生分解性ポリマーナノ粒子を用いた治療的血管形成のためのプログラミング幹細胞

Summary

我々は、生分解性高分子ナノ粒子を用いて、血管新生のための治療因子を過剰発現するためのプログラミング幹細胞の方法を記載している。記載された方法は、 インビトロで脂肪由来幹細胞をトランスフェクトし、マウス後肢虚血モデルにおける血管新生を促進するためにプログラムされた幹細胞の有効性を検証する、ポリマー合成が挙げられる。

Abstract

制御された血管増殖は、正常組織再生および創傷治癒、ならびに、例えば、脳卒中、心臓発作、または末梢動脈疾患などの虚血性疾患を治療するために重要である。血管新生増殖因子の直接送達は、新たな血管の成長を刺激する潜在能力を有するが、しばしば、標的化および生体内での半減期が短いの欠如などの制限に関連付けられる。遺伝子治療は、血管新生因子をコードする遺伝子を提供することにより、別のアプローチを提供するが、多くの場合、ウイルスを用いる必要があり、安全上の懸念によって制限される。ここでは、生分解性高分子ナノ粒子を用いてin situ での血管新生因子を過剰発現するようにプログラミング幹細胞によって血管成長を刺激するために最近開発された戦略を記載している。具体的には我々の戦略は、 インビボにおける虚血組織に向かって移動する能力を利用することにより、送達ビヒクルとしての幹細胞を利用した。最適化された高分子のベクターを用いて、脂肪由来幹細胞は、血管内皮増殖因子（VEGF）をコードする遺伝子、血管新生を過剰発現するように改変した。我々は、ポリマー合成、ナノ粒子形成、 インビトロで幹細胞をトランスフェクトするだけでなく、マウスの後肢虚血モデルにおける血管新生を促進するVEGFを発現する幹細胞の有効性を検証するための方法のためのプロセスを説明した。

Introduction

この技術の全体的な目標は、虚血の部位で治療因子を過剰発現する非ウイルスプログラムされた幹細胞を用いた治療的血管新生を促進することである。幹細胞は、実験室で合成された生分解性ナノ粒子を用いてex vivoで最初に修飾し、次いで血管形成および組織サルベージを高めるためのその可能性を検証するために、後肢虚血のマウスモデルに移植した。

制御された血管増殖に成功した重要な組織再生の成分、ならびに卒中、四肢虚血、および心筋梗塞のような種々の虚血性疾患を治療するためのものである。いくつかの戦略は、成長因子の送達および細胞ベースの治療を含む血管の成長を促進するために開発されてきた^。1動物疾患モデルにおいて観察された効力にもかかわらず、これらの方法は未だに不十分な成長因子の送達のための超生理学的用量の必要性などの制約に直面し、又はパラクリン細胞のみでリリースする。上記の制限を克服するための1つの潜在的な戦略は、幹細胞療法及び幹細胞が遺伝的に望ましい治療因子を過剰発現するようにex vivoで移植前にプログラムされることにより、遺伝子治療を組み合わせることである。このアプローチは、 等後肢虚血^2、心疾患^3、骨治癒⁴および神経損傷⁵を含む種々の疾患モデルで実証されている。しかし、ほとんどの遺伝子治療技術は、このような潜在的な免疫原性および挿入突然変異のような安全性の懸念に関連しているウイルスベクターに依存している。非ウイルス遺伝子送達媒介される生体材料は、これらの制限を克服するが、多くの場合、低いトランスフェクション効率に悩まされる可能性がある。効率的な非ウイルス性遺伝子送達のための新規な生体材料の発見を加速するために、最近の研究は、コンビナトリアルケミストリーおよびハイスループットスクリーニングアプローチを採用している。このようなポリ（β-アミノESとして生分解性ポリマーのライブラリTERS）（PBAE）は、従来の高分子のベクトルの対応に比べて格段に強化されたトランスフェクション効率を持つ大手ポリマーの発見につながっている、開発され、上映されている^。6-7

ここで、我々は、後肢虚血のマウスモデルにおいて血管内皮増殖因子（VEGF）を過剰発現する遺伝子改変されたADSCのその後の移植に続いて、PBAEの合成およびインビトロで脂肪由来幹細胞（ADSCを）をトランスフェクトする能力の検証を記載。成果は、生物発光イメージングを用いて細胞の運命を追跡するレーザードップラー灌流画像（LDPI）を用いて、組織灌流を評価し、組織学により、血管新生および組織サルベージを決定することによって評価した。

Protocol

1。ポリマー合成

1. ドラフト内で、ブタンジオールジアクリレート（C）の3,523 mgの秤量し、攪拌棒を含むガラスシンチレーションバイアルに移す。
2. 予熱5 - アミノ-1 - ペンタノール（32）が90°Cに塩を可溶化するために、次いでドラフト内で、1,533 mgの32を秤量し、Cを含有するシンチレーションバイアルに追加するこの方法は、モル比をもたらすであろうCの：32 = 1:1.2。
3. すぐに撹拌プレート上に両方のソリューションを含むバイアルを置きます。 600 rpmで撹拌速度を設定します。
4. 90℃に設定したオーブンにシンチレーションバイアルを転送4時間1,000 rpmに攪拌速度を設定します。撹拌棒が動かなくなった場合は、速度を下げる。 4時間後、下300rpmにスピードとは、別の12〜16時間90℃で維持する。
5. 攪拌棒を含むガラスシンチレーションバイアル中の無水テトラヒドロフラン（THF）10mlにC32の5グラムを追加します。完全に溶解するまでハイに箔と渦に包みます。
6. 別のガラスシンチレーションバイアルのコンタ中攪拌棒ining、Tetraethyleneglycoldiamineの10ミリ（122）を追加します。 THFを40ミリリットルを追加します。
7. 一緒になって、その後5分間攪拌プレート上で両方のバイアル（C32および122）を配置します。ホイルで覆い、24時間400 rpmで撹拌し、室温で残す。最終生成物を、C32-122と呼ばれている。
8. C32-122の各5グラムバッチの5×50ミリリットルファルコンチューブを量る。ノートブック内の各管の質量に注意してください。
9. 各50mlのFalconチューブに転写無水ジエチルエーテル30mlを。
10. 各50ミリリットルファルコンチューブにC32-122の10ミリリットルを転送します。
11. 渦ファルコンチューブを激しく次いで、2分間2500rpmで遠心する。注：抽出されたポリマーは、チューブの底部に収集されます。
12. 上側の解決策を捨て、ステップ1.9および1.11をさらに2回繰り返します。
13. 一晩デシケーターや真空中で抽出されたC32-122を含む、オープンチューブを配置します。すべてのチューブは、光から保護されていることを確認してください。
14. 最終的な質量を決定するために、C32-122を含む全てのチューブを量るポリマーを抽出した。
15. 100 mg / mlの濃度で無水DMSO中で抽出された重合体を溶解する。
16. 光と水分から保護し、-20℃で溶解したポリマーを保管してください。

2。細胞播種

1. プレコート0.1％（wt / vol）のゼラチンとT-150組織培養フラスコの底。ゼラチンは30〜45分間フラスコ内で維持する必要があります。ゼラチンコーティングはADSCの接着を支援します。
2. プレコートしたT-150フラスコから吸引ゼラチン。
3. 10％FBSを含有するDMEM 20mlのフラスコに、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10 ngの4×10 ⁶のADSC（≤継代3）を追加/ mlのbFGFを。
4. 37℃で、一晩で5％CO ₂のインキュベーター内でのT-150フラスコに配置します。
5. 翌日、トランスフェクション手順を開始する。

3。ナノ粒子の調製とトランスフェクション

1. 次の手順はあたり16.1μgのプラスミドDNAを含有するナノ粒子の製造のためのものである30:1の重量比は、プラスミド、ポリマーにおける1.0×10 ⁶細胞。
2. 希プラスミドDNA（1 mg / mlの、pVEGF165、Aldevron、ND、USA）を15 50mlのFalconチューブ中の酢酸ナトリウム中で120μgの/ mlの最終濃度（25 mM）をする。
3. 希C32-122（100 mg / ml）を第15ミリリットルFalconチューブ中の酢酸ナトリウム（25 mM）の中で3.6 mg / mlの最終濃度。
4. 10秒間、直ちに高い所にシングル15ミリリットルファルコンチューブと渦に各ファルコンチューブの中身を兼ね備えています。
5. 管が発生するナノ粒子形成のために10分間室温で放置します。
6. インキュベートしながら、トランスフェクト1.0×10 ⁶細胞あたり7.8ミリリットル完全補充したDMEMで、組織培養フラスコ内でメディアを交換してください。
7. 組織培養フラスコにナノ粒子溶液を移し、均等に分散するように前後に傾けてください。
8. 4時間37℃、5％CO ₂インキュベーター内で組織培養フラスコを置く。
9. 2時間後、nanoparを交換DMEMでメディアを含むticle。
10. 37℃、5％CO ₂でさらに2時間インキュベートした後、細胞を、 インビボ注射の準備ができている。

4。後肢虚血手順

1. すべての実験は、スタンフォード大学の動物実験委員会のガイドラインおよび承認されたAPLACプロトコルに従って行った。後肢虚血のマウスモデルは、前述のように行われて生成する^。8詳細な手順については、リファレンスを参照してください。簡単な説明を以下に提供される。
2. 吸入および1L /分の酸素流量で1〜3％の投薬イソフルラン麻酔下でマウスを置きます。つま先のピンチ、呼吸数の減少、および嗜眠で麻酔深度を確保する。
3. 腹部やシェービングクリームとマウスの両方の後肢領域から毛を削除します。
4. 正中線に向かって大腿内側の中心に切開を加えてから、元に脂肪パッドの上に位置を切断大腿動脈を提起する。
5. 遠位部位（膝に近い）と近位サイト（鼠径靭帯のすぐ遠位）：2サイトで動脈を結紮。
6. ライゲーションを作成するには、静脈から動脈を分離し、動脈の周り5-0絹縫合糸を通します。ライゲーションを作るために2ノットで動脈を縛る。
7. 2ライゲーション点間の動脈を削除します。
8. PBSで手術領域を洗浄した後、縫合する切開を閉じた。
9. 麻酔は削除することができます。再覚醒するまで、マウスを暖かく保つ。術後ケアのために、2〜4 mg / kgのリドカインは、切開部位に皮下再覚醒する前に注入することができる。さらなる疼痛管理は、12および24時間後に0.05〜0.1 mg / kgのブプレノルフィンの皮下送達を含むことができる。呼吸パターン、明白な痛みや苦痛、そして皮膚の色の変化を観察することにより、7日間、一日一回のマウスの健康状態を監視します。
10. レーザードップラー血流イメージングにより後肢虚血​​を確認してください。

5。細胞注射

1. トランスフェクションされた細胞とマウスの準備が整ったら、トリプシン処理し、PBSでトランスフェクトした細胞を洗浄し、遠心分離した後、カウントされます。
2. PBS中ml当たり10×10 ⁶細胞の密度で細胞を再懸濁。
3. 細胞懸濁液を110μLの容量で別々のエッペンドルフチュー​​ブに分離してください。これは、各マウスは、細胞の等量を受け取ることを保証する。
4. 麻酔下で、各マウスを置き（2.5％イソフルラン、1L /分の酸素流量）。
5. アルコール綿で注射部位を清掃してください。
6. 27のGツベルクリン注射器を利用して、均質な懸濁液が得られることを確認するために注射器には、上下のセルを描画します。シリンジ内に細胞懸濁液容量を100μlを策定。
7. 内転筋領域に半細胞懸濁液を注入した後、ふくらはぎの筋肉領域に他の半分を注入する。注入時には、少なくとも15〜30秒のための場所に注射器を残す細胞懸濁液の漏出を防ぐ。
8. 動物実験のための適切なコントロールには、次のとおりです。2）細胞単独; 1）非コードプラスミド（生物学的活性を持つ例えば 、プラスミド）でトランスフェクションした細胞を、3）PBS。
9. 注射が完了したら、麻酔からマウスを削除し、マウスの再目覚めるまで暖かい保つ。

6。生物発光画像法

1. 生物発光イメージング（BLI）を開始するには、前述したように、マウスを麻酔。
2. アルコール綿で注射部位を清掃してください。
3. 利用インスリン注射器、15 mg / mlでのD-ルシフェリン（ホタルルシフェラーゼの基質）の荷重を100μl。光から基板を遠ざけること。
4. 腹腔内注射を行うためには、彼らの前方肌がピンと張っ引っ張って自分の背中の皮膚でマウスを押したままにします。腹腔腹部に針を挿入し、基質100μlを注入。
5. 麻酔下でIVISルシフェラーゼイメージングチャンバー内にマウスを置きます。
6. 1.0分の露光時間で画像のマウス。パラメータを設定すると、画像を取得し始める。
7. 画像が取得されると、ルシフェラーゼシグナルを測定するように関心領域をマークする。この場合において、細胞注射部位に虚血肢をマーク。
8. 信号がピークに達し、減少し始めるまで、ルシフェラーゼシグナルごとに3〜5分を測定し続けています。これは、マウスを横切っていくつかの時間点にわたって比較のために利用される値である。
9. 完了すると、室及び麻酔からマウスを外します。再覚醒するまで暖かいマウスを保管してください。

7。レーザードップラー灌流イメージング

1. レーザードップラー灌流画像化は、以前に記載のように行われる^。8手順を簡単に説明する。
2. マウスによる髪へのアーティファクトを防ぐために、後肢と腹部領域の両方の上に位置する領域にきれいに剃っているあるべきイメージングドップラー前に。
3. ドップラ画像に調製される場合、畝前述したように、SEに麻酔されるべきである。
4. 直腸温度計で体温を監視しながらホットプレート上で36℃にマウスを温める。
5. 非反射黒色の表面にマウスを置き、ノーズ​​コーンにより麻酔維持。マウスが均等にさらされ、その手足との背面に配置する必要があります。
6. 約15 CMマウスの上に、マウスの鼠径部地域に向けたセンサからレーザーポインターを向けるレーザードップラーセンサを配置します。
7. マウスおよびドップラーセンサ位置にあるとき、画像は、スタートボタンを押すことによってLDPIwinソフトウェアを利用して撮影することができる。
8. 相対潅流測定が利益率（ROI）の領域として両方の後肢（虚血性および非虚血性）を示すことによって取ることができる。非虚血性後肢の虚血性の平均灌流の比率が相対的灌流を示します。

8。組織の収穫手順

1. 収穫マウスTISに調製された場合組織学および/または生化学的処理のために訴訟を起こす、マウスを安楽死させなければならない。ここでは、マウスを頚椎脱臼によりマウスを安楽死して、3〜5分間、5％イソフルランに曝露することによって安楽死させている。
2. 後肢の遠位に腹部と近位で円周方向に後肢を取り巻く覆っている皮膚を切った。皮膚は、皮膚が足への後肢上に引き戻すことができるように、背側表面に腹側から切断される。
3. 肌を引き戻す際に、四肢、骨盤と大腿骨の関節で切断する鈍い切開はさみを利用することによって切断することができた。
4. 二つの主要な組織は、分析のために採取されています。内側転筋および腓腹筋を。
5. 組織学のために、凍結切片に最適な切削温度（10月）の1つまたは両方の組織を埋め込む。
6. 生化学分析のために、1.5mlのエッペンドルフに一方または両方の組織を収集し、少なくとも2分間液体窒素の浴中に沈める。サンプルは、することができます将来の処理のために-80℃で保存した。

Results

一緒に混合すると、正に帯電したポリマー（C32-122）及び負に荷電したDNAプラスミド自己集合ナノ粒子に変換する。 C32-122とプラスミドDNAとの間の複合体形成は、電気泳動中にDNAの動員を防止する、すなわち 、ナノ粒子の形成は、電気泳動分析を通じて確認することができる。ポリマーは、標的細胞へのDNAの増強された取り込みおよびコードするタンパク質のその後の発現（ 図2）を容易にするために、トランスフェクション試薬として機能する。細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）および蛍光顕微鏡法（ 図3）を用いて高効率を有するポリマーベクター設計およびトランスフェクション条件の迅速な最適化を容易にするために、緑色蛍光タンパク質（GFP）などの任意の治療遺伝子またはレポーターDNAでトランスフェクトすることができる。 ADSCをするために、20％以上の効率が適切であると考えている。

細胞運命ポストtransplantaの追跡を容易にするTiONから、細胞は、安定的に非侵襲的生物発光イメージング（BLI）...

Discussion

ここでは、非ウイルス性、生分解性ナノ粒子を用いた治療因子を過剰発現する成体幹細胞をプログラムする方法を報告している。このプラットフォームは、例えば、虚血および癌などの、ここで幹細胞が自然に自宅できる疾患を治療するために特に有用である^。9-10さらに、非ウイルス遺伝子送達プラットフォームは、ほとんどの組織再生および創傷に適した、治療因子の一過性過剰発現を可能にする治癒過程。トランスフェクション法は、細胞への効率的なDNAのエントリに依存し、一般的には、非分裂細胞でも同様ではない積極的に分裂細胞型でうまく動作しますが、。 PBAEポリマーのトランスフェクション効率は、細胞型への細胞型と異なる場合があり、個別に最適化されるべきであり、さらに化学構造の改変は、特定の標的細胞集団における最適なトランスフェクション効率を達成するために探求されてもよい。上記の方法でトランスフェクト^11-12細胞通常、私は結果2-4日の周りに達成されるピーク遺伝子発現を有する2週間一過性の遺伝子発現およびタンパク質分泌、nである。動物実験で20％を超えるトランスフェクション効率を有するのADSCが適していると考えられる。これ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
ウシ胎児血清	Invitrogen	10082
ペニシリン/ストレプトマイシン	Invitrogen	15070
塩基性線維芽細胞成長因子	Peprotech	100-18B
1,4-ブタンジオールジアクリレート (90%)	Sigma Aldrich	411744	頭字語: C
5-アミノ-1-ペンタノール(97%)	アルファAesar	2508-29-4	頭字語:32
テトラエチレングリコルジアミン>99 %)	Molecular Biosciences	17774	頭字語: 122
酢酸ナトリウム	G-Biosciences	R010
リン酸緩衝生理食塩水	Invitrogen	14190-144
テトラヒオフラン無水 (>99.9 %)	シグマ アルドリッチ	401757
ジエチル エーテル無水 (>99 %)	フィッシャー サイエンティフィック	E138-4
DMSO 無水 (>99.9 %)	Sigma Aldrich	276855
ゼラチン	Sigma Aldrich	G9391
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferin	GoldBio
Optimal Cutting Temperature (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
ラット 抗マウス CD31	BD Pharmingen	550274
AlexaFluor 594 抗ラット IgG	Invitrogen	A11007