによって形成される)がキャリブレーションされます。2 番目のステップでは、光の屈折によってもたらされる非線形誤差が修正されます。水生動物を研究する場合、矯正せずに放置すると、光の屈折の影響が大きくなる可能性があります。これまでに公開された他のシステム(さらに新しい開発9)では、2段階のキャリブレーション手順が省略されています。オブジェクトの識別、マルチオブジェクトトラッキングによるオクルージョン、ジギングノイズなどに関する技術的な詳細については、こちらをご覧ください。読者は、元の出版物8,9を参照します。このシステムは、不安様行動反応10,11、浅瀬8,11,12の研究、および予備研究ではゼブラフィッシュ13の拮抗行動の研究で検証されています。また、他の魚種(金魚8、ソードテイル、トラバーブ)やマウス9についてもテストされています。

以下では、キャリブレーションとシステムの使用に関するプロトコルについて説明し、NMDA受容体非競合アンタゴニストMK-801がゼブラフィッシュの浅瀬に及ぼす影響を検証した実験結果を代表的な例として提示し、システムで取得できるデータの種類を示します。

自然環境でも水族館でも、ゼブラフィッシュは通常浅瀬で泳ぎます14。群れの好みは、飼育、性別、食料の入手可能性など、いくつかの要因に依存しているようです14,15。興味深いことに、群れ内の個々のゼブラフィッシュ間の距離は、警報フェロモン16や新規性11などの潜在的な危険の信号が存在すると小さくなる。したがって、浅瀬のパラダイムは、抗不安薬17のテストにも使用されています。支配階層18と社会的学習19は、ゼブラフィッシュの行動の魅力的な側面です。ゼブラフィッシュは、その高度に発達した社会的行動特性のために、自閉症研究の関心事にもなっています20,21。

MK-801は、ゼブラフィッシュ5,22,23の社会的行動を変化させることが報告されており、これは哺乳類への影響を彷彿とさせます24。しかし、MK−801は、他の行動(例えば、遊泳行動、抑制的回避および場所選好25−27)に対する他の多くの影響も有する。したがって、初期の実験では、基本的な観察からできるだけ多くの情報を得ることが重要です。これは、よりターゲットを絞った実験を設計するための基礎を提供します。

録音装置・ソフトウェアの調査

現在の構成では、ゼブラフィッシュを収容した観測容器(25cm×25cm×18cm、長さ×幅×高さ)が観察室(91cm×46cm×56cm、長さ×幅×高さ)に配置されています。チャンバーには、カメラ、容器から約>45°の角度で吊り下げられたミラー、LEDライトバーも含まれています。図 1 は、簡略化された図を示しています。カメラは正面図と上面図(鏡)の両方を記録し、ゼブラフィッシュのx座標、y座標、z座標を決定することでゼブラフィッシュの3D軌道を構築します。オリエンテーションの目的で、座標ベクトルは観測コンテナの左前隅(カメラに対する位置)に表示され、Path Reconstruction Module(以下を参照)によって生成された3Dビュー(図15など)に表示されるベクトルに対応します。サンプリングレートは、カメラとコンピューターによって異なります。私たちの実験では、約40フレーム/秒(fps)です。記録されたフレームの空間解像度は 640 x 480 ピクセルです (この構成は、空間解像度と時間解像度の最適なバランスとして選択されています)。Windows XP 以降が必要です。

最初の記録の前に、容器の壁と水面の位置を決定し、記録されたフレームのスケーリング係数を決定し、水から空気に通過する光の屈折によって生成される大きな誤差を調整するために、システムを較正する必要があります。原則として、キャリブレーションは、初期設置時と、カメラやミラーなどのセットアップの一部を移動または交換した後にのみ実行する必要があります。それでも、キャリブレーションがまだ正しいかどうかを時々確認し、必要に応じて再キャリブレーションすることをお勧めします。

ソフトウェアは3つのモジュールで構成されています。録音モジュールはフレームを記録します(図2に2つのフレームの例を示します)。軌道モジュールは、すべてのゼブラフィッシュの経路を再構築します。データ処理モジュールは、さまざまな標準的な運動学的パラメータと空間パラメータを計算します。さらに分析するために、データをスプレッドシートまたは統計ソフトウェアにインポートできます。

プロトコル

すべての実験は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイドに従って行われました。

1. キャリブレーション

  1. 空の観察容器をチャンバー内に配置し、容器の足が設けられた穴に挿入されて正しく位置合わせされるようにします。半透明の壁(反射を減らすことが構造の目的)がカメラの向こう側と右側を向くようにコンテナを向けます。
  2. 録画モジュールを開き、[カメラコントロール]を選択し、[ゲイン]と[シャッター](選択を解除した後、右側のボックス)を調整して、画像が鮮明になるようにします。サイドミラーを観察容器の左側に約45°の角度で配置して、コンピューターモニター上の容器の側面が完全に見えるようにします。さらに、コンテナの前面壁が1本の線として見えるようにミラーを位置合わせする必要があります(図3の矢印で示されています)。
  3. キャリブレーションパネルを(カメラカードの)パラレルポートに接続し、レコードモジュールの「LEDパネルのオン/オフ」ボタンを押してLEDをオンにします。
  4. 図3のように、5つのLEDがコンピューターモニターの正面、上面、側面に見えるように、キャリブレーションパネルを空の観察コンテナに置きます(ケーブルがビューを遮ることがありますが、この場合は移動します)。また、LEDが水位のマークの下にあること(これらのマークはタンクの内側底から135mmのところに観測容器に刻印されています)、パネルの位置が安定していること(手順1.9で容器に水を入れたときに動かないように
    5. )を確認してください。
  5. 観察室内の照明を消し、カーテンを閉めます(キャリブレーションパネルのケーブルやサイドミラーに触れないように注意してください)。
  6. 「データの場所」ボタンを押して、キャリブレーション用のフォルダを作成または選択します files.これらのファイルは、再キャリブレーションが必要になるまで、後続のすべての記録(または実験)に使用されます。したがって、理想的には、キャリブレーション データをキャリブレーション フォルダーの名前の一部にしてください。
  7. コンピュータ画面の3つの赤いボックスを調整して、各ボックスが3つのビューのいずれかの5つのLEDを囲むようにします(図4、左パネル)。ここでも、「カメラ制御」の下の「ゲイン」と「シャッター」を使用して、図4の右パネルのように、他の光点(ノイズ、反射、またはコンテナの壁の水滴による)の画像なしで、LEDの鮮明な画像を取得します。
  8. LEDをオフにして、「水なしでキャリブレーションを収集」ボタンを押します。コンピューターの画面には、0 から 4 までの番号が付けられた 5 つのタグ ('x') が表示されます。パネルの電源を入れます。タグの位置は LED と一致する必要があります。そうでない場合は、手順 1.7 を繰り返します (左側のパネルでのタグ割り当てが正しくない場合と、右側のパネルでのタグ割り当ての誤りについては、図 4 を参照してください)。
  9. 観察室にマークまで水を入れます。LEDは水位より下にある必要があります(手順1.4で説明したように)。それらが水位より上にある場合は、コンテナを空にして手順1.4に戻ります。容器に水を入れるときは、LEDパネルが動かないように注意してください。ただし、これが発生した場合は、コンテナを空にして手順1.4に戻ってください。キャリブレーションは、記録されたLEDの位置の水なしと水ありのLEDの位置の違いを決定することに基づいているため、これは重要です。
  10. 「Collect calibration w. water」ボタンを押します。ここでも、ステップ1.8と同様に、5つのタグが画面に表示され、ほとんどの場合、水なしでのキャリブレーション中に取得されたタグからわずかにオフセットされます。このステップでは、ゲインとシャッターを再調整する必要がある場合があります。タグがLEDの上に正しく配置されるまで繰り返します(図4の右パネルを参照)。
  11. 観察室の照明を点灯し、ゲインとシャッター(「カメラコントロール」の下)を調整して、画像が明るすぎないようにします。
  12. 図 5 は、マウスを右クリックして順番に選択する必要がある 6 つのポイントを示しています。ポイントが指定された線上にあることを確認してください:1.正面図の水位、2.上面図のコンテナの左上尾根、3.側面図の正面壁の輪郭を描く垂直線。線の長さは必須ではありません。位置 1 と 2、3 と 4、5 と 6 をクリックすると、直線が表示されます (実際には数字は画面に表示されません)。「コンテナ情報の収集」を押して、この情報を保存します。
  13. サイドミラーとLEDパネルの両方を取り外し、マークまで正確に水を満たします。「録音開始」を選択します。新しいウィンドウで、期間を分単位で尋ねられます。現在の目的のためには、1分で十分です。OKを押します。
  14. 記録後、Record Moduleを終了し、Trajectoryモジュールを開き、「Data Location」を含むキャリブレーションフォルダ(手順1.6で作成)を選択します(ファイルの読み込みには時間がかかる場合があります)。このフォルダには、キャリブレーションファイルと記録したばかりのデータ(ステップ1.13)のファイルが含まれています。
  15. 「背景を取得」ボタンを押します。新しいウィンドウが開き、何も変更せずにOKを押してください。モニターに観測タンクの(逆さまの)画像が表示されるまで待ちます。次に、「Load Background」を押します。背景画像が修正されます。新しいウィンドウが開き、ボックスの調整を求められます。OKを押すだけです。
  16. 3番目から7番目のボタンを順番に押します:「水なしで通信をロードする」、「仮想カメラを調整する」、「屈折した通信をロードする」、「コンテナジオメトリを収集する」、「動物のコンテナ情報を取得する」。この後者の手順には数分かかる場合があります。画面に 3 本の白い線 (手順 1.12 で描画した線) が表示されたら完了です。「コンテナ情報を保存」ボタンを押します。
  17. 「ボリュームを収集」ボタンを押します。次に、図6に示すように、直方体である水域の8つの角を連続してマークします。すべてのポイントについて、最初に正面図でクリックし、次に上面図でポイントをクリックします。
  18. ウィンドウの左隅にある「3D」を選択します。新しいウィンドウが開き、底が白いボックスのアウトラインが表示されます (図 15 と同様ですが、軌道はありません)。マウスを右クリックして、ボックスビューの回転と平行移動を選択します。画像が表示されない場合、または画像が直方体の画像でない場合(つまり、手順1.17で角が間違った順序で右クリックされた場合)、次の手順を行います:軌道モジュールを閉じずに、Windowsを使用してキャリブレーションフォルダ(手順1.6で作成)に移動し、サブフォルダ「Animal container data」を選択し、TankVerticesという名前のファイルを削除して、手順1.17を繰り返します。
  19. おめでとうございます、キャリブレーションが完了しました。理想的には、ダミーの魚でテストランを実行して、すべてがうまく機能するかどうかを確認する必要があります。良いニュースは、ミラーまたはカメラの位置が(わずかでも)変更された場合、または追跡に問題がある場合にのみ、再キャリブレーションを実行する必要があるということです(セクション3を参照)。

2. 録音

  1. マークまで水で満たされた観察容器を観察室に入れ、容器の足が設けられた穴に挿入されるようにして、正しく位置合わせします。カメラから見て、半透明の壁(この例では白い壁 - ディスカッションを参照)が向こう側と右側を向くようにコンテナを向けます。
  2. コンパートメントのライトをオンにし、(実験用またはダミーの)魚をコンテナに入れてカーテンを閉めます。注:システムは複数の魚を記録できます(代表的な結果のセクションを参照)。ただし、最初に単一の魚を記録することにより、システムの経験を積むことをお勧めします。
  3. レコードモジュールを開きます。画面には、コンテナの正面図と上面図(鏡面)の画像が表示されます。画像は理想的ではない可能性があり(例:露出オーバー、例:図7)、魚と背景のコントラストを良好にするために調整(次の3ステップ)が必要になる場合があります(例:図8)。
  4. 「カメラコントロール」を選択し、開いた「一般設定」ウィンドウで、「シャッター」と「ゲイン」を調整します(右側の対応するボックスの選択を解除した後、図9を参照)画像が露出オーバーにならず、魚と背景のコントラストが良好になるようにします。
  5. 「カメラコントロール」ウィンドウの左側で「ホワイトバランス/カラー」を選択し、新しいウィンドウで「自動」ボックスの選択を解除し、赤と青の値を調整します(図10を参照)正面図と上面図の両方で最適なカラーコントラストを実現します。
  6. 最適なカメラ設定を得るには、色の調整(「ホワイトバランス/カラー」の下)とゲインとシャッターの調整(「一般設定」の下)を数回切り替える必要がある場合があります。調整をしなくても満足する場合でも、「シャッター」、「ゲイン」、「オート」ボックスの選択を解除することが重要です(手順2.4と2.5で説明しました)そうしないと、記録の過程で背景が変動し、軌道を抽出できなくなります。その他の設定は変更しないでください。完了したら、「カメラコントロール」ウィンドウを閉じます。
  7. レコードモジュールのメインメニューから「データの場所」を選択して、以前に作成したフォルダを作成するか、開きます。すべての記録(魚や浅瀬など)には独自のフォルダがあり、理想的には実験フォルダのサブフォルダである必要があることに注意してください。
  8. 「録音開始」を押します。ウィンドウが開き、録音の継続時間を分単位で入力するように求められます(整数のみ入力してください)。「OK」を押すと、実際の録音セッションが開始されます。
  9. 録音が完了したら、プログラムを終了します。次の魚を記録する前に、コンピューターを再起動することをお勧めします。Windows の [再起動] オプションを使用して、カメラの設定を保持します (手順 2.4 と 2.5 から)。録画の合間にコンピュータを再起動する必要があるのは、カメラカードにいくつかの問題があるためです。
  10. パスの再構築のために軌道モジュールに移動する前に、キャリブレーションフォルダ(このプロトコルのセクション1で作成)から「Animal container data」および「Correspondence data」サブフォルダをコピーして、記録中に作成されたすべてのフォルダに貼り付けます。これらの後者のフォルダには、他の2つのサブフォルダ、つまり「生データ」と「タイムスタンプ」が存在します。前者には、JPEG形式で記録されたすべてのフレームが含まれます。後者には、フレームの総数とフレーム間の間隔 (ミリ秒単位) に関する情報が含まれています。

3. パスの再構築

  1. Trajectoryモジュールを開き、[Data location]を押してレコードモジュールで作成されたフォルダを選択し、[System Setup]ボタンを押して[Parameters]を開きます(図11を参照)。
  2. 上面と下面のビューの色のしきい値を選択します。適切な開始値は 1,000 です。この値が低い場合、ソフトウェアはノイズを記録する可能性が高くなります。ただし、値が高すぎると、魚が検出範囲を下回っている可能性があります。後で(ステップ3.11および3.12)、色のしきい値を再調整する必要が生じる場合があります。また、上部と下部の色のしきい値は同じである必要はないことに注意してください。
  3. [Top and Bottom View Size Thresholds] を選択します。中型のゼブラフィッシュは10、非常に大きいゼブラフィッシュは20、非常に小さいゼブラフィッシュは5から始めるのが良いでしょう。サイズのしきい値が高いほど、ノイズを拾う可能性が低くなります。ただし、高すぎると、ソフトウェアが魚を検出できない可能性があります。ここでも、ステップ 3.11 と 3.12 で、サイズのしきい値を再調整する必要が生じる場合があります。また、サイズの上部と下部のしきい値は同じでなくてもよいことにも注意してください。
  4. 「Upper Size Threshold」の場合は通常 3,000 の値が適切で、「Specific Length」の場合は 220 (プリセット済み) のままにします。「魚の数」とは、観測水槽の中の魚の数を指します。「Max num of Points」はフレームの総数を指します。この数字または少し小さい数字を覚えて(または書き留めて)、覚えておいてください(または書き留めてください（例えば、45,703は45,000として記憶されるかもしれません)。OKを押します。
    5. 「
  5. Load correspondence w/no water」、「Calibrate virtual camera(s)」、「Load animal container info」ボタンを順番に押します。calibration-subfolders 'Animal container data' と 'Corresponding data' が現在の実験フォルダにコピーされなかった場合、エラーメッセージが生成されます (ステップ 2.10 を参照)。その場合は、ここでそれらのサブフォルダをコピーして貼り付け、ボタンをもう一度押します。
  6. 「背景を取得」ボタンを押します。新しいウィンドウでは、'from' と 'to' にそれぞれデフォルト値の 0 と 100 を入力するように求められます。100 を最大フレーム数に変更します (ステップ 3.4 の例では、これは 45,000 と簡略化できます)。OKを押します。
  7. (歪んだ)画像が表示されるまで待ちます。次に、[背景をロード]を押すと、正しい背景画像が確立されます。この背景画像では魚が見えないようにする必要があります。魚が見える場合は、他の記録セグメントからより良い背景を取得してみてください(たとえば、手順3.6で0〜1,000、1,000〜2,000などを試してください)。
  8. 録画セッション中に魚がまったく動かなかった場合、背景を取得する唯一の方法は、魚を削除して魚なしで新しい短い録画を行うことですが、同じ「カメラコントロール」設定を使用します(これは重要です)。背景を取得し、「Background data」サブフォルダを現在の実験フォルダにコピーします。次に、「背景をロード」を押し、「背景を取得」を押さないでください。カーテンを開閉すると背景が多少変わることが多いため、ノイズを減らすためにステップ3.2と3.3でしきい値を調整する必要があるかもしれないことに注意してください。ステップ3.11は、ノイズをチェックする方法を示しています。
  9. 背景を読み込んだ後、図 12 に示すように、マウスを使用して 3 つの赤いボックスを調整します。ボックスは、ソフトウェアが魚を探しているエリアを示しています。左側のボックスを閉じます(つまり、線または点に縮小します)。側面図はキャリブレーションにのみ使用されます(手順1.7で説明したように)。
  10. 「軌道の生成を開始」ボタンを押します。開始フレーム番号を求めるウィンドウが開きます。デフォルトの「0」を使用します。「OK」を押すと、「Tag assignments」ウィンドウが開きます(図13を参照)。タグ(「X0」)が画面に表示されるまで「ステップフォワード」を押します。タグが魚の画像に配置されていない場合は、正しく配置されるまで「いいえ」を押してください。次に、「Go」を押します。正しく割り当てられていない(またはまったく)場合は、とにかく「実行」を押して問題を探します(次の手順)。
  11. パスの再構築が開始されます。理想的には、タグは常に(または少なくともほとんどの場合)魚の画像に配置する必要があります。間違って配置されることが多い場合は、「情報」ウィンドウ(ビデオ画面の上の2番目の選択肢)を開きます。図14Aは、魚の輪郭のみが見える理想的なケースを示しています。図 14B は、ノイズが大きすぎてタグが正しく割り当てられない場合を示しています。図14Aのように、ノイズのない魚の鮮明な画像が表示されるにもかかわらず、タグが正しく割り当てられることがまったくないか、めったにない場合は、最も可能性の高い理由は、キャリブレーションがオフになっていることです。パスの再構築を再調整してやり直します。キャリブレーション中にミラーとカメラが移動されない場合は、新しいキャリブレーションデータを以前に実行した録画に使用できます。
  12. ノイズが大きすぎる場合(図14Bなど)は、メインメニューの[停止]を押して、新しい色とサイズのしきい値を選択します(手順3.2および3.3)。また、赤いボックス(ステップ3.9)を少し減らすことができるかどうかを確認します(たとえば、上部の水の動きによって発生するノイズを排除するため)。プログラムが「スタック」していることがあることに注意してください (タグをまったく割り当てることができなかった場合): この場合は、プログラムを再起動してください。
  13. 3D画面(画面上の3番目の選択肢)で軌道を確認します。図 15.は、軌道の例を表します。マウスを右クリックして、3Dコンフィギュレーションの回転と平行移動のどちらかを選択します。
  14. 軌道が完了したら、「保存」(軌道を削除する「停止」ではありません)、「軌道クリーンアップ」、および「軌道の平滑化」ボタンを順番に押します。新しいウィンドウが開き、平滑化のフィルターパラメータが表示されます(図 16)。システムの経験を積む前に、デフォルト値を変更しないでください。「OK」を押します。
  15. ここまでで、録画(ステップ2.4-2.6を参照)の前に、適切なカメラ設定(魚と背景のコントラストが良い)を選択することがなぜそれほど重要だったのかは明らかです。データ処理に進みます。

4. データ処理

  1. まず、魚の記録に使用されたフォルダーを見てみましょう(図17)。これには、キャリブレーションフォルダ(ステップ2.10)からコピーされた「Animal container data」サブフォルダと「Correspondence data」サブフォルダ、魚の記録中に作成された「Time stamps」サブフォルダと「Raw data」サブフォルダ、パスの再構築中に作成された「Background data」サブフォルダと「Trajectories」サブフォルダが含まれています。
  2. 図 17 は、'Trajectories' サブフォルダに 3 つのファイルが含まれていることも示しています。point.smoothed-file は、さらなるデータ処理に使用されるファイルです。複数の魚の記録(例:浅瀬実験)の場合、すべての魚に対して個別のpoint.smoothed-fileが生成されます。
  3. 図 18 は、point.smoothed-file の例の上部を示しています。最初の行はサンプルまたはフレームの総数、2行目は記録時間(分単位)、3行目はカメラに対する水域の中心の座標(シーケンス:x、z、y)を示します。これに続いて、フレームごとに 1 行が続き、魚の x、y、z 座標 (mm) とそのサンプルの持続時間 (秒単位) を示します。
  4. point.smoothed-filesで提供されるデータを処理するには、データ処理モジュールを使用するか、ExcelやMATLABなどの他のソフトウェアを使用して、データ処理モジュールに(まだ)組み込まれていない計算を行う方法があります。
  5. Data Processing Moduleを開き、ツールバーの「Project」を選択し、プルダウンメニューから「New」を選択し、実験の名前を入力します。ツールバーの「プロジェクトの編集」を選択し、プルダウンメニューから「プロジェクトに追加」を選択し、続いて「新しいグループ」を選択して、グループの名前(例:「コントロール」)を入力します。現時点では、プロジェクト名とグループ名は実際には使用されていませんが、名前を埋める必要があることに注意してください。作成されたフォルダは、出力ファイルを保存するために使用できます(手順4.10を参照)。
  6. 右側のウィンドウでグループ(「コントロール」など)を選択します(図19を参照)。ツールバーが変わります。「グループを編集」を選択し、プルダウンメニューから「グループに追加」を選択し、「新しい測定値」を選択します。これにより、ブラウザが開きます。記録中に作成したフォルダ(手順2.7)を開き、サブフォルダ「trajectories」を選択してから、point.smoothed-fileを選択します。図 19 に示す例では、グループ A では 6 つのファイルが読み込まれ、グループ B では 4 つのファイルが読み込まれました。(図の例では、スムージングされたファイルの拡張子が 0 と 1 であることに注意してください。これは、その実験で 2 匹の金魚が同時にテストされたためです)。
  7. 分析には、右側のウィンドウでポイントスムージングファイルを選択し、[Data Processing]を選択し、プルダウンメニューから[Single Endpoints]を選択し、例として[Duration freezing]を選択します(図20)。ウィンドウが開き、速度のしきい値と期間のしきい値でフリーズを指定できます。この例では、魚は観測時間の25.86%を凍結に費やしています。
  8. プログラムに慣れるために、移動距離、深度分布(深度レベルの数を決定可能)、バースト頻度などの他の例を試してみてください。
  9. 例えば、加速度のz成分のスペクトル解析など、より高度な計算があります。この場合は「Time-series features」を選択し、次に「TD freq domain analysis」、「Spectral analysis」、「Z accele spectrum」を選択します。示されたパラメータに対してフーリエ解析が実行されます(説明7の場合)。メニューに表示されるすべてのオプションがまだ完全に実装されているわけではありません。たとえば、「Path tortuosity」は実験的に追加されただけです。
  10. 「デフォルトのしきい値を使用したバッチ処理」オプションを選択すると、約 200 のエンドポイントが計算されます。このコンテキストでは、「デフォルト」は区切り文字が設定されていることを意味します。たとえば、現在、深度分布は 3 つの深度レベルに対して計算され、角度分布は 4 つのセクション (つまり、象限) に対して計算されます。パラメータを生成すると、新しいウィンドウが開き、作成するファイルの場所と名前を尋ねられます。これらはCSV形式で保存され、Excelなどの他のソフトウェアにインポートしてさらに処理することができます。
  11. 記録モジュールや軌道モジュールとは対照的に、データ処理モジュールは、研究者の要件にさらに適応する進化するモジュールです。

結果

系統不詳（「ショートフィン」）の野生型系統である6ヶ月齢の雌ゼブラフィッシュ（Danio rerio）をAquatica Tropicals, Inc.より購入した。合計120匹のゼブラフィッシュを使用した。実験開始前に、38 Lのアクアリウム内で約8週間、ラボ条件下で馴化させた。水温は室温（~23° C）とした。明暗サイクルは、点灯14時間（6:00-20:00）、消灯10時間とした。ゼブラフィッシュには1日3回給餌を行った（8:00にTetra tropical flakes、12:00に生アルテミア幼生、15:00にTetra tropical flakes）。実験当日は、8:00にのみフレークフードを給餌した。2回目の記録直後に、300 mg/Lのトリカインメタンスルホネート（MS-222）を用いてゼブラフィッシュを安楽死させた。

対照群には14組の四つ子（すなわち（4匹1組のゼブラフィッシュのグループ）を使用した（n = 14）。MK-801群では16組（n = 16）を使用した。1時間の暴露後、 10 µM MK-801（9:30より開始）を含む1 Lの容器から、4匹1組のグループを観察用容器に移動させた。直ちに記録を開始し（10:30）、20分間継続した。その後、ゼブラフィッシュを容器内に3.5時間保持した。この間、エアポンプに接続されたチューブを介してエアレーションを行った。14:00に、2回目の20分間の記録を行った。これら2回の記録の目的は、慣れの影響および／または薬剤の効果の減衰を調べることであった（ラットにおけるMK-801の半減期は約2時間である。28）。我々は、（1）平均社会距離（個体間距離とも呼ばれる）を分析した。11,29(1) 社会的結束性の指標としての、(2) 10段階の深度レベルにおける垂直分布、(3) 4つの放射状ゾーンにおける水平分布（参照 図24A、 （各ゾーンの位置を示す挿入図）および各四分限にわたって（参照 図24B、象限の位置を示す挿入図）、および(4)移動距離の3成分（x, y, z）とした。データは群ごとに平均化した。Shapiro-Wilkins検定により、すべての変数が正規分布しているわけではないことが示されたため、対照群とMK-801群の平均値を比較するために、すべての変数にMann-Whitney U検定を適用した。これらの比較は、午前と午後のセッションで個別に実施した。4つの（変数の）グループを用いたため（上述参照）、α = 0.05/4 = 0.0125とした。

図2A 対照群のゼブラフィッシュと、～の典型的な例を示すフレームである。 図 2B MK-801で処理したゼブラフィッシュの代表的な例を示しており、いずれも午前のセッション中に記録されたものである。対照群のゼブラフィッシュが底面付近かつ前面の壁に近いことに注目されたい（すなわち（カメラに近い側）であり、密接に結合したままの状態であった（すなわち社会的な凝集性が高かった）。対照的に、MK-801で処理したゼブラフィッシュは上層付近に位置し、水平面における好みを全く示さず、互いにかなりの距離を置いて泳いでいた（すなわち 社会的連帯感が低かった）図 21 代表的な軌跡を示す。対照群のゼブラフィッシュは、観察容器の前側に留まる明確な傾向を示した。さらに、彼らはほとんどの時間、底面近くに留まっていた。一方、MK801を投与したゼブラフィッシュは、水平面上のあらゆる場所を泳ぎ回った。しかし、10時30分時点では、上層を好む明確な傾向が見られた。14時00分になると、彼らの垂直方向の分布はより均一になった。

データの定量分析により、我々の記述が裏付けられた。Figure 22Aは、午前中（10:30時点）において、MK-801投与ゼブラフィッシュの平均社会的距離（i.e. 4匹1組のゼブラフィッシュ間における個体間の平均距離）が、対照群のゼブラフィッシュに比べて3倍以上大きかったことを示しており、U = 0、p<0.00001であった。3.5時間の順化後（14:00時点）では、対照群のゼブラフィッシュの社会的距離は増加したが、MK-801投与ゼブラフィッシュではほぼ不変であった。しかしながら、両群の間で有意な差は維持されていた（U = 19, p<0.0005）。Figure 22Bは、10:30と14:00の両時点における、2つの実験群の社会的距離のタイムラインを示している。

垂直分布についても、両群で大きく異なっていました。図23に示されるように、午前（10:30）および午後（14:00）のいずれにおいても、対照群のゼブラフィッシュは、ほとんどの時間を下位2〜3つの深度レベル（i.e. 観察容器の底に最も近いレベル）で過ごしていました。一方、MK-801投与群のゼブラフィッシュは、10:30時点ではほとんどの時間を水面に近い場所で泳いで過ごしていました（図23A）。3.5 hrの馴化後、14:00時点では、彼らはほぼすべての深度レベルに均等に分布していました。

水平分布についても、両方の実験群で非常に異なっていました。 図24A MK-801を投与したゼブラフィッシュは、対照群のゼブラフィッシュと比較して、外側ゾーンで過ごす時間が短く、中間ゾーンおよび中心ゾーンで過ごす時間が長いことがわかります。象限に関するグループ間の差はさらに顕著であり（図24B）。対照群のゼブラフィッシュは、前方の2つの象限（1および4）に対して非常に強い好みを示した。 すなわち容器のカメラに最も近い側。対照的に、MK-801を投与したゼブラフィッシュは、4つの四分限にほぼ均等に分布していた。

運動学的パラメータに関しては、ここでは移動距離（図25）に絞って考察します。MK-801投与ゼブラフィッシュは、対照群のゼブラフィッシュよりも多く移動しました。興味深いことに、この差は移動距離のy成分において特に顕著でした。これはカメラの方向にあたります（図1参照）。実際、対照群のゼブラフィッシュは、ほとんどの時間を第1象限および第4象限の前壁付近で過ごしていました（図24Aおよび24Bで確認できます）。一方、MK-801投与ゼブラフィッシュは、容器の前半分と後半分の間を往復して移動していました。

ここでは、本実験で得られたデータを分析するための可能な方法の例を提示したのみである。現時点では、結果に対して特定の生物学的解釈を付加することは控える。しかしながら、MK-801はラットにおいて社会的退避30を誘発し、社会的探索行動を減少させる31ことが判明しており、統合失調症の陰性症状のモデルとして研究されてきた30ことに言及しておく価値はある。また、哺乳類において、過剰行動31、旋回行動32、感覚障害33、および前脈拍抑制の減少34も引き起こした。我々はこれらの障害を特異的にテストしたわけではないが、我々の知見はそれらと矛盾しないと思われる。ゼブラフィッシュにおけるMK-801の上述の効果が、哺乳類で報告されているものと同等であるかを確認するには、より特異的な実験セットアップが必要である。また、ゼブラフィッシュでMK-801によって誘発された行動の変化において、不安、呼吸の問題、空間的見当識障害、注意欠陥、常同行動などが重要な役割を果たしたかどうかを判断するためには、さらなる分析と実験が必要となるであろう。

Optical measurement setup diagram with camera, computer, cube, and mirror; photonics study.
図1. 装置の概略図。 カメラでフレームをキャプチャします（すなわち 観察タンクの正面図と上面図の両方を示す（静止画）。これらのフレームは、後で処理を行うためにコンピュータに保存される。ゼブラフィッシュの運動および位置の3次元的な特性を記述するために重要となる、xyz方向の位置に留意すること。図中の2つの網掛けされた壁（およびタンクの底面）は、本実験（「代表的な結果」を参照）において白く塗装されており、他の2つの壁は透明であった。 クリックして拡大画像を表示.

魚の水槽行動実験、魚の分布がある2つの水槽、行動研究のセットアップ。
図2. フレームの例。 正面図または上面図のみでは情報が欠落することがわかります。これはパネルBで特に顕著であり、正面図では左側の3匹のゼブラフィッシュが互いに近接しているように見えますが、上面図ではそうではないことが示されています。一方で、上面図からは底面からの距離に関する情報は得られません。A) コントロールのゼブラフィッシュ。B) 10 µM MK-801で処理したゼブラフィッシュ。背景の色（青）は録画ソフトウェアによって生成されたものであり、良好なコントラストを得るために選択されたことに注意してください。背面、右側、および底面の実際の色は白でした。こちらをクリックして拡大画像を表示。

水生動物行動追跡システム；ビデオ解析セットアップ；キャリブレーションパネル；モニタリングプロセス
図3. サイドミラーの調整。左側の白い矢印は、サイドミラーに映った前面壁（カメラに最も近い壁）を示しています。2本の線が見える場合は、線が1本だけに見えるまでサイドミラーの位置を調整してください（ステップ 1.2）。キャリブレーションパネルの5つのLEDが、3つのビューすべてで明確に見えています。チャンバー内の照明が点灯しているため、LEDパネルに多くの他の反射が見えることに注意してください（ステップ 1.4）。ここをクリックして拡大画像を表示。

粒子検出プロセス、赤色の枠線、光学解析図、低光量条件下。
図 4. LEDのタグ付け。 左パネルは、キャリブレーション手順によって特定された5つのタグ（0から4の番号）が、実際のLEDと一致していないことを示している。LED以外に他の光点（実際には反射）が見られる。右パネルでは、ゲインとシャッターを下げたことで、LEDのみが可視となっている。これにより、5つのタグが正しく割り当てられている（ステップ 1.7〜1.10で説明）。ここをクリックして拡大画像を表示。

カメラ制御とキャリブレーション設定を示す水生動物行動トラッキングソフトウェアのインターフェース。
図5. コンテナ情報の収集。 選択すべき6つの点の順序（マウスの右クリックによる）が示されている。線は自動的に描画される。なお、ここに示されている番号は画面上には表示されない。完了後、「Collect container info」を押す（ステップ1.12に記載）。こちらをクリックして拡大画像を表示。

流体力学実験の図；流体力学および浮力タンクのセットアップ；注釈付きコンポーネント。
図 6. 体積の収集。 水域の角を示す指定の箇所をマウスで右クリックします。まず正面図で角を指定し、次に平面図で指定します。その後、次の角（1～8）へと進みます。これら8つの点はタンクではなく、水域の輪郭を示すものであることに注意してください。また、右クリックしたときには「x0」のみが表示され、次の箇所をクリックすると再び消えるため、数値の1～8は実際には画面上に表示されないことに注意してください。手順の詳細はステップ1.17に記載されています。ここをクリックして拡大画像を表示。

カメラ制御を備えた水棲動物の行動追跡セットアップ。水槽内での動物の動きをモニタリングしている。
図 7. 補正前のコントラスト。画像が露出オーバーであり、魚と背景のコントラスト（特に正面図において）が低い。ここをクリックして拡大画像を表示。

静的平衡研究に使用された魚の水中セットアップ；流体力学の実験。

図8. コントラスト補正。図7と比較してコントラストが改善されている。なお、画面上の色は擬似色であることに留意すること。ここをクリックして拡大画像を表示。

Bumblebee2 BB2-03S2Cのカメラ設定インターフェース。輝度、露光量、彩度の調整が表示されている。
図9. 一般設定。メインメニューで「Camera control」を選択すると、「General Settings」ウィンドウが開きます。「Shutter」と「Gain」のチェックボックスを外し、スライダーを使用して、魚と背景の最適なコントラストを調整します。ここをクリックして拡大画像を表示。

カメラのホワイトバランス調整GUI。赤/青のスライダー。画像処理の最適化。
図10. 色設定。「White Balance/Color」ウィンドウで「Auto」ボックスの選択を解除し、「Red」と「Blue」のスライダーを使用して、魚と背景のコントラストを最適にする組み合わせを決定する。パラメーター。Trajectory Moduleを開いた後、「Data location」で実験ファイルを選択し、「System Setup」から「Parameters」ウィンドウを開く。ここでは、パラメーターに適切な初期値が割り当てられている。ここをクリックして拡大画像を表示。

水生動物行動トラッキングソフトウェアのインターフェース、キャリブレーションパラメータ、ビデオ解析設定。
Figure 11. パラメータ。 Trajectory Moduleを開いた後、「Data location」で実験ファイルを選択し、「System Setup」から「Parameters」ウィンドウを開きます。ここでは、パラメータに推奨される初期値を割り当てています。 .ここをクリックして拡大画像を表示。

水生行動追跡セットアップ、3Dシステムキャリブレーション、ソフトウェアインターフェース、軌跡解析。
図12. ボックスの配置。平面図（top view）と正面図（front view）の赤いボックスが、魚が存在する可能性のある領域を定義している点に注目してください。左側のボックスは、この領域を検索対象から除外するために線まで縮小されています。ここをクリックして拡大画像を表示。

行動分析のためのキャリブレーションとモニタリング設定を示す水生動物トラッキングソフトウェアのインターフェース。

図13. タグの割り当て。「Start generating trajectories」ボタンを押し、開始フレーム（通常はフレーム#0）を選択すると、「Tag assignments」ウィンドウが開きます。「Step forward」を押し、タグ（'X0'）が画面に表示されるまで進めます。タグが魚の画像上に配置されていない場合は、「No」を押し、正しく配置されるまで調整します。その後、「Go」を押します。ここをクリックして拡大画像を表示。

力ベクトルと応力集中を示す動的解析図。コンポーネントA、Bのラベル付き。
図 14. 情報画面。パネル(A)は、正しいタグ割り当てを示している。タグ（'X0'）が両方のビューの魚の画像上に配置されている。通常、タグには線が通過する。パネル(B)は、過剰なノイズとタグ割り当てがない状態を示している。これらのフレームは、ステップ 2.2 における色とサイズのしきい値を、それぞれ 1,000-50 および 10-5 に変更することで、同一の記録から取得した。ここをクリックして拡大画像を表示。

3D軌跡解析。デカルト座標系における粒子の動きを示すベクトル図。
図15. 再構築された経路の3次元表現。方向を明確にするため、矢印の起点は水槽の左前角に配置されています（図1も参照）。したがって、この例では、魚は（カメラに対して）左側の壁の近くに留まっています。ここをクリックして拡大画像を表示。

軌跡平滑化のパラメータ設定ウィンドウ。フィルター設定：ノイズ閾値、ウィンドウサイズ。
図16. 軌跡の平滑化。このウィンドウは、「Trajectory smoothing」ボタンを押すと開きます。ここでは、「OK」を押してデフォルト値で確定させてください。こちらをクリックして拡大画像を表示。

"fish1" フォルダから "Trajectories" サブフォルダへのデータ転送を示すファイル構成図。
図 17. サブフォルダ。 録画中に生成されたフォルダを上に示す。パス再構成後、ここには指定された6つのサブフォルダが含まれる。 ここをクリックして拡大画像を表示。

統計解析用のテキスト形式の数値データ。
図 18. 平滑化済みファイル。例としてpoint.smoothed-fileの上部を示しており、フレーム数、録画時間（min単位）、カメラに対する水体の中心座標、および各フレームにおける座標と時間が記載されている。ここをクリックして大きな画像を表示。

軌道データの解析用データ処理ソフトウェアインターフェース。プロジェクト設定とグループ割り当て。
図19. データ処理。解析するファイルの選択（右側のウィンドウ）。こちらをクリックして拡大画像を表示。

軌跡評価のためのフリージング解析設定を表示するABMT 3Dデータ処理インターフェース。
図 20. 解析例。関心のあるエンドポイントは、メニューから選択することで算出できます。この例では「Duration Freezing」を選択しました。プログラムは、フリージングを定義する速度と時間の閾値を入力するよう求めます。結果は、記録の総時間に占める割合（%）で表示されます。ここをクリックして拡大画像を表示。

運動解析図。対照群およびMK-801投与マウスの時間経過に伴う追跡経路。
図21. 代表的な軌跡。 10:30から開始した午前セッション（上段）および14:00から開始した午後セッション（下段）における、対照群のゼブラフィッシュ2匹と10 µM MK-801を投与したゼブラフィッシュ2匹の代表的な軌跡を示す。各4匹のグループにおける個々のゼブラフィッシュの軌跡は、異なる色で表示されている。ただし、タグの入れ替わりが発生した可能性があることに留意すること。個々のラインを追跡することが不可欠な場合は、手動での修正が必要である。描写された容器の左手前側（挿入矢印の起点）は、カメラに最も近い側である（タンクの配置については図1を参照）。ここをクリックして拡大画像を表示。

社会的距離の解析。グラフ。コントロール群とMK-801の効果。セッション結果の比較。時系列。
図 22. 魚類間の平均社会的距離。A) コントロール群のゼブラフィッシュと10 µM MK-801を投与したゼブラフィッシュの平均社会的距離を、午前および午後のセッションについて示す。平均値とS.E.M.を示す。***, p<0.001。B) 両群における個体間平均距離のタイムラインを示す。ここをクリックして拡大画像を表示。

深度分析；多変量グラフ；コントロール群とMK-801群の比較；深度レベルに対する時間の割合。
図 23. 深度分布。A) 午前中のセッションにおける、10等分した深度レベル（レベル1を底面に最も近いレベルとする）におけるゼブラフィッシュの分布。B) 午後のセッションにおけるゼブラフィッシュの分布。平均値とS.E.M.を示す。*, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001。ここをクリックして拡大画像を表示。

Radial zone and quadrant time proportion graph; data analysis; psychological experiment results.
図24. 水平分布。 (A実験群における4つの放射状ゾーンの経時的分布を示す。挿入図は、中心部から周辺部に向かって、中心ゾーン、中間ゾーン、外縁ゾーン、および複合コーナーゾーンという各ゾーンの位置を示している。B実験群における4つのクアドラント（四分面）の経時的な分布を示す。挿入図はクアドラントの位置を示している。二重線で示された壁は白い壁を表し、一重線で示された壁は透明な壁を表す。カメラは挿入図の左側に配置されている。 すなわち第1および第4象限に最も近い（～も参照 図1）。平均値および標準誤差（S.E.M.）を示す。黒のアスタリスクは午前セッションの群間比較を、灰色のアスタリスクは午後セッションの群間比較を示す：*、p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. 拡大画像はこちらをクリックしてください.

静止平衡グラフ。移動距離対座標。コントロール群対MK-801群。データ解析。
図25. 移動距離。午前および午後のセッションにおけるゼブラフィッシュの移動距離のxyz成分を示す。平均値およびS.E.M.を表示している。黒いアスタリスクは午前セッションの群間比較を、灰色のアスタリスクは午後セッションの群間比較を示す：*, p<0.0125; ***, p<0.001。ここをクリックして拡大画像を表示。

ディスカッション

ここに示す実験手順では、個々のゼブラフィッシュ、ゼブラフィッシュのペア(例えば、 交尾や攻撃性を研究するため)、およびゼブラフィッシュの群れ(代表的な例に示すように)を記録することができます。このシステムは、3D(垂直方向と水平方向)の分布、運動学的特性(速度、加速度、旋回角など)、社会的パラメータ(社会的結束など )に関する情報を同時に取得するのに特に適しています。以下では、実験を計画する際に考慮すべき重要な問題をいくつか挙げます。

実験手順に応じて、さまざまな行動システムを研究できます。たとえば、ネオフォビア(つまり、新しい環境への恐怖)を調査するには、ゼブラフィッシュを観察水槽に導入した直後に(水が落ち着いてノイズを減少させるまで数秒間待った後)、事前の慣れなしに記録を開始する必要があります11,17,37。一方、一部の研究テーマでは、たとえばアラームフェロモンの効果を研究する場合など、ゼブラフィッシュが十分に慣れている必要がある場合があります16。ゼブラフィッシュのグループを研究する場合、実験者は、ソフトウェアがタグの切り替えを最小限に抑えますが、現時点では個々のゼブラフィッシュを追跡することは不可能であることに注意する必要があります。これは、社会的結束に重点が置かれている浅瀬研究にとっても重要ではありませんが、攻撃性や交尾を探求する際には重要です。タグの手動再割り当てはオプションですが、非常に時間がかかる場合があります。

観察容器と観察室の壁の色は、ゼブラフィッシュの行動に大きな影響を与える可能性があります。たとえば、白い壁は嫌悪反応を誘発することが説明されています36、37。異なる色を試すときは、次の 2 つの点に留意してください: 1) 前面の壁 (つまり、カメラに最も近い壁) が透明なままであることと、蓋 (使用されている場合) も透明でなければならないことが重要です。2)これまで使用したことのない色を選択する場合は、まずゼブラフィッシュと背景のコントラストが記録に適しているかどうかを判断します。テスト実行を行います。録画用のカメラ設定(手順2.5および2.6で説明したようにゲイン、シャッター、赤、青)と軌道再構成の設定(手順3.3、3.5、3.11、3.12で説明した色とサイズのしきい値など)を変更すると、大きな違いが生まれます。繰り返しになりますが、システムの経験は、何が可能かを決定するのに大いに役立ちます。

実験の目的によっては、特性(スペクトル、強度など)の異なる光源が望ましい場合があります。LEDバーは簡単に交換できます。光が容器のあらゆる部分に届くようにしてください。

実験でゼブラフィッシュを観察容器に数時間留まらせる必要がある場合は、必ずエアレーションを行ってください。エアチューブはクリップを使用して右奥隅に取り付けることができます。クリップが録画の妨げにならない か、つまり、コンピューター画面で確認してください。ゼブラフィッシュは決して視界から隠されていないこと。 図2A と 図2B では、黒いクリップが上面図に見られます。理想的には、ノイズを防ぐために、レコーディングの前またはレコーディングの間にエアレーションを行う必要がありますが、レコーディング中は使用しないでください。また、強い通気のオン/オフを切り替えると、ゼブラフィッシュが驚く可能性があることに注意してください。

実験でゼブラフィッシュを容器の中に一晩保管する必要がある場合は、ゼブラフィッシュが飛び出すのを防ぐために、観察室を透明な蓋で覆うと便利です(これは非常に一般的なことです)。撮影前にカバーを外さない場合は(ゼブラフィッシュの邪魔をしないように)、次の2つの点を考慮してください:1)光源の鏡像が撮影を妨げないようにしてください(たとえば、 光源をずらしたり、光を最小限にしか反射しない蓋を選択したりします)。2)特にこの場合、通気も行う必要があるため、一晩使用すると蓋が曇る可能性があることに注意してください。これを減らす1つの方法は、小さな穴の開いた蓋を選ぶことです。

一部の実験では、薬物を投与する前にゼブラフィッシュのベースライン行動を決定することが不可欠かもしれません。この場合、薬物はチューブ(上記の曝気チューブと同様)を介してセッション間に追加できます。

ここではゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)の記録に重点が置かれていましたが、もちろん他の魚種もこのシステムで記録できます。これは、(幼魚)金魚(Carassius auratus)、トラバーブ(Barbus tetrazona)、およびアオソードテール(Xiphophorus helleri)の行動を研究するために使用されています。

最後に、観測タンクの他の寸法は主に可能であることに注意する必要があります。ただし、はるかに大きな観測コンテナを使用する場合は、システムを再構成し、空間分解能と時間分解能の適切なバランスを見つける必要があります。さらに、容器の形状は直方体でなければなりません。ゼブラフィッシュまたは他の実験対象の数は理論的には無制限です。ただし、タグの入れ替わりは被験者の数とともに増加します。

開示事項

Hans Maaswinkel、Liqun Zhu、Wei Weng は、この記事で使用する追跡システムを製造している xyZfish、Ronkonkoma NY の従業員です。

謝辞

著者には謝辞がありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AABT-3DトラッキングハードウェアxyZfishAABT IIカメラ、ビデオカード、ミラーと照明付き観察コンパートメントが含まれています
AABT-3Dキャリブレーション機器xyZfishキャリブレーションとサイドミラーが含まれています
AABT-3D観察コンテナxyZfishキューブ 
AABT-3DトラッキングソフトxyZfishv.1.0 
コンピュータオプションN/AWindows XP 以降
(+)-MK-801 マレイン酸水素ΣM107 
エアポンプFusion500 
エアラインチューブ3/16インチリー水族館およびペット用品14508 
ミディアムバインダークリップOfficeDepot561339観測コンテナに航空会社を取り付けるには
パネル

参考文献

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