他のT細胞サブセットとは異なるエフェクター機能を持つ、Th17細胞は、中央炎症性自己免疫に関与している。このインビトロのTh17分化プロトコルは、ナイーブCD4 + Tリンパ球は、Th17細胞に分化することができ、さらに自己免疫および宿主応答におけるそれらの役割を検討するかどうかを決定するための手段を提供する。
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方法論記事
離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
Th17細胞は、インターロイキン17（IL-17）を産生することが見出されているT細胞の別個のサブセットである、およびTh1、Th2の、および調節T細胞を含む他のT細胞サブセットの機能が異なる。 Th17細胞は、多くの自己免疫疾患に関連した熱心炎症性免疫応答において中心的な原因として浮上している。この方法では、C57BL / 6マウスの脾臓およびリンパ節からのTリンパ球を精製し、制御およびTh17分化を誘導する環境下での精製されたCD4 + T細胞を刺激する。 Th17分化を誘導する環境を、抗CD3および抗CD28抗体、IL-6、およびTGF-βの存在下での刺激を含む。少なくとも72時間、および37℃で最長5日間インキュベートした後、細胞を、続いてフローサイトメトリー、定量PCRおよびELISAを介してIL-17を産生する能力について分析する。 Th17の分化CD4 + CD25-T細胞はさらに、Th17細胞が自己免疫およびホスト·ドの発症および進行に果たす役割を解明するために利用することができる国防。また、個別のマウスノックアウト/疾患モデルからのCD4 + CD25 - リンパ球のTh17の分化は、細胞運命の可塑性の我々の理解に貢献することができます。
概要
CD4 + Tリンパ球（T細胞）は、感染性微生物に対する免疫系媒介性防御において重要な役割を果たしている。逆に、T細胞はまた、密接に1型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチなどの自己免疫疾患の発症および進行に関連している。 CD4 + Tリンパ球は、T細胞受容体、同族抗原/主要組織適合複合体II（MHCII）の分子と（TCR）相互作用の組み合わせによって活性化され、B7.1/B7.2でCD28受容体の相互作用は15リガンド 。 TCR刺激およびCD28共刺激の提供に加えて、抗原提示細胞は、それによって所与の抗原に対するTリンパ球の応答を導く、Tリンパ球の分化状態を決定するサイトカイン環境を提供する。異なる病原体/抗原提示細胞の相互作用は、イーライに焦点を当てた別個の経路をTリンパ球をダウンスキュー異なるサイトカイン環境を作成する開始病原体のmination。残念ながら、元々の病原体を根絶するために設計された侵入するTリンパ球のエフェクター経路は、誤って自己組織15に向けることができる。したがって、各別個のCD4 + T細胞サブセットの分化状態のより良い理解は、病原体の排除と自己に対する寛容とのバランスを調節する方法についての我々の理解に重要である。
のTh1、Th2の、および誘導性調節性T細胞分化経路に加えて、ナイーブTリンパ球はまた、ダウン経路のTh17サイトカインにより駆動することができる。 Th1細胞は細胞内病原体戦....
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プロトコル
すべての動物の使用は、施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実施した。
1。ミックスとメディアの準備
- 滅菌したPBSのpH：7.3（1リットル）
0.23グラムのNaH 2 POの4
1.15グラムのNa 2 HPO 4
9.0グラムのNaCl
DI水で音量を上げてください。オートクレーブ滅菌する。 - 細胞培養培地（100ミリリットル）
89ミリリットルのRPMI
10ミリリットル、10％FBS
1ミリリットル抗生物質抗真菌（ABAM）100μgを50 mMの2 - メルカプトエタノール（96.5μgのPBSに3.5μgの株式2 - メルカプトエタノール） - FACS緩衝液（蛍光活性化セルソーティング）（フローサイトメトリーの間に使用されるために）、2％FBS、滅菌PBS中
- iTh17ミックス （試料の数に基づいて、すべてのミックスとメディアのために必要な容積を決定）
1.5μg/ mlの抗CD28
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結果
このTh17の分化プロトコルは、脾臓の摘出および腋窩、上腕、腸間膜、頸部、および鼠径リンパ節から始まります。それぞれの位置の表現は、 図2および図3に見出すことができる。図1および図5の両方が、このプロトコルに記載された方法の視覚的表現を提供する。
このTh17のプロトコルは、CD4 + CD25 - Tリンパ球集団から分化に焦点を当てています。これは、とautoMACS Proの細胞分離がプールされ、総リンパ節および脾臓（ 図4）からの私達の希望のCD4 + CD25-の人口を豊かにする方法を効率的に注意することが重要である。未分画をプールし、リンパ節および脾細胞をautoMACSと、分離された画分をフローサイトメトリー分析（ 図4）、続いて抗CD4及びantiCD25抗体で染色した。 図4Aは、CD4 + CD25 +の割合の代表的なプロフ.......
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ディスカッション
ここでは、 インビトロでのTh17分化を達成するためのプロトコルを記載している。のTh17サブセットへのTリンパ球の分化はヒト病原体13の効果的な除去のために重要であるとしてのTh17分化の研究は、重要です。逆に、IL17産生は、自己免疫疾患の進行13と関連している。それは、免疫調節および自己免疫の多数の異なるマウスモデルに適用することができるように、Th17の分化の方法は、多くの研究設定にも適用可能である。この方法は、免疫応答を調節するために、IL-17Aおよび転写因子RORγtの表現の産生により、このプロトコルに示されたTh17細胞に分化するために、Tリンパ球の能力に関する質問に答えることができます。また、Th17細胞はまた、IL17F、IL22、およびGM-CSF 8,12の産生により同定することができることが他者によって示されている。このプロトコルは、互いに対して有意である例えば、Th1またはTh2分化のような公知のTリンパ球の分化プロトコルは、より良好なTリンパ球のエフェクター機能は、免疫系の動作に関連するかを理解するために、これらのプロトコル.......
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謝辞
この作品は、フロリダ大学のTL1 TR000066とUL1 TR000064、国立衛生研究所、BDバイオサイエンス試薬の助成金、および大学からの親グラントR01AI056152からダイバーシティ·補完するために、NIH / NCATS臨床およびトランスレーショナル科学賞によって部分的にサポートされていますフロリダ州。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬/材料 | |||
| 滅菌ポリエチレンペトリ皿 | フィッシャーサイエンティフィック | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS ランニングバッファー | ミルテニーバイオテック | 130-091-221 | |
| プレミアム顕微鏡スライド、つや消しフィ | ッシャーサイエンティフィック | 12-544-3 | 3インチ x 1インチ1 mm |
| 5 ml 21G1ラテックスフリーシリンジと針 | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml 遠心分離チューブ | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| ナイロン 40 ミクロン | マイアミ アクアカルチャー | ナイロン 40/26 | |
| Microtest 組織培養プレート 96 ウェル U 底 | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 ウェル細胞培養プレート | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| エッペンドルフチューブ 1.5 ml | フィッシャーサイエンティフィック | 05-408-129 | |
| 精製 NA/LE ハムスター 抗マウス CD3e | BD バイオサイエンス | 553057 | |
| 精製 NA/LE ハムスター 抗マウス CD28 | BD バイオサイエンス | 553294 | |
| マウス IL-6 組換えタンパク質 | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BDBiosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt–タノール | MP バイオメディカル | 194834メディカル レ | ハド |
| ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA) | |||
| イオノマイシン カルシウム塩 | シグマ-アルドリッチ | 13909-1ML | 危険性 |
| ブレフェルジン A (BFA) | MP バイオメディカル | 159027 | |
| ELISA IL-17A キャプチャ モノクローナル抗体 | BD バイオサイエンス | 555068 | |
| ELISA IL-17A 検出モノクローナル抗体 | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA キット | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB 基質試薬セット | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ 遠心分離機 | ThermoScientific | ||
| Napco シリーズ 8000 WJ CO2 インキュベーター | ThermoScientific | ||
| PTC-200 ペルチェ サーマル サイクラー | Biorad |
参考文献
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleuk....
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再版と許可
