発現イオンチャネルの研究のための特定の感覚ニューロン集団の同定

サマリー

求心性感覚ニューロンは、末梢から中枢神経系への感覚情報の信号伝達を行います。特定の求心性ニューロンを特定することは、それらの生理機能を理解するのに役立ちます。求心性ニューロンを同定するための逆行性標識の方法を説明し、パッチクランプ電気生理学および免疫細胞化学を使用して、これらのニューロンの電位依存性イオンチャネルを研究します。

要約

感覚ニューロンは、体のさまざまな部分から中枢神経系に信号を伝達します。これらのニューロンの体細胞は、脊柱を覆う後根神経節にあります。これらの感覚求心性ニューロンによって発現される受容体とチャネルを理解することは、疾患の新しい治療法につながる可能性があります。最初のステップは、関心のある感覚ニューロンの特定のサブセットを特定することです。ここでは、蛍光色素DiI(1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩)を用いた逆行性標識により、筋肉を神経支配する求心性ニューロンを同定する方法について述べる。イオンチャネルが筋求心性神経の興奮に寄与していることを理解することは、末梢血管疾患や心不全などの特定の疾患状態によって引き起こされる過剰な興奮性をより適切に制御するのに役立つ可能性があります。これらのニューロンによって発現される電位依存性イオンチャネルを特定するために、パッチクランプ電気生理学と免疫細胞化学の2つのアプローチを使用しました。電気生理学と薬理学的ブロッカーを併用することで、機能的なイオンチャネルのタイプを特定できますが、免疫細胞化学を使用して、特定のブロッカーが利用できないチャネルを特定し、細胞集団のイオンチャネル分布パターンをより深く理解しました。これらの手法は、特定のニューロン群を研究するために、神経系の他の領域に適用することができます。

概要

背根神経節(DRG)は、体のさまざまな部分を神経支配する求心性ニューロンの体細胞で構成されており、異なる神経支配標的^を持つ感覚ニューロンを研究することから重要な洞察を得ることができます1。求心性ニューロンを単離し同定するために、例えば、フルオロゴールド¹のようなマーカーを神経に注入する、外科的方法²によって筋肉に染料を注入するなど、さまざまな間接的または侵襲的な方法が使用されます。ニューロンや神経管の標識に成功したさまざまな色素のうち、DiIのような蛍光色素は、ニューロン末端による急速な取り込み、ニューロンの長期保持、およびニューロン間の移動の欠如により、神経解剖学的トレースに^{広く使用されています3。}DiIで標識された求心性ニューロンは、蛍光顕微鏡を使用して簡単に視覚化でき、詳細な研究が可能です。しかし、1つの制限は、DiIのようなマーカーが、細胞内エピトープを用いた免疫細胞化学に必要な細胞透過化中に細胞から失われる^{可能性があることです4}。ここでは、骨格筋にDiIを注入してDRGの筋求心性ニューロンを特定する方法を説明します。また、細胞内エピトープへの抗体アクセスを可能にしながら、ニューロンにDiIを保持する細胞透過化法についても説明します。これらの同定されたニューロンを研究するために、パッチクランプ電気生理学と免疫細胞化学の両方を使用することを実証するとともに、ニューロンの興奮性を制御するイオンチャネルを研究する際の各手法の明確な利点について説明します。最後に、電気生理学的データの解釈を妨げる可能性のある問題について説明します。これらの方法を使用して、筋肉および皮膚求心性ニューロンを同定し、これらの同定されたニューロン8で発現する電位依存性ナトリウム(NaV)チャネルを決定し^ました。しかし、これらの方法は、特定の標的組織または脳核を神経支配するニューロンの同定されたサブセットを研究するためのさまざまな調製物に適合させることができます。

プロトコル

注:すべての動物の作業は、施設および動物の世話のガイドラインに従って行われなければなりません。

1. 動物の準備と表示

1. ラットに麻酔をかける:ケタミン(50 mg / kg体重)、キシラジン(5 mg / kg)、アセプロマジン(1 mg / kg)の混合物の腹腔内注射を使用して、ラット(通常は150〜400 g)に麻酔をかけます。.足をつまんで反射神経を確認し、反応がなくなるまで待ちます。麻酔反応は動物によって異なるため、疼痛反射をテストして麻酔薬の効果を判断するのが最善です。
2. DiI溶液:DiI粉末を秤量し、滅菌100%DMSOに溶解して1.5%溶液(15 mg / ml)にします。溶液は、使用するまで乾燥した雰囲気で室温で保存してください。
3. DiI注射:電気カミソリを使用して、麻酔をかけたラットの両足のふくらはぎ部分の毛を剃ります。
   1. 1 mLの滅菌シリンジ(11/4 in 27 G針)に200 μlの1.5% DiI溶液を入れます。各腓腹筋の長軸に平行に針をゆっくりと挿入し、針を筋肉からゆっくりと引き出さずに(~10秒)筋肉から引き抜きながら、100μlのDiIを筋肉に注入します。
   2. 針を筋肉から引き抜く前に、シリンジプランジャーを引き戻して染料が先端から流れなくなったことを確認し、10秒待ってから針を筋肉から引き抜きます。このステップにより、針から皮膚へのDiIの漏れを防ぎ、皮膚求心性神経をラベル化する可能性があります。
   3. 他の脚についても繰り返します。
   4. DiIが筋肉からDRGに輸送されるまで4〜5日かかります。

2. 解剖と神経細胞の分離

1. ソリューション：
   1. 製造元の指示に従って、ハンクスバランスソルトソリューション(HBSS)とアールズバランスソルトソリューション(EBSS)を調製し、ろ過滅菌して4°Cで保存します。
   2. 培地(MEM Plus):89 mLのミニマルエッセンシャル培地(MEM)、10 mlのウシ胎児血清(FBS)、1 mlのペニシリン-ストレプトマイシン溶液を混合し、ろ過滅菌し、4°Cで保存します。
   3. ポリリジン溶液:ポリ-L-リジン臭化水素酸塩粉末(10 mg / 100 ml)を0.1 Mホウ酸ナトリウム溶液(pH 8.4)に溶解し、アリコートを-20°Cで滅菌および保存します。
2. コーティングカバースリップ
   1. ガラスカバースリップ(丸12 mm)を70%エタノールで3〜4時間清掃し、滅菌培養フードで風乾します。
   2. 乾燥させたカバーガラスをポリリジン溶液O / Nに入れます。
   3. ポリリジン溶液から取り出し、滅菌蒸留水で2回、それぞれ5分間洗浄して、余分なポリリジンを取り除きます。
   4. カバースリップを分離し、培養フードで乾燥させ、4^°Cで保管します。
3. 解剖のためのセットアップ
   1. 10 mlのHBSS、35 mmのシャーレ、100 mmのシャーレを入れたビーカーを氷の上に置きます。
   2. 酵素を秤量します:コラゲナーゼ7 mg、DNAse1 mg、トリプシン10 mg。
   3. 振とう水浴を37^°Cに予熱し、10mlのEBSSを含む15mlの遠心分離管を浴に入れて温めます。
4. 解剖：
   1. IACUCが承認したプロトコルに従ってラットを犠牲にしました。C二酸化アルボンは、ラットを安楽死させるために使用されました。
   2. 背中の皮膚を切り開いて背中をすばやく取り除き、脊柱に沿った結合組織と筋肉組織を取り除き、露出を良くし、脊柱の腰部(胸部から腸骨の端;図1)。
   3. 分離した脊柱を100mmのシャーレに入れ、滅菌パスツールピペットを使用して冷やしたHBSS溶液を塗布し、調製物を湿らせて冷たく保
   ちます。
   4. 脊柱の側面から筋肉を切り取ります。ロンジャーまたはハサミを使用して背側椎弓切除術を行い、DRGを含むくぼみを囲む骨をそっと取り除きます。
   5. この手順では、氷のように冷たいHBSS(~1 ml)を繰り返し塗布します。
   6. 末梢神経と中枢神経を切断してDRGを分離します(神経節の取り扱いを容易にするために1〜2 mmの神経を残します)
   7. 分離されたDRGを、氷冷HBSSバッファーを含む35mmペトリ皿に入れます。
   8. すべての L-4 と L-5 DRG が分離されるまで繰り返します。胸部DRGは、DiIラベリングのネガティブコントロールとして分離および個別に処理できます。
   9. 分離されたDRGを入れた皿を解剖顕微鏡の下に置き、マイクロハサミと鉗子を使用して余分な神経と血管を取り除きます。
   10. 酵素への曝露を改善するためにDRGを切り開きますが、DRGを脱皮しないでください。
5. DRGニューロン解離:
   1. 温かいEBSS培地(ウォーターバスに保管)に酵素を加えます。短時間振とうして溶解し、ろ過滅菌します。
   2. 滅菌パスツールピペットを使用して、すべてのDRGを酵素溶液に入れます。DRGと添加するHBSSの量は最小限に抑えます。HBSSは酵素混合物を希釈します。フラスコに95%のO₂と5%の_CO2を60秒間入れてから、フラスコにしっかりと蓋をします。
   3. フラスコを37°Cに設定した振とう水浴で60分間、240rpmでインキュベー
   トします。
   4. インキュベーションの終わりに、フラスコ50xを激しく振ってDRG⁵を解離します。
   5. 無菌条件下で、5 mlのMEM Plusをフラスコに加えて酵素を停止します。.
   6. フラスコの内容物を滅菌済みの15 mL遠心チューブに移し、16 x gで6分間遠心分離します。
   7. 上清を取り出して廃棄し、サンプルに5 mlのMEM Plusを加えます。ピペットでやさしく三つ折りにして、ペレットを砕きます。
   8. 遠心分離ステップを繰り返し、上清を取り除いて廃棄し、500 μlのMEM Plusを加えます。1 mLのピペットチップをピペットに載せて静かに粉砕し、細胞懸濁液を作製します。
   9. ポリリジンコーティングされたガラスカバーガラスカバーガラスを空の滅菌35mm皿に入れます。細胞懸濁液を1滴(~50 μl)カバーガラスの中央に加えます。
   10. 細胞溶液がなくなるまで繰り返します。
   11. 35 mmのディッシュを37°Cおよび5%_CO2インキュベーターに1時間入れ、ニューロンがカバースリップに付着します。
   12. 各皿にさらに2mlの培地を加え、インキュベーターに戻します。

3. パッチクランプ録音

1. 記録用ソリューション:これらのソリューションは、NaV電流を記録するためのものです。組成が異なる溶液の例は、これらの参考文献^5〜7に記載されています。
   1. 外部溶液:(mM)45 NaCl、100 N-メチル-d-グルカミン(NMG)•Cl、4 MnCl₂、10 Na•HEPESおよび10グルコース、pH = 7.4、浸透圧= 320 mOsm。
   2. 内部溶液:(mM)104 NMG•Cl、14クレアチン•PO₄、6 MgCl₂、10 NMG•HEPES、5 Tris•ATP、10 NMG₂•EGTA、および0.3 Tris₂•GTP、pH 7.4、浸透圧= 300 mOsm。
2. イオン電流の測定:
   1. ガラスキャピラリーから電極プーラーで記録電極を引っ張り、マイクロフォージで先端をヒートポリッシュします。電極の抵抗は通常2〜3MΩです
   2. 落射蛍光顕微鏡とTRITCキューブを使用して、DiI標識DRGニューロンを同定します。DiIの励起波長は550nm、発光波長は570nmです。
   3. ガラス電極に内部溶液(電極先端のファイリング~1cmのみ)を充填し、軽くたたいて閉じ込められた気泡を取り除きます。電極ホルダーに入れ、マイクロマニピュレータで細胞上に移動します。
   4. 電極が細胞に触れたら、吸引チューブを介して、密閉性が形成されるまで穏やかに吸引します(電極抵抗の増加によって決定されます)。
   5. メンブレン電圧を目的の保持電位(通常は-60〜-120mV)でクランプします。
   6. 電極の先端にあるメンブレンパッチを除去するために、より強い吸引力を加えることにより、全細胞パッチクランプ構成を取得します。全細胞構成への移行は、容量性電流^8-10の増加として電気的に観察される。
   7. パッチクランプアンプの補償回路を使用して直列抵抗を補償します(少なくとも80%の補償を使用してください)^8,10。

4. 免疫細胞化学

1. カバーガラス上のニューロンを4%パラホルムアルデヒドで1時間固定し、次にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の2%Tween 20で10分間透過処理します。
2. 固定細胞O/Nをブロッキング溶液(正常血清またはウシ血清アルブミン)と、目的の特定の抗原に結合するように開発された抗体である一次抗体でインキュベー
トします。
3. ニューロンO/Nのコントロールセットを、一次抗体を欠くブロッキング溶液でインキュベートします。
4. カバースリップをPBSバッファーで5分間3回洗浄した後、1% Tween 20で5分間を2回洗浄して、結合していない一次抗体を除去します。
5. 適切な蛍光タグ付き二次抗体でカバースリップをインキュベートし、コントロールします。これにより、一次抗体に結合して可視化できます。
6. カバーガラスをPBS 3xで5分間洗浄し、余分な二次抗体を除去します。
7. 封入材を使用して、カバースリップをきれいなスライドガラスに取り付けます。
8. カバーガラスの端に透明なマニキュアを塗って所定の位置に固定します。乾いたら、ニューロンを視覚化し、蛍光顕微鏡に付属のソフトウェアを使用して画像をキャプチャします.
   注:この研究では、ニコンの顕微鏡とNIS-elements BR 3.2ソフトウェアを使用しました。露光時間は最適化され、コントロールスライドとテストスライドで同じに保たれました。
9. ImageJ(rsbweb.nih.gov/ij/index.html)などのイメージングソフトウェアを使用して、個々のニューロンからの蛍光強度と細胞サイズを測定します。

結果

ここで説明した方法を使用して、DRGの筋求心性ニューロンを特定し、これらのニューロンによって発現される電位依存性ナトリウムチャネル(NaV)を決定しました。DiI標識筋求心性ニューロン(図1C)は、DRGのニューロンの全集団のごく一部を占め、ニューロンの平均16%(167/1047)が標識されました。定量化は、まずImageJを使用して蛍光を測定し、強度データのヒストグラムをプロットして、正に標識されたニューロンの閾値を決定することによって行われました。閾値は、ガウス分布を非標識ニューロンの大きなピークに当てはめることによって決定され、これにより平均強度と標準偏差(SD)が得られました(図1D)。閾値レベルは、平均強度に2x SDを加えた値に設定され、強度>閾値を持つニューロンは^11,12とラベル

付けされます。

電気生理学:

パッチクランプ記録では、明らかな神経突起(ニューロンの成長)がない、明るくラベル付けされた孤立したニューロンを選択...

ディスカッション

上腕三頭筋に由来する筋求心性神経 (例: 腓腹筋) は、運動昇圧反射 (EPR) を調査するために複数の研究で使用されています ¹³。EPRを媒介する感覚ニューロンの研究に関心があることから、腓腹筋が色素注入のために選択されました。DiIは、その親油性の性質と、無傷の原形質膜を通る拡散によってニューロンから失われないため、選択されました^3,14。この方法をガイドとして使用すると、関心のある標的臓器に色素を注入して、神経支配する求心性ニューロンを特定できます。文献検索により、最適な注射部位と分離するDRGを見つけるために必要な情報が得られます ^13、15、16。

DiIの注入は、目的の組織のみを注入するように注意する必要があります。染料が組織内に十分に分散していることを確認することも重要です。筋肉の縦軸に沿って注入することで、筋肉内の色素分布を最適化しました。筋肉に針を挿入し、筋肉に沿って針を引き抜きながら注射を行います。針を筋肉から外す前にシリンジプランジャーをそっと引き戻すことで漏れを防ぎ、染料が...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 and 1.9	Alamone Labs, Jerusalem, Israel	ASC- 001/ 009 /008 /017
Alexa Fluor Fluor secondary antibodies	Invitrogen
Normal goat serum
Fluoro-Gel	Electron Microscopy Sciences	17985