アストロサイトトランスポーター電流のデコンボリューション解析グルタミン酸クリアランスの時間経過の導出

Summary

私たちは、アストロサイトにおけるグルタミン酸トランスポーター電流の電気生理学的記録から、アストロサイトの膜にグルタミン酸の寿命を推定するための分析方法について説明します。

Abstract

脳内のグルタミン酸トランスポーターの最高密度はアストロサイトに含まれています。グルタミン酸トランスポーターのカップル3のNa ⁺と1 Hの共同輸送⁺と1のK ⁺の逆輸送と膜を横切ってグルタミン酸の動き。輸送プロセスによって生成された化学量論的な電流は、星状細胞からの全細胞パッチクランプ記録を監視することができる。記録された電流の時間経過は、星状細胞がさらされるグルタミン酸濃度プロファイル、グルタミン酸輸送体の速度論、及び星状膠細胞膜の受動的電気緊張特性の経時変化によって成形される。ここでは、アストロサイトにおけるグルタミン酸トランスポーター電流を記録し、アストロサイトトランス電流の波形を整形する他のすべての要素からグルタミン酸クリアランスの経時変化を単離することができる実験·分析方法が記載されている。ここで説明する方法は、寿命、oを推定することができるfの健康と病気の間に、中枢神経系の任意の領域におけるアストロサイトの膜にグルタミン酸フラッシュuncagedとシナプスリリース。

Introduction

アストロサイトは、星型の形態と神経網全体に拡張し、隣接したシナプスの接点^1,2達する細かい膜突起と脳の中で最も豊富な種類の細胞の一つである。アストロ'細胞膜が密グルタミン酸トランスポーター分子³が満載されています。生理学的条件下で、グルタミン酸輸送体は急速に膜の細胞側にグルタミン酸を結合し、細胞の細胞質に転送する。そうすることによって、輸送体は、細胞外空間⁴におけるグルタミン酸の低い基底濃度を維持する。シナプスの興奮に隣接細かいアストロサイトのプロセスにおけるグルタミン酸トランスポーターは、理想的に、それが離れてシナプス間隙から拡散するようにシナプスのイベントの際に放出グルタミン酸をバインドするために配置されている。そうすることにより、輸送体はまた興奮性信号の空間的な広がりを低減し、周囲と余分シナプス地域に向けて、隣接するシナプスへのグルタミン酸スピルオーバー制限^5-7脳内の。

グルタミン酸輸送は、化学量論的に3のNa ⁺と1 H ⁺彼らの電気化学的勾配に沿って1の逆輸送への動きK ^{+ 8}に結合された起電プロセスです。 （チオシアン酸）> NO ₃ ^{- - （}硝酸塩）≈のClO ₄ ^{- （}過塩素酸）> I ^-....

Protocol

1。スライス標本

1. 119のNaCl、2.5 KClを、0.5のCaCl _2、1.3硫酸マグネシウム_{4·7H 2} O、4のMgCl _2、26.2のNaHCO _3、1のNaH ₂ PO _4、および22グルコース、320：含む/ストレージソリューション（単位：mm）スライス500ミリリットルを準備mOsm、pHは7.4
2. 200ミリリットルの溶液をスライス/ストレージで塗りつぶし、スライス浸水室を調製した250mlビーカーを使用し、34℃の水浴中°C、95％O _{2、5％CO 2}泡に温める。
3. 4でガラス瓶の残りのスライス/ストレージソリューション℃で保つ
4. ビブラトームサンプルホルダーに小さな寒天ブロック（6％、ACSFで準備）を添付して、それは4℃で保存するためにシアノアクリレート系接着剤を使用して、
5. スライスを開始する30分前には、95％O _{2、5％CO 2}と氷とバブルそれを充填したバケツにスライス/貯蔵溶液を含むガラス瓶を置く。

6. ハロタン/イソフルランでマウス（P14-21、C57BL / 6）を麻酔（イソフルランはアストロサイトのグルタミン酸摂取

Results

分析的アプローチの成功は非常に中枢神経系の任意の領域におけるアストロサイトからトランスポーター電流の高品質の電気生理学的記録を取得するに依存し、ここで説明。急性マウス海馬スライスでは、アストロサイトは容易にため、その小さな細胞体（Ø= 10μm）の著名な核（ 図1）のDodt照明や​​IR-DICの下で識別することができます。細胞内液、（ 図1）にアレクサ594（50μM）のような蛍光体を追加するときに、その特徴的な星型の形態は、共焦点落射蛍光、または二光子レーザー走査顕微鏡で理解することができる。電気生理学的レベルでは、星状細胞は、低入力抵抗、過分極膜電位（〜-90 mVの）および活動電位を生成することができないことを特徴とする。アストロサイトは、隣接するニューロンの電気的またはoptogenetic刺激とCAのUV光分解に応じて電流を発生MNI-L-グルタミン酸のようなGED化合物。

星状細胞輸送電流はセシウム⁺またはK ⁺ベースの内部溶液を用いて記録することができる.......

Discussion

ここでは、アストロサイトから電気生理学的記録を取得するための実験的なアプローチ、アストロサイトおよびアストロサイトのトランスポーター電流からグルタミン酸クリアランスの経時変化を導出する数学的方法ではグルタミン酸トランスポーター電流を分離する分析プロトコルを記述します。

分析の成功は、アストロサイトからのトランスと電流を記述するために使用されるフ​​ィッティングアルゴリズムの精度に高品質のパッチクランプ記録を得る能力に依存する。デコンボリューション解析は、以下の2つの仮定に依存している。（1）現在、実験的に記録されたトランスポーターにグルタミン酸クリアランスの経時変化を歪める複数のプロセスを線形システムとして表すことができる。絶対的ではあるが形状トランスポーター電流が非線形システム（原則グルタミン酸結合と輸送の両方が飽和を受けることができる）、実験的証拠インディカであることが要因の多く彼らの線形領域が広いことをTES。したがって、輸送電流のとグルタミン酸クリアランスの時間経過は、刺激の強さ、放出確率、及びグルタミン酸濃度^13,14,18の広い範.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	トクリス	1246
(R,S)-CPP	トクリス	173
DPCPX	トクリス	439
LY341495二ナトリウム塩	トクリス	4062
MSOP	トクリス	803
NBQX 二ナトリウム塩	トクリス	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Picrotoxin	Sigma	P1675
MNI-L-グルタミン酸	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	オプションの
マトリックス電極	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
ホウケイ酸ガラス毛細血管	World Precision Instruments	PG10165-4
デュアルステージガラスマイクロピペットプーラー	Narishige	PC-10
Loctite 404 インスタント接着剤	Ted Pella	46551
Xe lamp	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics