方法論記事

ジェネラリストの腸内で代謝的に活性な細菌の同定ハスモンヨトウリットラリス DNAを安定同位体を経由して使用するプロービング 13 C-グルコース

DOI：

10.3791/50734

⸱

2013年11月13日

 ,  , 
1Department of Bioorganic Chemistry, Max Planck Institute for Chemical Ecology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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ハスモンヨトウのサキシマスオウノキの腸に関連するアクティブ細菌群集は、ピロシーケンスに結合された安定同位体プロービング（SIP）により決定した。この方法論を使用して、コミュニティ内の代謝的に活性な細菌種の同定は、高分解能かつ高精度に行った。

要約

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ほとんどの昆虫の根性が共生非病原性細菌の複雑な共同体が生息している。そのような微生物群集内では、相利共生又は細菌種を同定することができる。後者のものは、特に必須アミノ酸4の合成を含む免疫応答2、フェロモン産3、ならびに栄養を、昇圧、 すなわち昆虫再生1に助け、昆虫に複数の機能を果たすことが観察されている。

により、これらの団体の重要性に、多くの努力が、個々のメンバーにまで社会を特徴づけるために行われてきた。しかしながら、これらの努力のほとんどは、いずれかの栽培方法に基づいて、または最終同定のために配列決定した16S rRNA遺伝子断片の生成に依拠した。残念ながら、これらのアプローチは、腸内に存在する細菌種を特定しないのinformatありません微生物の代謝活性へのイオン。

昆虫の腸内で代謝的に活性な細菌種を特徴づけるために、我々は、ユニバーサル基質として13 C-グルコースを用いたin vivoで （SIP）をプロービング安定同位体を使用した。これは彼らの特定の代謝活性のための微生物系統発生の連結を可能にする有望な文化のない手法である。これは、DNAやRNAなどの微生物のバイオマーカー5の中に基質から安定な同位体標識された炭素原子を追跡することが可能である。 13 Cの取り込みは、非標識（12 C）標識されたものと比較してDNAの濃度を増加させるDNAに同位。最後に、13 C-標識されたDNAまたはRNAは、12 C-標識されていない同様のものを6から密度勾配超遠心分離によって分離される。分離された核酸のアイソトポマーのその後の分析は、分子種の代謝活性とアイデンティティとの間の接続を提供する。

ここでは、ジェネラリスト昆虫（我々のモデル系）、 スポドプテラ·リトラリス （ 鱗翅目、ヤガ科 ）の腸内で代謝活性細菌を特徴づけるために使用されるプロトコルを提示する。 DNAの系統解析は、昆虫の腸内細菌集団の同定を高い分解能と精度を可能にピロシーケンスを使用して行った。メイン基板として、13 C-標識されたグルコースは、実験で使用した。基板は、人工飼料を使用して、昆虫に供給した。

概要

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昆虫、細菌の共生アソシエーションは昆虫種7多数のために知られている。これらの共生協会では、微生物は、昆虫の成長と発展に重要な役割を果たしている。微生物は、必須アミノ酸4の合成、およびホストへアクセスできなく食物の消化を含む昆虫再生1、フェロモン生合成3、栄養に貢献することが示されている。腸の細菌団体の広大な様にもかかわらず、はるかに少ない彼らは昆虫の賛成で遊ぶ機能的役割についてはほとんど知られていない。シロアリのみの場合には、リグノセルロースの共生消化は、原核生物、原生動物、および真菌によって行う、8,9広く研究されている。これとは対照的に、少しはコットンリーフワーム、すなわち 、 ハスモンヨトウのサキシマスオウノキ。また、原因植物宿主の彼らの頻繁なシフトに、一般的なジェネラリスト昆虫の消化管に存在する共生関連についてはほとんど知られていないIST昆虫とその消化管関連細菌群集は永続的にその食性は植物化学物質の過多で植物を消費するにリンクされ、新たな課題にさらされている。この他に、鱗翅目における腸環境は、 それ自体が高いため、腸pH 10の細菌の増殖のための過酷な環境を表す。特にSの場合、 サキシマスオウノキ 、それはカリフォルニア 、前腸内の10.5の範囲である。腸内の9のpH....

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プロトコル

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1。昆虫飼育

  1. ハスモンヨトウの卵のクラッチを購入するか、入手し、独自の飼育からサ ​​キシマスオウノキ 。孵化するまで室温（RT）での滅菌ペトリ皿で​​それらを維持する。
  2. 次のように飼育昆虫人工飼料を準備します。
    1. 100mlの水に一晩500グラムのグランド白い豆を浸す。
    2. H 2 Oを蒸留千ミリリットルに9.0グラムのアスコルビン酸および75グラム寒天を追加し、後でそれを沸かす。
    3. 混合物を冷却するしましょう​​、それを（白いワックス状固体混合物に）固化する際に使用するまで4℃で保管してください。
  3. 照明の16時間と闇の8時間と長日体制の下で23〜25℃で人工飼料に清潔なプラス​​チックの箱とリア、それらを新たに孵化した幼虫を転送します。幼虫はすべて6幼虫齢​​を経るまで、毎日食べ物を変更します。

代謝的に活性な腸細菌におけるDNAの2。13 C標識

  1. 蒸留し、脱イオン水（のddH 2 O）と完全に13 C標識グルコースの186.1ミリグラムを溶解し、SIP実験用人工飼料を100グラムとよく混ぜる。人工飼料に10 mMの最終13 C-グルコース濃度を確認してください。これは

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結果

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昆虫の腸に存在する代謝活性のある細菌の十分なラベリングを実現するために、昆虫は1ラベルのない軽いから簡単にラベルされた重い画分の分離を可能にするのに十分な、以前に最適化された期間、13 Cが豊富な基質にさらされている必要があります。この例では、13 C-グルコースは、1日目（ 図1A）のために10mMの最終濃度で人工飼料に添加した。正常なグルコース（ 図1B）の同量制御昆虫の人工飼料で供給した。前述したように、（より軽いから重い）DNA画分の分離は、プロセス全体の基礎である。したがって、実行される最初のステップは、目的の組織からDNAを抽出であり、この場合には、細菌群集は、昆虫の腸に関連付けられている。その品質を確認するためには、すべての任意のDNAが析から得られたかどうかを判断するために電気泳動ゲルを実行することが重要ですゼット組織。 図1Cには、正のDNA抽出を確認し、画像の上部にあるゲノムDNAの強いバンドが観察される。また、細菌のDNA（ 図1D）の存.......

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ディスカッション

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ほとんどの昆虫の消化管は、豊かで複雑 ​​な微生物群集を保有。通常、10 7 -10 9原核細胞は、ほとんどの場合、宿主自身の細胞をより多かっ、そこに留まる。このように、昆虫の腸は共生27を義務づけるための病因から、微生物関係のさまざまな側面を表現する、多様な微生物活動のための「ホットスポット」である。多くの研究が昆虫の腸の微生物コミュニティの驚くべき多様な説明してきたが、腸内細菌叢の代謝活性の特徴付けは稀である。安定同位体プロービングの方法は、今の栽培とは独立して、さらには生体内での複雑な細菌叢の背景からのアクティブなメンバーと区別するための可能性を提供する。私たちは、昆虫のモデル系、綿の葉のワーム（ スポドプテラリットラリス ）で腸内細菌叢を研究するためにこの貴重なツールを適用した。グルコースはコットンリーフワームの腸内の支配的な糖であるので、このデモでは、我々はLARを与え人工飼料でVAEは、腸内細菌叢に、代謝活性細菌を追跡するために、13 C-グルコースの余分な生理的用量でスパイク。ネイティブグルコースを確.......

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開示事項

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我々は、開示することは何もありません。

謝辞

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私たちは、実験室での支援をアンジェリカベルクに感謝します。この作品は、マックスプランク協会および微生物コミュニケーション（JSMC）のためのイエナ大学によってサポートされ、融資された。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
デュモン#5ミラーフィニッシュ鉗子ファインサイエンスツール11251-23 
バンナススプリングシザーファインサイエンスツール15000-00 
速度真空濃縮器 5301Eppendorf Germany5305 000.304 
プラスチック乳棒Roth GmbH Co.ドイツP986.1 
NanoVue分光光度計GEヘルスケア、英国28-9569-58 
Mastercycler pro/thermocyclerエッペンドルフ ドイツ6321 000.515 
Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis ChamberBiometra販売終了 
超遠心分離機(オプティマL-90K)ベックマンA20684 
超遠心ローター(NVT 90)Beckman362752 
HPLCポンプAgilent1100 
クイックシール、ポリアロマーチューブベックマン342412 
トランスイルミネーター UVstar 15 バイオメトラ 
Carl

参考文献

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  1. Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
  2. Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H.

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タグ

DNA 13C DNA

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