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方法論記事

脂肪組織の免疫細胞の単離

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DOI:

10.3791/50707

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2013年5月22日

 ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine

この記事について

サマリー

脂肪組織（AT）が激しい免疫細胞の活性化および相互作用の部位である。免疫系のほぼ全ての細胞は、ATに存在し、それらの比は肥満によって変更される。免疫細胞集団ATの適切な分離、定量化、および特性はimmunometabolic病気で自分の役割を理解するために重要である。

要約

肥満の齧歯類およびヒトの脂肪組織の増加マクロファージ浸潤（AT）の発見は、局所および全身インスリン抵抗性免疫細胞の寄与の関心の増大につながっている。リーンと肥満のさまざまな免疫細胞集団の単離と定量AT今immunometabolismの研究室で一般的に利用技術です。まだ細心の注意を得られたデータは、信頼性と解釈可能であるように間質血管細胞の分離やフローサイトメトリー分析の両方に注意しなければならない。このビデオでは、ダイジェストをミンチし、免疫細胞に富む間質血管の一部を分離する方法を示します。その後、我々は、抗体ラベルマクロファージとTリンパ球と方法、フローサイトメトリー実験でそれらに適切にゲートにする方法を示しています。低脂肪で育てリーン及び高脂肪給餌肥満マウスからの代表的フローサイトメトリープロットが設けられている。この分析の重要な要素は、何の抗体を使用することであるマクロファージで自然自家蛍光であるチャンネルだけでなく、適切な補償コントロールの使用で蛍光を発するではない。

概要

歴史的には、脂肪組織（AT）は、エネルギーバランスに応じて伸縮する脂質貯蔵、不活性器官として見てきた。我々は今、ATが積極的に直接摂食行動と全身のグルコース恒常性に影響を与えるホルモンの数を分泌する動的な内分泌器官を表していることを理解しています。また、過去十年間の間質血管画分（SVF）と同様に、ATホメオスタシスへの貢献ATに存在する免疫細胞の多数の人口の増加感謝があった。

差動遠心し脂肪細胞とコラゲナーゼダイジェストを使用してSVF AT分離する能力は、最初1964年1 Rodbellによって記述されていた。コラゲナーゼIIは、ほとんどの場合、脂肪細胞のインスリン受容体1のメンテナンスのため、脂肪細胞とSVF分離のために使用される。 ATの早い段階で、酵素分画は主に脂肪を研究するために採用されました代謝をcyteと脂肪前駆細胞を分離する。最近になって、フローサイトメーターの普及状況と市販のフルオロフォア標識抗体の増え続けると組み合わせこの技術は、免疫細胞ATの特徴付けを容易にしている。

AT炎症における免疫細胞の存在は以前に2に記載されていたが、ワイズバーグらによる精液の論文。とXu ら 。 2003年に出版さは、炎症性サイトカインを分泌し、AT-特定および全身インスリン抵抗3,4と相関肥満におけるマクロファージ（ATMの）、ATの蓄積を文書化することが最初でした。これらの観察結果は、調査の新たな分野の基礎は最近、 "immunometabolism、" 5造語を務め、樹状細胞6、肥満細胞7、T細胞8を含む様々な免疫細胞集団を、関与研究によってフォローアップされています-10、Bセル11、NKT細胞12、好酸球13、および肥満関連したインスリン抵抗性の発達中の好中球14,15。

この記事の目的は、SVF ATの細胞を単離するATMなどの特性を、フローサイトメトリーを介してT細胞ATするために使用されるコラゲナーゼ消化技術の詳細な説明を提供することである。このプロトコルは、ATマウスに最適化されていますが、視聴者は16で、人間のために、この手法の最適化に関する広範な詳細を提供する優れた記事を読んでから利益を得ることができる。この記事の対象読者は、限られた経験を持つ研究者でマウスを操作すると、フローサイトメトリーを実行を含む。時間とリソースを持つ細胞の収量と生存能力のバランスをとるためのいくつかの実用的な考慮事項は、免疫細胞集団AT特徴付けるためだけでなく、最適なフローサイトメトリーコントロールとして提示される。我々のプロトコルに加えて、読者は言及せている適切なコントロールと補償17を含むように、フローサイトメトリーの技術的な側面のいくつかの優れた議論のためのBasuさんらによる最近のJoveの記事への ED。

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プロトコル

1。試薬および消耗品

前にこの実験プロトコルを開始するには、次の試薬を準備します。

  1. 70％エタノール
  2. 1X PBS
  3. 1X DPBSは（CaおよびMgを含まない）0.5％BSAを補っ
  4. FACSバッファー：1X DPBS（CaおよびMgを含まない）、2mMのEDTA、および1％FCS
  5. ACK緩衝液：150mMのNH 4 Clを、10mMのKHCO 3、および水中0.1 mMの硫酸ナトリウムEDTA

2。脂肪組織の収穫と準備

  1. 各機関に固有のIACUC承認された手順に従って、マウスを安楽死させる。
  2. 徹底的に70％エタノールで毛皮が濡れ。
  3. 剣状突起のレベル（胸骨の下の部分）に切開を行い、心臓を露出する胸腔を開いて、すべての主要な血管を切断しないように注意しながら。

注：この時点で、それはできるだけ絞りをそのままにしておくことも有用である可能と血液を可能にし、胸腔から流出する潅流液に胸郭の右側のノッチをカットする。

  1. 血を許可し、循環系をエスケープする潅流液に右心房をクリップ。

注意：AT肥満マウス、過剰心を扱うときは、心臓へのアクセスを許可するために除去する必要があるかもしれません。

  1. 鉗子で心をつかみ、静かに頂点を通して左心室に針を挿入します。ゆっくり15ミリリットル滅菌PBSでマウスを灌流。

注意：肺は記入して拡大し始めたら灌流率を減らします。

  1. 腹膜腔を開き、任意の性腺組織を避けるように注意して使用してperigonadal脂肪パッドを取り外します。
  2. の脂肪パッドを置きますと、0.5％BSAを補充し2ミリリットル1X DPBSをマグネシウム（Mg又はCaなし）を含む氷の上にボートを比較検討し、細かい部分にATをミンチ。

注：ATあたりの量を制限し、1.2 gのボートを量る。 AT量が1.2 gを超える場合、2つの計量船との間に均等に分割する。

  1. 氷の上にサンプルAT維持し、0.5％BSA、10mMの塩化カルシウム、及び4 mg / mlのコラゲナーゼ、II型で補充1X DPBSから成るサンプルAT当たり3ミリリットルコラゲナーゼ消化液を調製。

3。コラゲナーゼ消化

  1. ホモジネートを注ぐと、1mlのDPBS（0.5％BSA）と3ミリリットルコラゲナーゼII消化液でボートを量るすすぐことによって、少なくとも50 mlコニカルチューブに移します。
  2. 20分間で37回転シェーカー（200 rpm）で°Cでホモジネートでインキュベートする。
  3. コニカルチューブや氷​​の上の場所に10ミリリットルのDPBSを（0.5％BSA）を追加します。
  4. 10ミリリットル血清ピペットを用いて何度もホモジネート摩砕し、新しい50 mlコニカルチューブに100μmのフィルターを介して細胞懸濁液を渡す。
  5. 4＆Dで10分間500×gで細胞懸濁液を遠心例えば、C.
  6. 混入赤血球を溶解する3ミリリットルACKバッファー内の上清をデカントし、再懸SVF細胞ペレット。
  7. 4℃で10分間500×gで、12ミリリットルのFACS緩衝液および遠心細胞懸濁​​液を追加℃で
  8. 上清をデカントし、FACSバッファーで再懸SVF細胞ペレット。

注：細胞ペレットを50 mlコニカルチューブの底をカバーする場合、0.5〜1ミリリットルFACS緩衝液を使用するインチ再懸濁するためにどのくらいのFACS緩衝のためのガイドとして細胞ペレットのサイズを使用し、それ以外の場合、0.25から0.5に再懸濁ミリリットル。

  1. 場所氷上でサンプルと混合40μlのFACS緩衝液、50μlのトリパンブルー溶液（0.2％）、および10μlの細胞懸濁液で細胞計数のために、各サンプルの10倍希釈のアリコートを準備します。
  2. トリパンブルー排除に基づく生細胞をカウントし、5〜10×10 6細胞/ mlの最終濃度に細胞懸濁液を希釈。

4。細胞表面抗原の染色

  1. 0.5-1μg/106細胞の最終濃度に抗マウスCD16/CD32抗体（FCブロック）を追加し、10分間、氷上でインキュベートする。
  2. 12×75ミリメートルポリスチレン丸底チューブへの転送サンプル（≥10 6細胞）。 ATMやT細胞を分析する場合、別々のチューブを用意し、必要な補償と修正蛍光マイナス1（FMO）コントロールに対応するために、チューブの適切な数を準備するために余分なセルを結合します。

注：例として、F4/80とCD11bをに基づいてATMの割合を定量するとき、次の補償およびFMOコントロールが準備する必要があります。

- 染色（細胞）

- DAPIまたはヨウ化プロピジウム（PI）は、単一の染色（細胞;ステップ5.1まで生存染料を追加しないでください）

- F4/80 APC単染色（細胞や補償ビーズ）

- CD11bをFITC（シミ単一細胞または補償ビーズ）

- FMO 1（セル）：ラットIgG2aのκアイソタイプ対照APC + CD11bをFITC +生存色素（ステップ5.1で追加された）

- FMO 2（セル）：F4/80 APC +ラットIgG2bでκアイソタイプ対照FITC +生存色素（ステップ5.1で追加された）

  1. （ 試薬および材料の表を参照）は、適切な濃度で蛍光団標識1次抗体および/ ​​またはアイソタイプコントロールを追加します。
  2. 30分間4℃で光とインキュベートからサンプルを保護します。
  3. 4℃で5分間500×gで2 mlのFACS緩衝液および遠心細胞懸濁​​液を追加℃で
  4. 2ミリリットルFACS緩衝液で上清をデカントし、再懸SVF細胞ペレット。
  5. ≥400μlのFACS緩衝液で5 4℃分、再懸濁しSVF細胞ペレット用に細胞懸濁液を500×gで遠心します。
  6. 35μmのセルストレーナーチューブトップを装備し12×75ミリメートルポリスチレン丸底チューブにサンプルを転送します。
  7. 4で光、店舗サンプルから守る°CをFACS分析まで。

注：最適な結果を得るために細胞をimmeadiately分析する必要があるが、このプロトコルとFACS解析に成功し、4℃で1-2時間、FACSバッファーに格納された標識された細胞上で実施されている細胞は蓄積時間を増加させるために修正する必要がある場合は、標識した細胞をFACS分析の前に24時間、4℃で2％パラホルムアルデヒド°Cで固定することができる。抗体会社は、標識した細胞を1週間に戻る保存することができることを示唆しているが、これは、この手順のコンテキスト内でテストされていません。

5。 FACS分析

  1. FACS分析に先立ち、生/死細胞の区別を可能にするために、サンプルと適切なコントロールに生存染料を追加します。

注：多数の生存色素は市販されているが、DAPIやPIは励起/発光教授に応じて推奨されている使用されるフ​​ルオロフォア標識抗体の諸島。 DAPIおよびヨウ化プロピジウムは、0.2 mg / mlの最終濃度を各サンプルに添加する。

  1. 関心のある細胞集団（s）がスケールであるように側方散乱（SSC）及び前方散乱（FSC）を調整するために、実験試料と同じ組織から単離された染色陰性対照試料、好ましくはセルを使用。

注：SVF細胞ATの分析のために、SSCはリニアスケールでFSC対ログスケールで表示されることをお勧めします。しばしば非常に大きく、粒状であるATMのを分析する際にSSCのログ·スケールを使用することは特に重要です。

  1. 分析される細胞の種類（複数可）に基づいて初期散乱光ゲートを描き、染色細胞が遠く（約10 2を中心とする）は、単一のパラメータヒストグラムの左端になるように光電子増倍管（PMT）のゲインを調整する適切なチャネルのために。

注：これは、リンパ球やマクロファージ（または他の骨髄細胞）により、自家蛍光の違いに別々に分析することをお勧めします。

  1. マルチカラー補正を実行するために、単一の染色されたコントロールや抗体捕捉補償ビーズを使用してください。

注：補償ビーズの使用が推奨されますが、各抗体の互換性が確保されなければならない。例えば、補償ビーズが単離された細胞は、適切な単一シミ制御を得るために必要とされる場合には、ウサギ抗体と交差反応しないかもしれない。

  1. 修正されたFMOコントロールに基づく実験的ゲートを設定します。
  2. 関心のある集団の有病率に基づいてイベントの適切​​な数を収集し、実験データを記録するためにフローサイトメトリーを設定する。
  3. オフライン分析用にエクスポートFCSデータファイル。フローcytometrための利用できる多数のプログラムがありますyのデータ解析。我々はCytobank、investigatoresを格納し、分析データを、インターネット回線18を持つ任意のコンピューターからの数字を生成することができ、Webベースのプラットフォームをお勧めします。さらに、Cytobankがアクセス可能なデータを公開するか、協力者へのアクセスを制限する機能を提供しています。

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結果

差動遠心分離し、ATのコラゲナーゼ消化は、低脂肪（脂肪から10％キロカロリー）または高脂肪（脂肪から60％キロカロリー）食（LFDとHFDを与えた雄のC57BL/6Jマウスの精巣上体脂肪パッドからSVFを分離するために使用されました、それぞれ）16週間。 SVFの細胞は、その後、FACS解析により、生のATM（ 図1）およびT細胞（ 図2）AT割合を定量化するためにフルオロフォア標識1次抗体で標識した。光散乱、ダブレット差別、および生存ゲート含む初期ゲーティングは、 図1Aおよび2Aに示されている。なお、 図2Aの最初の散乱光ゲートが自家蛍光骨髄細胞を含むことを避けるためにリンパ球集団に限定されていることを強調すべきである。実験のゲートを設定するように変更さFMOコントロールの使用例を、図1Bに示されている。この例では、F4/80（左欄）及びCD11bを（ 右欄 ）抗体が自家蛍光と非特異的結合を考慮して...

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ディスカッション

肥満の代謝結果における免疫系の役割への関心の高まりは、ATの免疫細胞を特徴付けるためにフローサイトメトリーの普及につながっている。正確なプロトコルは、独自の経験や利用可能な装置に基づいて研究室の間で異なりますが、重要なステップは、コラゲナーゼ消化、差遠心分離し、細胞表面抗原のラベルが含まれています。本記事の目的は、ATおよび/またはフローサイトメトリーを行うことで作業限られた経験のある研究者にSVF ATの単離のための詳細なプロトコルと実用的なガイドを提供することである。

任意の実験技術と同様に、または大幅に望ましい結果に影響を与えるかもしれません、多数のバリエーションがあります。我々の経験に基づいて、本明細書の詳細なプロトコルは、時間、リソース、細胞の収率、及び細胞生存率との間の最も効率的なトレードオフを表す。例えば、私たちはその増加を発見したコラゲナーゼ同様の濃度でコラゲナーゼII消化の期間に限り60分、セルラー収率にほとんど影響を与え、したがって、我々は、コラゲナーゼ露光の長さを減少させるために20分間消化を利用する。コラゲナーゼIIは、脂肪組織消化のために最も一般的に使用さ...

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開示事項

我々は、開示することは何もありません。

謝辞

JSOはNIHルースL.キルシュNRSA（F32 DK091040）によってサポートされて、AKは米国糖尿病協会（7-10-MI-05）からのポストドクトラルフェローシップによってサポートされており、AHHは、米国心臓協会設立研究者賞によってサポートされています（12EIA8270000）。フローサイトメトリー実験は、リソース共有VMCフローサイトメトリーで行った。 VMCフローサイトメトリーの共有リソースがバンダービルト消化器病研究センター（DK058404）によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DPBS(CaまたはMgなし) 10 x 500 mlLife Technologies14190-250
DAPILife TechnologiesD3571
BSASigmaA2153-100G
コラゲナーゼSigmaC6885-5G
ヨウ化プロピジウム溶液SigmaP4864-10 ml
安定スタック 20マイクロリットルレイニンSS-L10
20 マイクロリットル フィルターチップレイニンSRL10F
安定スタック 250 マイクロリットルチップレイニンSS-L250
1000 マイクロリットルチップレイニンGPS-L1000
1000 マイクロリットルフィルターチップレイニンGP-L1000F
250 マイクロリットルフィルターチップレイニンSR-L200F
FC ブロックBDバイオサイエンス553142
フィッシャー100mnストレーナーフィッシャーブランド22-363-549
中型計量皿フィッシャーブランド02-202B
アルミホイルフィッシャーブランド1213100
ミンチはさみフィッシャーブランド089531B
ボルテックスフィッシャーブランド2215365
50 mlコニカルチューブBD Falcon14-959-49A
フィルタートップ FACSチューブBD Falcon352235
10 mlピペットケース 200BD Falcon1367520
丸底チューブBD Falcon352058
5 mlシリンジBD Falcon309646
VボトムプレートCostar07-200-107
移送用バルブピペットThermo Scientific13-711-22
ShakerThermo Scientific11 676 071
粘着マットThermo Scientific1368750
細胞培養 遠心分離機Sorvall75253839
アダプターSorvall75003723
ラット 抗マウス CD16/CD32BD Biosciences553142濃度:0.5 - 1 μg/ 106細胞
ラット抗マウス F4/80eBioscience17-4801蛍光色素複合体: APC
濃度: 0.2 μg/ 106細胞
アイソタイプコントロールカタログ番号:17-4321
ラット抗マウスCD11beBioscience11-0112蛍光色素複合体:FITC
濃度:0.5 μg/ 106 細胞
アイソタイプコントロールカタログ番号: 11/1/4031
アルメニアハムスター抗マウス CD11ceBioscience12-0114蛍光色素複合体: PE
濃度: 0.8 μg/ 106細胞
アイソタイプコントロールカタログ番号:Dec-88
ヤギ抗マウスMGL1/2R&D SystemsFAB4297PFluorophore コンジュゲート: PE
濃度: 0.1 μg/ 106細胞
アイソタイプコントロールカタログ番号:IC108P
ヤギ抗マウス CD206R&D SystemsFAB2535PFluorophore コンジュゲート: PE
濃度: 0.1 μg/ 106細胞
アイソタイプコントロールカタログ番号:IC108P
ラット抗マウスCCR2R&D SystemsFAB5538PFluorophore コンジュゲート: PE
濃度: 0.1 μg / 106細胞
アイソタイプ制御カタログ番号:IC013P
アルメニアハムスター抗マウスTCRβBD Biosciences553174蛍光色素複合体: APC
濃度: 0.2 μg/ 106細胞
アイソタイプコントロールカタログ番号:553956
ラット抗マウス CD8aBD Biosciences552877蛍光色素複合体:PE-Cy7
濃度:0.8 μg/ 106細胞
アイソタイプコントロールカタログ番号:552784
ラット抗マウスCD4BD Biosciences557956蛍光色素複合体:Alexa Fluor 700
濃度:0.2 μg/ 106 細胞
アイソタイプ制御カタログ番号: 557963

表 1.材料・試薬一覧.

参考文献

  1. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
  2. Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
  3. Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
  4. Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
  5. Mathis, D., Shoelson, S. E. Immunometabolism: an emerging frontier. Nature Reviews. Immunology. 11, 81(2011).
  6. Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
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  9. Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
  10. Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
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  14. Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
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  19. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
  20. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).

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