方法論記事

熱誘導抗原賦活化:成体海馬神経新生における前駆細胞型の検出および同定に有効な方法

DOI：

10.3791/50769

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2013年8月30日

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1Department of Neurologic Surgery, Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Anatomy, Korea University College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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成体の海馬神経新生では、静止状態の神経幹細胞が順次進行し、回路内で機能的に統合されたニューロンに発達するときに、異なる遺伝マーカーのセットが発現します。熱誘起抗原賦活化により、他の方法では検出が困難な前駆細胞の種類を同定し、より効果的に同定します。

要約

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組織固定後の免疫組織化学(IHC)の伝統的な方法により、さまざまな細胞タイプの可視化が可能になります。これらは通常、抗原に結合するための抗体の適用を進め、固有の生物学と発生の機能である特性を持つ細胞を同定します。成体海馬の神経新生は、静止状態の神経幹細胞が活性化され、増殖、分化、成熟、機能統合の段階を経て進行する連続的なプロセスです。各フェーズは、遺伝子の特徴的な形態とアップレギュレーションによって区別されます。これらの段階の特定は、作用している調節メカニズムと、衰弱性疾患の病態生理学の根底にあるこのプロセスの変化を理解するために重要です。当社の熱誘起抗原賦活化アプローチは、検出されるシグナルの強度を向上させ、前駆細胞の種類を正しく同定することを可能にします。この論文で説明したように、特に、特定の前駆細胞タイプの検出における現在の問題を回避することができます。

概要

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神経新生は、神経幹細胞から新しいニューロンを生成するもので、現在では脳の2つの特殊な領域で成人期まで常に発生することが知られています。これらには、嗅球の脳室下ゾーン(SVZ)と海馬の歯状回の顆粒下ゾーン(SGZ)が含まれます。過去10年間で、成体海馬の神経新生の分野は重要な研究が見られました。この領域は、SGZの新生ニューロンが特定の脳機能を維持できる神経可塑性の増強に寄与するため、大きな関心を集めています1-5。 成体海馬のニューロン新生は、気分の調節、再生、学習と記憶に重要な役割を果たすことが示唆されています。したがって、この豊かな神経原性ニッチにおけるニューロンの発達と調節を理解するための協調的な努力がなされてきました。

成体の海馬ニューロン新生を研究する上で避けられない重要な側面は、活性化された神経幹細胞が完全に機能するニューロンになる過程で通過する別々の段階を特定することです。このプロセスでは、静止神経幹細胞が活性化され、一連の初期活性および後期活性前駆細胞タイプを通過します(図1)。これらの神経前駆細胞の異なる集団は、形態と、RGLのそれぞれの前駆細胞タイプへの変換を導くMCM2、ネスチン、Tbr2、ダブルコルチン(DCX)、NeuNなどの分子マーカーの発現によって同定できます。ネスチンは、放射状グリア様細胞と一部の初期前駆細胞タイプに発現する中間フィラメントタンパク質です。別のマーカーは、増幅前駆細胞に特異的に発現するTbr2です。Tbr2導入遺伝子の発現は、最初にタイプ1細胞(橈骨グリア様)でオフになり、タイプ2a、タイプ2ab、およびタイプ2bの前駆細胞全体でオンになり、より分化したタイプ3および未成熟ニューロンの間でスイッチオフされます(図1)。DCXは、Type-2ab、Type-2b、およびType-3神経前駆細胞に発現するニューロン移動マーカーです。この3つのマーカーの組み合わせを使用して、神経前駆細胞の異なるサブタイプをラベル付けできます。これらには、タイプ1(MCM2 + nestin + Tbr2-)、タイプ2a(MCM2 + nestin + Tbr2 +)、タイプ2ab(一部MCM2 + nestin-Tbr2 +および部分MCM2 + Tbr2 + DCX-)、タイプ2b(MCM2 + Tbr2 + DCX +)およびタイプ3(MCM2 + Tbr2-DCX+)が含まれます。 未成熟ニューロンや機能統合ニューロンなどの有糸分裂後細胞は、DCXと成熟ニューロンマーカーであるNeuNを利用することで同定できます。

従来のIHCの方法は、遺伝子発現に基づいて特定の細胞タイプの抗原を特定するために抗体を利用します。その後、共焦点顕微鏡などの高解像度イメージング技術による可視化を、それらの同定に利用することができます。しかし、現在、これらの方法には、放射状グリア様細胞や初期の前駆細胞タイプを効率的に同定できない問題があります。これらの特定の細胞タイプを特定することは困難ですが、これは、適用された抗体がネスチンタンパク質に浸透して効率的に結合することができないためです。ネスチンは、放射状グリア様細胞によって産生される放射状突起を構成する中間フィラメントタンパク質です。抗体の抗原への非効率的な結合は、固定時間、温度、および利用される技術を含む多くの要因の結果であり得る6-7。 そこで、私たちは抗原賦活化法、すなわち「煮沸」法を開発しました。ネスチン以外にも、この抗原賦活化法は、Ki67、BrdU、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、Tbr2、MCM2などの他のマーカーの染色も改善します。私たちの方法は、化学的アプローチと物理的アプローチを組み合わせたものです。これには、パラホルムアルデヒドへの組織の化学的固定と、それに続く変性剤およびカオトロピック処理の緩衝液中の薄い冠状海馬切片の高温沸騰が含まれます。これにより、抗原の抗体へのアクセシビリティが向上し、抗体特異性が向上し、前駆細胞タイプの同定が向上します。私たちのアプローチは使いやすく、ほとんどの場合、研究室ですでに利用可能なツールと試薬が必要です。私たちは、神経幹細胞の発生と、内因性遺伝的または外因性環境因子8を介した神経幹細胞の制御を研究するために広く利用してきました。

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プロトコル

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1. 免疫組織化学前:灌流と組織学

  1. マウスに適合した一般的な心筋プロトコルに従ってマウスを灌流し、脳を4%パラホルムアルデヒド(PFA)9に抽出します。
  2. 脳をPFAに4°Cで一晩放置します(例:PFAで満たされた10 mLの円錐管)。PFAに少なくとも12〜24時間、完全に固定するには36時間以内で保管してください。一晩固定した後、円錐管からPFAを空にしますが、脳は内部に残します。30%のスクロースをチューブに注ぎ、脳を5秒間短時間洗浄して、残留PFAを除去します。最後に、脳を含むチューブに再び30%のスクロースを入れます。脳がチューブの底に沈むまで、脳を4°Cのショ糖に保ちます。
  3. ミクロトーム上で40μmの脳切片を切断します。マウスの脳アトラスを参照して、歯状回の始まりから終わりまでのセクションの収集を開始します。切片を不凍液(簡単なレシピは、スクロース300 gを500 mLの0.1 M PBSおよび300 mLのエチレングリコールに溶かします)で免疫組織化学の準備ができるまで保存します。
  4. 切断した組織を、組織に強く接着するように特別に設計された顕微鏡スライドに取り付けます。これらのスライドは、沸騰段階で組織を強力に保持します。ティッシュを取り付けた後、スライドを10分間、または完全に乾かすまで乾かしてください。スライドを下端にペーパータオルで置いた垂直面にスライドを置くと、乾燥を早めることができます。複数のスライドが取り付けられている場合、次のステップに進む準備ができるまで、その時間(1〜2時間で問題ありません)は他のスライドを乾燥させておくことができます。
  5. スライドが乾いたら、PBSで5分間ずつ3回洗浄し、再度乾燥させます(PBSバッファー= 0.137 M NaCl、0.0027 M KCl、0.0119 M Na2PO4)。これにより、以前の化学物質(凍結防止剤のグリセロールなど)が十分に除去され、スライドへの組織の接着が損なわれることはありません。

2. 試薬とマイナー機器の準備

  1. 組織切片を煮沸する溶液A(0.1 Mまたは19.21 g / lクエン酸)と溶液B(0.1 Mまたは24.9 g / lクエン酸トリスナトリウム)を調製します。
  2. メスシリンダーで、9 mlの溶液Aと41 mlの溶液Bを混合し、この混合物に450 mlのddH2Oを加えます。.
  3. この混合物を、電子レンジで安全な空の容器(空のピペットチップボックスなど)に注ぎます。

3. 熱による抗原賦活化

  1. ステップ2で作った溶液を標準設定で5分間、標準電子レンジで沸騰させます。溶液は100°C以上で沸騰し始めます。
  2. 沸騰が完了したら、容器を電子レンジから慎重に取り出し、乾燥したスライドを入れて、海馬部分のあるスライド面が下を向いて液体に完全にさらされていることを確認します。可能であれば、スライドをボックスの壁に対して斜めに置き、その周りに他のスライドを積み重ねます。ボックス内の「フィット感」がしっかりと固定されているため、スライドが互いに重なって移動する余地がないようにします。
  3. この混合物をスライドで電子レンジの標準設定で7分間沸騰させます。この間、溶液は100°C以上で沸騰します。
  4. この沸騰段階で、2つの氷バケツを半分氷で満たします。
  5. ステップ3.3の沸騰が完了したら、容器を電子レンジから取り出し、氷のバケツの1つに入れます。もう一方のバケツから残りの氷を容器全体に注ぎ、完全に覆います。1時間放置します。

4. 一次抗体と二次抗体の染色

  1. 1時間の待機期間が終了したら、スライドを容器から取り出し、TBS-Tバッファーで3回、それぞれ5分間洗浄します。これらの基本的な洗浄を行うために、任意の装置を使用してもよい。(バッファーTBS = 50 mM Tris HCl、150 mM NaCl、TBS-T = 0.05% Triton X-100 TBSバッファー、TBS-TT = 4% ロバ血清TBS-Tバッファー)。
  2. 洗浄後、スライドを暗い場所(ベンチの引き出しの中など)で5〜10分間、またはスライドが完全に乾くまでスライドを傾けて乾かします。この期間中、一次抗体を一晩染色するためのチャンバーを調製します。単純な染色チャンバは、ddH2Oで満たされた大きな表面積を有する容器と、容器内のステージを含んでもよく、その上にスライドをddH2Oの上に置いてもよい。
  3. スライドが乾いたら、撥水ペンを使用してティッシュ部分の周りに輪郭を描きます。ステップ4.5では、このアウトラインが抗体混合物が流れ込むのを防ぐバリアとして機能します。
  4. TBS-TTで一次抗体混合物を調製します。例えば、抗体ストックが1:500の濃度にある場合は、TBS-TTの500μlに特定の抗体を1μl加えます。試薬表に記載されている一次抗体を利用します。
  5. 乾燥させたスライドをステージ上部の染色チャンバーに置きます。一次抗体500μlをゆっくりと加え、表面全体を覆います。装置全体を覆い、アルミホイルで包んで外光を遮断します。室温で一晩放置します。
  6. 翌日、スライドをTBS-Tバッファーで3回、5分間ずつ洗浄します。手順4.2で説明したように、暗い場所で乾かします。
  7. ステップ4.4と同様に二次抗体混合物を調製します。二次抗体については、試薬表を参照してください。
  8. ステップ4.2および4.5で説明したように、乾燥させたスライドを染色チャンバーに入れます。二次抗体500μlをゆっくりと加え、表面全体を覆います。染色チャンバーをアルミホイルで包み、外光から保護します。蓋をして外光から保護し、室温で少なくとも2時間
    9. 放置します。
  9. 二次染色終了後、スライドをTBS-Tバッファーで各5分間、3回洗浄します。暗い場所でスライドを乾かします。乾燥後、埋込液を投入し、気泡の入らないようにスライドをカバースリップで覆います。スライドを暗い場所に少なくとも2時間置いてから、次の分析を行います。
  10. 染色された組織に対してタイムラプス解析または共焦点解析を実行します。

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結果

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成体海馬の神経新生は連続的なプロセスであり、各段階における代表的な前駆細胞型は、複数のマーカーを組み合わせることで特定できます。適切な化学的固定と抗原リトリーバルを行うことで、通常では検出が困難なマーカーの有効性とアクセシビリティを向上させることができます。その一つがnestinであり、これは放射状グリア様神経幹細胞および一部の初期活性前駆細胞型で発現しています。幹細胞や前駆細胞がその後に成熟ニューロンへと分化するとnestinの発現が消失するため、nestinは初期前駆細胞型を特定するための重要なタンパク質となります。

SGZで起こる成人海馬神経新生の連続的なプロセスの概略図をFigure 1Aに示します。このプロセスは、有糸分裂期と有糸分裂後期の段階に分けられます。同定を可能にする遺伝子マーカーが、その発現スペクトルにわたって示されています。放射状グリア様神経幹細胞は、GFAPおよび、放射状突起を構成する中間フィラメントタンパク質であるnestinの発現によって同定できます。静止期および活発に分裂している放射状グリア様細胞は、有糸分裂前駆細胞型...

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ディスカッション

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抗原回収と前駆細胞型の染色を成功させるための最も重要なステップは、1)最適な冠状膜の厚さの十分に灌流され固定された組織を利用することです。2)抗原回収中の沸騰とその後の冷却に十分な時間を確保する。3)固定冠状切片を取り付け、その際の損傷を防ぐ手先の器用さ。

IHC では、十分な固定を受けたが過剰固定ではない灌流組織を使用することが重要です。主な問題は、抗原が抗体にアクセスできないことです。私たちの方法は、アクセシビリティを向上させるように設計されています。最初のステップとして、手術中およびその後の固定中に動物に正しく灌流することが不可欠です。私たちのプロトコルでは、脳を抽出する前に、4%PFAを少なくとも5分間動物を通して灌流させます。その後、抽出した脳を4%PFAで少なくとも12時間、最大24〜36時間放置することが重要であると考えています。これはPFAの最適な期間であり、期間が長いと組織が過剰に固定され、より多くのタンパク質架橋が導入される可能性があります。PFA 固定後、脳は組織の生存率に影響を与えることなく、無期限にスクロース中に放置される可能性があります。組織学的分析の準...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

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この方法論はもともと、ジョンズ・ホプキンス大学医学部神経内科細胞工学研究所のHongjun Song博士の研究室で開発されました。この研究は、NIMH(R00MH090115)、NARSAD、Fraternal Order of Eagles' Mayo Cancer Research Fund、M.H.J.に授与されたメイヨー財団からのスタートアップパッケージ、およびA3014385韓国国立研究財団(NRF)を通じての基礎科学研究プログラムによって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
SuperFrost Plus スライドフィッシャーブランド12-550-15沸騰時に海馬組織に強く付着します
PVA/DABCO 封入剤Sigma Aldrich10981-100 ml
ネスティン (鶏肉) アベスラボNES神経幹細胞マーカー
GFAP (ウサギ)Dako North AmericaZ033401-2アストロサイトおよび神経幹細胞マーカー
MCM2 (マウス)BD Transduction Laboratory610701増殖マーカー
DCX (ヤギ)Santa Cruz BiotechnologySC8066未熟ニューロンマーカー
Tbr2 (ウサギ)AbcamAb23345増幅前駆細胞マーカー
NeuN (マウス)ミリポアMAB377成熟ニューロンマーカー
Cy2 (抗ウサギ)Jackson Immunoresearch111-226-047
Cy2(抗チキン)ジャクソン・イムノリサーチ303-165-006
Cy5(抗マウス)ジャクソン・イムノリサーチ315-175-047
Cy5(抗ヤギ)ジャクソン・イムノリサーチ305-165-047
DAPIライフテクノロジーズコーポレーションD1306
ダコペンS2002コ撥水ペン
ダ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).
  2. Santarelli, L., Saxe, M., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301 (5634), 805-809 (2003).
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