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Summary

Cu (I)を用いたメタロシャペロンモデルペプチドのNMR溶液構造を決定し、サンプル調製と1Dおよび2Dデータ収集から3次元構造までの詳細なプロトコールについて説明しました。

Abstract

銅(I)がメタロシャペロン輸送タンパク質に結合すると、銅の酸化と有害な酸化還元反応に関与する可能性のある有毒イオンの放出が防止されます。Cu(I)結合メタロシャペロンタンパク質のペプチドモデルのCu(I)複合体(MTCSGCSRPG配列を含む)(下線は保存)を、不活性条件下で溶液中でNMR分光法により決定した。

NMRは、タンパク質やペプチドの溶液構造を決定するための広く受け入れられている手法です。X線結晶構造解析に適した単結晶を提供するには結晶化が難しいため、NMR技術は、特に固体状態ではなく溶液状態に関する情報を提供するため、非常に価値があります。ここでは、NMRによる完全な3次元構造決定に必要なすべてのステップについて説明します。このプロトコールには、NMRチューブでのサンプル調製、1Dおよび2Dデータの収集と処理、ピークの割り当てと統合、分子力学計算、構造解析が含まれます。重要なことは、分析が最初に事前設定された金属-配位子結合なしで実施され、偏りのない方法で信頼性の高い構造決定が保証され

たことです。

Introduction

ペプチドは、それ自体がタンパク質モデル、潜在的な薬物リード、および治療薬として広く使用されています。しかし、その小型化と高い柔軟性は、結晶化が困難であるため、X線による構造決定がしばしば不可能である。

核磁気共鳴(NMR)を使用して、ペプチドの構造と相互作用を決定できます。この方法は、局所構造および全体的な構造、結合および低親和性相互作用に関する情報を得ることができ、溶液状態で行うことができるため、困難なサンプルに適用できます。

>jove_content<生物学的システムにおける銅輸送は、Cu(I)イオンに特異的に結合し、一連のタンパク質間相互作用を通じて標的タンパク質に送達する細胞内銅メタロシャペロンタンパク質によって達成され、イオンを酸化から保護し、有毒な銅^2-5の放出を防ぎます。結合部位は、保存された配列MXH / TCXanyXanyCによって特徴付けられ、NMRと結晶構造解析の両方で、2つのシステイン残基の柔らかいチオラート配位子によってCu(I)に結合することが示されていますが、追加の外部リガンドも提案されています^6-8。これらのタンパク質の構造と機能の関係は、集中的な研究の対象となっています⁹。

ここで紹介する研究では、銅メタロシャペロンの保存配列を含むペプチドモデルを合成し、不活性環境下でCu(I)と反応させました。提示されたプロトコルは、サンプル調製、データ収集、データ処理、構造生成、構造解析など、NMRによる構造決定のステップを説明しています。分析は2つのステップで行われました:最初の構造は、ペプチドの銅イオンへの結合モードに関する情報なしで生成されました。結合モードが経験的に確立されると、これらの制約が導入され、高分解能の構造が得られました。結合のモードはモデルの重要なポイントであり、したがって偏りのない方法で決定されました。

モデルペプチドのNMR構造決定は、化学者や生物学者がよく使用する非常に価値のある手法です。これは、異なる条件下で異なるペプチドに比較的容易に適用することができ、したがって、関連するメカニズム¹⁰に光を当てることができるかもしれない。構造解明プロセスを理解することで、提案された構造の長所と短所をよりよく理解することができます。

Protocol

1. サンプル調製

1. Apoサンプル:約1〜2 mgのペプチドを450〜500 μlの重水素化NMRグレードの溶媒に溶解します(生物学的サンプルの好ましい溶液は、10% D2Oの水、またはサンプルが水に溶解しないか反応しない場合はd6-DMSO ^11-12です)。
2. 銅反応サンプル:約1〜2 mgのペプチドを等モル量の金属塩とともに、450〜500 μlのNMR溶媒に溶解します。
3. 焼結ガラス、濾紙、または調査中の化合物に適し、それらを吸着しないその他の技術を使用して溶液をろ過します。これは、均質性に影響を与える金属粒子を除去するために不可欠です。
4. 溶液をNMRチューブに移し、閉じます。チューブの品質が、使用する磁石の強度に合っていることを確認してください(詳細については、機器の表を参照してください)。
5. サンプルが酸素に敏感な場合、これらの手順は不活性な環境下で行い、酸化を防ぐためにチューブを密閉する必要があります。

2. NMRデータの収集と処理¹³

1. アポ反応サンプルと銅反応サンプルの1D ¹Hスペクトルを記録し、比較します。銅含有ペプチドスペクトルは、アミド領域の化学シフトの有意な変化を示すはずであり、アポペプチドは柔軟性があり、平均的な立体配座を示すため、ピークは分離されましたが、銅と反応すると、結合ペプチドアミドは単一の構造を持ちます(図2)。
   1. スペクトルが変わらない場合、反応は失敗したと仮定されます。
   2. サンプルが緑色に変わると、銅は大気中で酸化し、結合特性が変化する可能性があります。
   3. どちらの場合も、サンプルを作り直す必要があります。
2. 細い線幅でアミド残基のオーバーラップが最小限に抑えられるNMR測定に最適な温度条件を見つけます。
3. COSY¹⁴、TOCSY¹⁵、NOESY¹⁶、ROESY¹⁷ NMR実験を同一の条件(温度、pHなど)で設定し、順番に実行します。
   1. COSY(図3)およびTOCSY(図4)実験では、それぞれ隣接する陽子-陽子相互作用およびより長い距離の隣接陽子-陽子相互作用の結合貫通相互作用を検出します。COSYスペクトルはHN-Hα相関に関する情報を提供し、TOCSYスペクトルは、相関残基のHNおよび他のH脂肪族プロトンに関する情報を提供します。
   2. NOESY実験とROESY(図5)実験では、構造情報を得るために結合に依存せずに空間貫通近接を検出します。2つのどちらを選択するかは、コンパウンドの有効サイズと電界強度によって異なります。このような組み合わせの中には、理論上のゼロ信号が得られるものもあり(図6)、NOE相互作用^10,18を検出するためにはROESY実験を実行する必要があります。
   3. サンプルが水中にある場合、実験には水抑制の成分が必要です。これは、勾配¹⁹を使用して最も効率的に達成されます。この場合、一度割り当てられたサンプルを純粋なD₂Oで再分析して、Hα水素への相互作用およびHα水素間の相互作用を得ることが有利です。
   4. TOCSYとNOESYまたはROESYの混合時間を最適化するには、スピン拡散の損失を最小限に抑えながら最大のシグナル蓄積を見つけるための短い実験を多数実行します。これがビルドアップ曲線の線形領域であることを確認してください。600 MHzフィールドのペプチドに共通する値には、TOCSYで約100ミリ秒、NOESYまたはROESY実験で約150ミリ秒の混合時間が含まれます。
   5. 各実験の合間に1D実験を行い、データ取得全体でサンプル組成が一定に保たれるようにします(図7)。
4. 適切なアポダイゼーション関数を使用してスペクトルを処理し、信号強度の損失を最小限に抑えて最大の分解能を得るため、t1 次元にゼロ充填を追加します。
   1. さらに、F2 次元と F1 次元の基線を 2 次多項式関数で補正します。
   2. 既知の標準(それぞれTMSPまたはTMS)からのシフトに応じて、それぞれの溶媒中の残留水またはDMSOピークに従って、スペクトルの化学シフトを慎重にキャリブレーションします。

3. SPARKY²⁰を使用したピーク割り当てと積分

1. NOESYまたはROESYスペクトルにCOSYスペクトルとTOCSYスペクトルを重ね合わせたセットを準備します(図8)。
2. スペクトル内のすべてのNOEピークを、Wüthrich²¹が開発したシーケンシャルアサイン法に従って割り当てます。
   1. フィンガープリント領域のTOCSY信号と重なるピークを割り当てることから始めます。これにより、SPARKYプログラムでの後続のピーク割り当てが容易になります(図9)。割り当ての化学シフト(図10)と³つのJHNHα値(図11)を登録します。
3. ピークを距離制約に変換し、³JHNHα 値を二面角に変換します。
   1. これは、プログラム内からピークを統合し、既知の距離(メチレン基の2つのプロトン間の距離や芳香族アミノ酸の芳香族水素原子間の距離など)の相互作用を使用して距離制約に変換することで実現できます。
   2. ピークが重なり合い、波形解析法を使用できない場合は、視覚的推定によって強-中-弱-非常に弱いとラベル付けでき、これらの指定はそれぞれ最大2.5、3.5、4.5、および5.5 Åまでの距離に変換できます。これは、ペプチドを扱う作業に最も効果的です。
   3. ³JHNHα値は、Karplus方程式による二面角を示しており、ほとんどの与えられた結合値は複数の二面角から生じる可能性があります。これらは、二次構造(ヘリックスまたはシート)、ランダムコイル、またはそれらのコンフォメーション平均を示すことができます。したがって、制約条件を慎重に使用するか、コンフォメーション結果の確認として使用することが重要です。

4. XPLOR22を用いて構造アンサンブルを生成するための分子力学計算

1. 距離制約と二面角をXPLORの正しい形式でインポートします。(図 12、残差制約のみ)。XPLORは、実験的に発見された距離制約に加えて、結合の長さ、角度、カイラリティなどの標準的な幾何学的化学的制約に準拠する構造を見つけるために、コンフォメーション空間を探索し、上記のパラメータのいずれも違反しないアンサンブルを生成します。これがスターティングアンサンブルを構成します。
2. 最初の構造決定の実行は、金属に対する制約を使用せずに行われます。これにより、どの残基がバイアスなく金属結合に関与しているかがわかります。ステップ 4.4 に進みます。
3. NMRから導出された距離制約に加えて、決定された残基に金属結合制約を追加します。
   1. 金属イオンとそのトポロジーを説明するための適切なパラメータを追加します。
   2. 適切な物理情報(質量、他の原子との結合長、角度、および非結合反発パラメータ)をパラメータファイルに入れる必要があります。
   3. バインディング情報をトポロジー・ファイルに追加します。バインディングの結果として形成および切断されたボンドと、バインディングの結果として変更されるフォーマル・チャージ
   。
4. 通常は 10 人のメンバーの小さなアンサンブルを作成します。
   1. 制約を徐々に導入し、バックボーン間の相互作用から始まり、次にバックボーンからサイドチェーンへの相互作用、次にサイドチェーンからサイドチェーンへの相互作用、そして残差内、シーケンシャル、そしてますます長い範囲の相互作用へと移行します。これにより、割り当てのミスを特定しやすくなります。
   2. NOEエネルギーを、50 kcal/mol•Å²の一定の力定数を持つ正方形の井戸電位として導入します。シミュレーテッドアニーリングは、1,500 Kで1,500 3 fsecステップ、500 Kまで冷却する際に3,000 1 fsecステップで実行する必要があります。最後に、共役勾配エネルギー最小化を使用して、4,000回の反復で構造を最小化します。これらは、XPLOR内で変更できる変数です。
5. 通常は 50 人のメンバーからなる最終的なアンサンブルを作成します。アンサンブル全体に対してステップ 4.4 のステップを実行します。
   1. 図 13 に示すように、検出された各タイプの NOE 相互作用の数を報告します。
6. 標準的な化学幾何学と経験的NMRから導出された制約条件に準拠した構造のアンサンブルを作成します。
   1. コンフォメーションの総数、NMRから導出された制約条件に違反しているコンフォメーションの数、およびアンサンブル全体(バックボーンの両方、およびすべての重原子のRMSD値)のRMSDを報告します。

5. 構造解析

1. 解かれたアンサンブルは、NMR測定中にペプチドが採用するコンフォメーション空間を表しています。局所的な柔軟性は、分子の異なる領域で変化する可能性があり、これは構造的または機能的な理由に起因する可能性があります(構造解析の目的は、安定性と作用機序の構造的基礎を決定することです)。
   1. 構造のすべてのコンフォメーションをMolMolプログラム23にインポートして、開始アンサンブルを作成します(図14)。
2. アンサンブルを調べて、分子の局所的な安定性を判断します。
   1. バックボーンとサイドチェーンのRMSD値を決定するには、シーケンスに沿って後続の4残基領域を選択し、プログラムに最低エネルギー構造または平均までのRMSDを計算させます。
   2. 分子のどの領域が局所的な安定性を示すか(図15)には、局所的なRMSDを配列の関数としてプロットします。
   3. 分子のこの領域に沿ってアンサンブルを重ね合わせ、このアンサンブルをさらに分析するために使用します(図16)。
3. NMR由来の制約条件に従った(違反しない)低エネルギーコンフォメーションを選択します。これらが「低エネルギーアンサンブル」を形成します。
   1. アンサンブル内のコンフォメーションの数、それらを選択するための基準、およびステップ4.6.1で定義されたRMSD値を報告します。
   2. 金属結合モードがすでに決定されている場合は、次の手順に進みます。さもないと:低エネルギーアンサンブルを分析し、金属イオンに結合できるように、どの残基サイドチェーンが互いに正しく近接しているかを判断します。これらが決定されたら、ステップ 3.3 に戻り、銅結合データを含む解析をやり直します (図 17 はアンサンブル、図 18 は低エネルギー適合体)。
4. アンサンブルを調べ、MolMolプログラムのデフォルトの検索パラメータを使用して、分子内の局所的な二次構造を決定します。二次構造は水素結合によって保持され、分子の安定な領域を示します。
   1. 各配座異性体の二次構造を決定します(図19)。
      1. 各二次構造を示すアンサンブルの適合体の割合の表を作成します。
      2. 二次構造の領域が、local-RMSD によって安定領域と判断された領域と重なっているかどうかを判断します。これはよくあることです。
5. 分子内の距離と水素結合を決定します。
   1. アンサンブルを Chimera²⁴ にインポートします。
   2. Chimeraを使用して、金属結合が疑われる原子間の分子内距離を決定します。アンサンブルの平均距離を計算します。
   3. Chimera を使用して、プログラムのデフォルトの緩和水素結合パラメーター (20%) を使用して、アンサンブルの各配座異性体 (図 20) の分子内水素結合を決定します。
   4. 各水素結合を示すアンサンブルの配座異性体の割合の表を作成します。大部分のコンフォメーションで再発する水素結合は、構造の安定性を高める安定した結合を示しています。
6. 分子内の静電相互作用を決定します。
   1. チャージされたサイドチェーン間の相互作用を特定します。
   2. 各静電相互作用を示すアンサンブルの適合体の割合の表を作成します。
7. Delphi²⁶ プログラム内の Amber²⁵ 力場を使用して、静電ポテンシャル分布を計算します。
   1. アンサンブルから、静電ポテンシャル計算を実行する単一の代表的なコンフォメーションを選択します。
   2. ポアソン・ボルツマン方程式と完全なクーロン計算を使用して、静電ポテンシャルを導き出します。必要なパラメータには、溶液のイオン強度、溶液の誘電率(水の場合は80、DMSOの場合は40)が含まれます。内部ペプチド(通常は約5.0)。グリッドのサイズ(通常は65’65’65ポイント)。ペプチドとグリッドの端との間の最小距離(10 Å)。主な結果はペプチド自体によって支配されるため、通常、これらの値に関して結果は非常に堅牢です(図21)。
   3. ペプチドのファンデルワールス表面にマッピングされた静電ポテンシャルを調べます(図22)。
   4. 同じ電位を持つ位置を表す静電ポテンシャル等値面を調べます。他のタンパク質やリガンドを引き付けたり反発したりする可能性のある拡張された正または負の表面や、両親媒分布や異なる特性のパッチなど、重要性を示す分布など、生物学的関連性を示唆するアイソサーフェスを見つけます(図23)。
8. すべての構造的知見を合計して、それらがどのように互いに強化し合うかを確認します。
9. 必要に応じて、手順4.3〜5.7.4を繰り返します。

Representative Results

Discussion

The contribution of structural information to understand binding mechanisms is well-accepted. Peptides are useful as models for protein binding and interactions; however they are not amenable to the main method for structure determination, X-ray crystallography. NMR is particularly useful for these systems, since the structures can be readily solved in solution. This is especially for the case of metallochaperone-mimetics that additionally require structure determination under an inert environment to prevent oxidation of the metal ion.

The MTCSGCSRPG peptide, containing the conserved MT/HCXXC motif, bound Cu (I) as was evident by the significant change of spectrum from the apo-form to the peptide reacted with copper. The need for a ROESY experiment at the field of 600 MHz, due to a spectrum with null interactions in the NOESY spectrum, indicates a compact peptide, since our experience shows that smaller peptides of 6-7 residues fall in the null signal of the NOESY regime, but peptides of this size usually give adequate signal. In the ROESY spectrum 81 cross-peaks were observed, N of these were inter-residue cross-peaks and (81-N) were intra-residue cross-peaks. This is a small number of peaks compared to proteins, but is expected in small peptides; Particularly cyclic peptides, which tend to give a small number of interactions since all the sidechains point outward and undergo little interaction with one another.

As the metal itself cannot be detected directly by the ¹H NMR measurements, one must conclude on the metal binding residues from the distances obtained between suspected donor atoms. To assure a reliable structure, no metal-ligand binding constraints should be added to the initial calculations. Previous studies have shown that forcing metal binding in an incorrect form may still lead to reasonable structural factors even if the structure is incorrect¹⁰.

The experiments gave highly nonviolated conformations in an ensemble of low RMSD. The low RMSD of a potentially flexible peptide lends further support for copper binding, which would reduce the conformational flexibility of the molecule. The RMSD values of the binding region were reduced to values around 0.05 Å, which shows tremendous stabilization as expected by the ring closure. The secondary bend and hydrogen-bonding found in the 3-7 region, also indicated binding in this region.

The negative charge obtained when two thiols bind the copper (I) peptide is offset by the N-terminal amine that was held proximate to the bound copper.

When inspecting the resulting distances between potential donor atoms, including the two cysteine residues and the methionine group, the ones located at positions most probable to bind metal were the sidechains of Cys3 and Cys6. Therefore, binding constraints were added between these residues and the metal center, and the resulting structure was evaluated. To further support the resulting structure, various additional control measurements that include preset bonds to other residues may be performed and the structural factors compared. This is especially important where the result of the model is unexpected. In previous studies using similar measurements using protein-mimetic peptides, unusual binding modes were observed, including methionine instead of cysteine⁷.

Excess copper is toxic to biological systems and copper transport is very tightly controlled. Therefore, it is interesting and mechanistically important to understand how copper is transferred from one protein to another. The transport cannot depend on simple release and acquire mechanism, but must somehow include both stronger and weaker modes of binding, much like how one would transfer an object carefully from the fingers of one hand to another. This type of study provides much information regarding the mechanism of copper binding in biological systems and can be used to further investigate many different aspects of metallochaperone activity in nature. The systems may be easily mutated and manipulated to mimic many different aspects of copper-binding in nature, and may be analyzed without using prior assumptions of the binding mode.

Materials

Avance DMX 600 MHz Spectrometer	Bruker
NMR sample tubes 	Wilmad	535-PP
Glove box	MBraun	LM05-019
Lyophilizer  	VirTis	benchtopK
Peptide	BioChemia	Custom made	>95% purity
Copper (1) chloride	Aldrich	224332
Hydrochloric acid	BioLab	231-595-7
Sodium hydroxide	Gadot	1310-73-2
d<sub>6</sub>-Dimethylsulfoxide	Aldrich	236926
Deuterium oxide	Aldrich	151882