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方法論記事

低温電子断層撮影法を用いて凍結 - 和状態で神経突起を可視化するための一次ニューロンの調製

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DOI:

10.3791/50783

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2014年2月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, University of California at San Diego, 4National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

この記事について

サマリー

超微細構造解析のための神経突起を維持するために、我々は、ガラス質氷の層に懸濁したサンプルを得瞬間冷凍に続く電子顕微鏡グリッド上に、一次ニューロンのメッキのためのプロトコルを記述します。これらのサンプルは、ナノメートルスケールでの構造を可視化するために低温電子顕微鏡で調べることができる。

要約

神経突起、樹状突起と軸索の両方が、神経細胞間の電気的インパルスの伝導を可能にする神経細胞の細胞プロセスである。神経突起の構造を定義すると、これらのプロセスは、シナプスのコミュニケーションをサポートする材料や信号を移動させる方法を理解することが重要です。電子顕微鏡（EM）は、伝統的に、神経突起内の超微細構造の特徴を評価するために使用したが、脱水、包埋樹脂中の有機溶媒への曝露は、構造を歪ませることができる。重要な満たされていない目標は、成果物の影響を受けていない構造的な評価を可能にする手順の製剤である。ここでは、成長していると低温電子断層撮影法（クライオ-ET）との試験に続いて、電子顕微鏡グリッド上の別の一次ニューロンのフラッシュ凍結全体の神経突起のための詳細かつ再現性のあるプロトコルを確立している。この技術は、ASSEを容易にする、ナノメートル分解能での凍結、水和した神経突起の3次元視覚化を可能にするその形態学的差異のssment。我々のプロトコルは、後根神経節（DRG）神経突起とそのネイティブに近い状態での海馬神経突起の可視化の前例のないビューが得られます。このように、これらの方法は、通常の神経細胞と神経疾患の影響を受けたものの両方の神経突起上の今後の研究のための基盤を作成します。

概要

ニューロンは、下流の神経細胞と通信するために、多くの場合、非常に長い、情報および軸索を受け取るために樹状突起を工夫することにより、中枢神経系および末梢神経系の機能のために複雑な回路が必要不可欠確立。神経突起伸長は、神経突起の胚発生と神経分化やメンテナンス時の基本的な役割を果たしている批判的に神経系の機能をサポートしています。神経突起は、神経の損傷と再生だけでなく、神経系疾患で批判的に備えています。神経細胞の建築の研究では、正常および疾患脳の両方を理解することが重要である。幸いなことに、生理学的に関連する神経細胞培養系は、複雑な異種の細胞構造を再現することができますが存在する。固体実験プラットフォームの解明に基づいて、ニューロン形態の定性的および定量的分析を可能にする効果的な可視化戦略が必要とされている。特に有用なのだろうナノメートルスケールでの神経突起、軸索と樹状突起の両方を可視化するための一貫性のあるプラットフォームを提供し、詳細な方法論であること。

伝統的な電子顕微鏡検査は、それらの真の状態から試験片の歪みを誘発することができ、脱水、包埋樹脂中の有機溶媒の使用を必要とする。従って、4,9,25所見の解釈を制限する-これまでに、ナノメートルスケールで最も構造的特徴付けは、このような過酷な化学物質にさらされる大きな細胞または組織に基づく。また、電子ビームの浸透のために、切片を1μm12よりも大きい厚さを示す生物または細胞の突起に必要です。最後に、神経突起の細長い特徴の面倒な定義を作り、個別のスライスのデータ·セットのコレクション、組織切片または結果を粉砕した。偶数クライオEMのために、凍結した水和試料を切片化することが可能である、本方法は、圧縮を導入ARTIF行為1。

近年では、研究者は、その後、凍結ET 8,10,18,23を使用して神経突起を可視化するために、EMグリッドとフラッシュ凍結して液体エタン中に直接海馬ニューロンを成長させる方法を学びました。しかし、このような研究は、カスタムメイドの装置10,23、または日常可視化8,18ための十分薄いガラス質氷を生成するためのブロッティング手順の欠如詳細を使用するか。例えば、ある研究では、EMグリッド10をブロッティングに30〜40秒を使用することを推奨していますが、この値は、一般的な使用のためではない最適化されたが、そのカスタムメイドプランジ凍結デバイスに固有のものです。プランジ凍結にサンプルを前に湿度を維持するためのカスタムメイドのデバイスではなく、市販の1 17を使用すると、広範囲に再現するためのハードルを提起することができます。

これらの研究は低温ETによって神経突起を視覚化する画期的なされてきたが、我々は、APを探索するためにさらに一歩撮影した神経細胞の標本（海馬および後根神経節ニューロン）の様々なクライオ-ETのplicability。さらに、当社は、最適と部分最適の結果だけでなく、1がそのような標本のためにクライオ-ETの使用中に発生する可能性のある潜在的な成果物の両方を議論する。

ネイティブに近い状態に維持し、ナノメートルスケールでの全神経突起を可視化するための詳細な方法を定義することは、超微細構造の研究を行うことがより研究者のための能力を高めるだろう。この目的のために、我々は、神経突起を可視化するために未定着、非染色ニューロンを調製するために、市販の装置を使用して効果的かつ詳細なプロトコルを記載している。これは健全な神経突起の超微細構造を詳述し、構造的な違いは、神経系の疾患モデルに存在しているかを理解するための基礎を築くために向けた重要な第一歩である。クライオETはナノメートルスケールでの3-Dで固定されていない、無染色の神経突起の機能を解決することができますので、この方法は、それが可能であることはありませんようになります神経炎アーキテクチャ12を定義するための前部。

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プロトコル

1。メッキ初代神経細胞のためのEMグリッドの料理を準備する

  1. 少なくとも25倍の倍率で光学顕微鏡を用いて金のEMグリッド上に穴あきカーボンの整合性を検討する。カーボン穴が> 98％で完全な状態であることを確認してください。
  2. 一次ニューロンをめっきするため、EMグリッドを火炎殺菌し、同時にそれらを親水性にするブンゼンバーナーを使用しています。その縁ではなく、中央グリッド面積で、EMグリッドを拾うためにピンセットを使用してください。注意：無人点灯ブンゼンバーナーを離れることはありませんし、次の手順を実行している間プラスチック部品に手袋やピンセットを使用していない。
    1. ブンゼンバーナーを点灯する前に、最低限の開いた位置に空気およびガスの調整を設定します。
    2. ストライカー火打ち石やブタンライターを使用してブンゼンバーナーを点灯。
    3. 背の高い、明るい青/紫の炎内の小さな青い内炎を達成するために、空気やガスの調整を変更します。内炎の先端が炎の最も熱い部分である。下のノブバーナーは、バーナーのバレルに入る空気の量を調整するためにオンにすることができるが、バーナーは、バーナー管に入るガスの量を調整するニース。空気調整を時計回りに回すと（紫の炎を生じる）空気を減少させ、反時計回り（黄色の炎を生じる）空気を向上させます。
    4. カーボン面を上に直面して、二度の炎をすばやく渡すことは、EMグリッドを保​​持するために金属製ピンセット（NOプラスチック部品）を使用。炭素側はより多くのマット（少ない光沢のある）を表示され、他の側よりも灰色がかった色合いのよりとなります。
    5. すぐにブンゼンバーナーの10cm以内に置かガラスボトムディッシュの中央にグリッド（カーボン·サイドアップ）を転送。皿当たり1のEMグリッド（ 図1）を使用します。ガンマ線照射を経由して、すなわち、予め滅菌されたガラスボトムディッシュを、のみを使用しています。
  3. まだガラスボットの中にEMグリッドを維持しながら（完全なカーボン穴）グリッドの整合性をチェックするために光学顕微鏡を使用して、オム皿（汚染を回避するため）。神経細胞と接触するグリッドか何かで任意の物質を適用する場合は、無菌手順及び滅菌ピペットチップを使用しています。
  4. 無菌手順を用いて組織培養フードでは、ペトリ皿の中央ガラス面積をじっくりと適切なコーティング物質を250μlを適用します。適切なコーティング物質は、全体のEMグリッドをカバーしていることを確認してください。
    1. 海馬ニューロンについては、先に説明したように19を調製したコーティング物質としてポリ-L-リジン（PLL、1 mg / mlの）を使用する。お皿ごとに、250μlのは、EMグリッドごとに必要とされていることに注意してくださいので、それに応じたバッチをスケール。後根神経節（DRG）ニューロンの場合は、次のように準備し、コーティング物質として（材料および試薬の表を参照）エンゲルブレス-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物を使用しています。お皿ごとに、250μlのは、EMグリッドごとに必要とされていることに注意してくださいので、それに応じたバッチをスケール。
      1. ストックボトルを解凍4℃で一晩エンゲルブレス-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物
      2. 氷の上で、それらを維持することによって、すなわち、エンゲルブレス-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞、溶液を作るために使用されるすべてのコンポーネントが分泌するゼラチン状のタンパク質混合物を、寒さに保つ。
      3. 氷の上で、1:20希釈を生じる神経基本培地で、このゼラチン状のタンパク質混合物を希釈しながら（ すなわち神経基礎の10ミリリットルにゼラチン状のタンパク質混合物の500μLを希釈）。
      4. 除算は、1ミリリットルのアリコートにゼラチン状のタンパク質混合物を希釈し、すぐに-20℃で余分な分量を保存する
      5. 1.4節で説明したように、ディッシュ当たり、EMグリッドごとに250μLを適用します。
  5. そのトップにシャーレをカバーし、組織培養フード内で室温で1時間（どちらかのPLLに伴う海馬の試験片について、またはDRG標本用のゼラチン状のタンパク質混合物で）インキュベートする。
  6. ASPI（海馬の試料の場合）すべてのPLLまたは皿から（DRG標本用）ゼラチン状のタンパク質混合物を評価する。これを行うために、組織培養フード内の真空システムを使用する。真空管に取り付け、滅菌ピペットチップを使用してください。 EMグリッドとの直接の接触を避ける。
  7. 注意深くEMグリッドが完全にPBSによって覆われるように、各ペトリ皿の中央のガラス領域内にEMグリッドに滅菌PBS（リン酸緩衝生理食塩水）を250μlを適用するために調整可能な空気変位ピペットを使用する。次に、各皿からPBSを吸引除去する。 3回繰り返します。
  8. EMグリッドと料理は15分間組織培養フードの下で乾燥させます。彼らは組織培養室内の光学顕微鏡でチェックすることで、完全に乾燥していることを確認してください。水分の泡がグリッドに存在しないことを確認してください。もしそうであれば、慎重に吸引次のEMグリッドにこの余分な水分を除去する。コー​​ティングされたグリッドは、ニューロンをメッキするため、すぐに使用する必要があります。

2。準備およびP1EMグリッド上に一次ニューロンをating

  1. 以前に19を説明したように、個々の細胞に海馬（または18日齢のラット胚の後根神経節）を解離させるために一次ニューロンは、まず解剖、トリプシン処理（2.5％トリプシンを使用して）粉砕物をめっきする。
    1. 粉末化し、特に火仕上げ先端をガラスピペットを使用することにより、個々の細胞に細胞の解離塊を記述するために神経生物学者によって使用される一般的な用語です。結果は慎重にゆっくりとピペットを介して（〜30）、上下に、複数回のセルを描画し解放することによって達成される。
  2. マウスに適していますが示唆酵素（パパイン、コラゲナーゼ/ディスパーゼ）を使用するのではなく、ラットDRGニューロンを隔離する（HBSS中）0.25％トリプシンを使用するようにノートを取って、以前にDRGの切開および細胞単離24に記載された手順に従ってくださいDRGニューロン。
  3. （ つまり、血球計数器を用いて）単離された神経細胞の数を計算するそしてディッシュあたり50,000個の細胞/ mlの濃度を達成するために、各皿の細胞に適用する適切な体積を計算するためにこの値を使用する。適用する最大音量は250μLです。これが唯一のセントラル硝子エリア全体ではなく、お皿を埋めることに注意してください。
  4. 37℃のCO 2インキュベーターで30分間インキュベート皿細胞が回復して接着させる。
  5. ゆっくりと、EMグリッドを乱さないように注意しながら、各皿に温めメディアの1.5ミリリットルを追加。メディアの種類は、細胞型（海馬もしくはDRG）に依存する。
    1. 海馬ニューロン19又は使用前に37℃の水浴中で加温することにある後根神経節ニューロン24のいずれかのための適切なメディアを準備する。 CO 2インキュベーター内で一晩の料理をインキュベートする。
    2. 海馬ニューロンの場合は、翌日のメディアを変更してください。 14日間、2日毎以降のメディアの半分を変更します。使用前に37℃ の水浴中で媒体を温める。
    3. DRGニューロン、解剖/メッキ、翌日、別々に、それぞれの10mMストック溶液を作製抗有糸分裂剤（ウリジン5'-フルオロ-2'-デオキシウリジン）とメディアの新鮮なストックを調製するために、最終的に使用それぞれについて、10μMの濃度。 DRGメディア（875μL）の半分を取り外し、抗有糸分裂薬との新鮮な培地875μlを加える。
      1. DRGニューロンでは、第一週を2日おきには、別の抗有糸分裂メディアと標準のDRGのメディア間でメディアを変更する。二週間、2日ごとに標準のDRGメディアを変更。

3。 EMグリッド上に神経細胞をガラス化

  1. 湿度室17とガラス化装置のガラス化マシンのファインポイント特殊なピンセット、長いフラットポイントピンセット、液体窒素のデュワー（S）（LN：機器、極低温に金のEMグリッドを凍結保存するためのすべての材料を準備します2）あり、coolantコンテナは、EMグリッドストレージボックス、カルシウムを含まないフィルター紙。
  2. ガラス化デバイスを起動します。 32℃に100パーセントと温度に湿度を設定する「コンソール」セクションでは、ゼロ秒にブロット時間を設定します。これは、ガラス化マシンの湿度室の側窓から手動ブロッティングを可能にします。
  3. 3用紙が積層されているように、それらを重ね、手袋とカルシウムを含まない、ろ紙を処理します。 〜2cmの長さである0.5センチメートル幅のストリップにスタックをカット。紙の一辺が0.5センチメートル×0.5センチメートル面（ 図2）を有するように90°の角度で曲がり、これら。ピンセットを使用して、中紙を取り外し、使用するまで、別のカルシウムを含まない、ろ紙の上に置きます。
  4. ガラス化チャンバー内のボタンホルダーにグリッドストレージボタンを配置。液体窒素で冷却液の容器の内部チャンバーを記入し、完全に蒸発するまで待ちます。目の外室を埋める液体窒素でのE冷媒容器、それが次のステップに進むための安定した温度に達するまで。冷却された室内に液体状態に凝縮した高純度ガス状のエタンと内側室を埋める。
  5. すぐ近くの中にガラス化室への輸送のための大規模な100ミリメートルポリスチレンディッシュに培養器からディッシュ（ES）を移動、そうでない場合。慎重に皿からのEMグリッドを選択する特殊なガラス化ピンセットを使用してください。ニューロンは、EMグリッド上に成長されている側に注意してください。位置は、次のステップのために重要ではあります。しっかりとEMグリッド上ピンセットをロックするピンセットに黒いスライドロックを使用してください。
  6. ガラス化マシンニューロンが離れてガラス化機械の側開口穴から、左に顔を付着した上で、EMグリッドのようにサイドにピンセットを挿入します。ガラス化機械に特化したピンセットを撤回。
  7. 適切なホルダーに冷媒容器を置きますガラス化マシンの。それは、十分なLN 2と液体エタンで満たされるべきである。それは湿度室の底でフラッシュされるまでガラス化マシンの適切な画面のコマンドを使用して、上方向に冷媒室を上げる。
  8. 平坦な点ピンセットで、短辺（0.5センチメートル×0.5センチメートルの面）がピンセットに対して垂直になるように、濾紙の一端を把握する。この面では（ 図2B）をブロッティングのためのEMグリッドと直接接触することになる。慎重にガラス化マシンの湿度室（ 図2A）の側穴にフィルター紙を挿入します。安定的に10秒間（側が試料から離して向いている）、EMグリッドに対する紙を開催しています。その後、紙を破棄して、すぐにガラス化マシンの自動化を使用して液体エタン中で試料をプランジ凍結。
  9. 丁寧に一つのスロットのいずれかに凍結した水和のEMグリッドを転送グリッドストレージのボタン。皿で追加のEMグリッドのためのプロセスを繰り返します。これらの実験で使用したEMグリッドストレージ·ボタンは、複数の凍結水和EMグリッドを格納することができる。

4。画像収集、処理、および注釈

  1. 2-D型電子顕微鏡写真および/ ​​または低用量条件下で低温電子顕微鏡を用いて神経突起の3-Dのチルト系列5を収集するように進む。 2-D画像は3-Dのチルト系列のために有用であると氷の厚さおよび可能な領域の点でグリッドの質を評価することを意図した。
    1. この場合、すべての画像は/ 7程度と4.4オングストロームのサンプリングのアンダーフォーカスターゲットで20K顕微鏡の倍率で、シングルチルト液体窒素クライオ転写ホルダーを装備した200 kVの電子顕微鏡に装着4K X 4K CCDカメラを用いて収集したピクセル。
    2. 徐々にサンプルらを傾けながら、サンプルの3D断層像を得るためには、投影画像のシリーズを取る透過型電子顕微鏡（TEM）の一つの軸オング。チルト角や他の実験的な設定を考慮すると、自動的にチルトシリーズ5を収集するために利用できる複数の異なるソフトウェアがあります。ここに示した3-Dチルト一連〜60電子/Å2の累積線量で5℃刻みで60°〜-60°の範囲にわたって半自動チルト系列取得ソフトウェア26を使用して、同じ顕微鏡で収集した。
  2. 以前に他のサンプル5,29について記載したように画像処理ソフトウェア21を使用して、神経突起の傾き系列を再構成する。
  3. 最初の断層像をセグメント化し、以前に記載のように5 3-D画像処理ソフトウェアを用いた表面モデルを作成することにより、神経突起の3-Dの機能カラー·アノテーション。

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結果

クライオET経由凍結イメージング、光学顕微鏡像の前には、神経細胞が成長しているのEMグリッドの注意が必要です。神経突起は、互いにかなりの重複せずにはっきりと見えるはずです。 図3Aのカラーボックスは、ズームインされる神経突起グリッドの格子を横切って延びている図3Bのより高い倍率を表示するために領域を表す。各グリッド正方形は、神経細胞とその神経突起をサポートする穴あきカーボン膜で構成されている。これらの穴は外側に突出し神経突起、そこから比較的大きく、暗い、電子密度の高い物体（ 図3C）、などのニューロン体を示している4K倍率で撮影された低用量低温電子顕微鏡画像で明らかである。

炭素の穴の上に載って神経突起の一部は、図3Cに着色されたボックスで選択し、ズームアップ高倍率（20K）で、図3Dにされている。このプロトコルに従うことによって生成されるように、この倍率では、微小管、小胞、ミトコンドリアなどの明確な内部細胞構造は...

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ディスカッション

我々は、ラット胚性ニューロン（後根神経節および海馬）は金電子顕微鏡（EM）グリッド上に成長した2-DクライオEM及び3-Dクライオを用いて撮像されるそれらの神経突起のために十分に薄いガラス質氷中で凍結することができることを示してET。海馬の神経突起が以前に凍結ET 8,10,18,23を使用して画像化してきたが、市販の装置を使用して正常なレプリケーションのための十分な詳細なプロトコルが欠けていた。彼らの研究は、海馬の神経突起を可視化するためのクライオ-ETの使用を開拓しているが、さらに、我々の研究は、神経標本の複数のタイプにクライオ-ETの適用可能性を探る。

ここでは、EMが最適に薄い氷を達成するためにそれらを吸い取り、海馬および後根神経節（DRG）ニューロンのいずれかでグリッド準備詳細なプロトコルを記述し、プランジ凍結クライオ-ETによる撮影のためにそれらを。最適なブロッティング時間は、氷中で電子ビームが貫通するために厚すぎもたらさないものであるガラス質氷が穴あき炭素の端から穴あき炭素の最も内側に著しく異なる勾配で表示されていることも薄すぎる。さらに、ガラス...

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

本研究は、NIHの助成金（PN2EY016525とP41GM103832）によって支えられてきた。 SHSは湾岸コンソーシアム（NIH認可番号T32EB009379）の学際的バイオサイエンス教育のためのWMケックセンターのナノバイオロジー学際大学院教育プログラムからの交わりによってサポートされていました。

SHSは、解剖し成長し、DRGおよび海馬細胞をガラス化し、低温電子顕微鏡およびDRGと海馬軸​​索の凍結ETデータを収集し、再構成され、チルトシリーズは色注釈付き。 MRGを切開し、MNRの研究室での海馬細胞を提供した。 SCは、チルトシリーズ注釈を支援。 SHSは、神経細胞を分析し、成長する方法についてのCWで訓練された。 SHS、WCMとトイレは実験を考案。 SHSは他の著者からの入力に原稿を用意しました。

このビデオは、TのBiozentrumの細胞イメージングとNanoAnalyticsセンター（C-シーナ）で撮影されました大学バーゼル彼。 C-シーナは、スイスのバーゼルに位置連邦工科大学チューリッヒのバイオシステムズ科学工学部門（D-BSSE）に統合されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
デュモン #7 ピンセット電子顕微鏡科学72803-01EMグリッドの取り扱い用
ガラス底皿MatTek Corp.P35G-1.5-10C成長サンプル用
電子顕微鏡グリッドクォンティフォイルHoley Carbon, Au 200, R 2/2成長サンプル用
カルシウムフリー濾紙Whatman1541-055ブロッティングサンプル用
大型フラットポイントロングピンセットエクセルタコーポレーションE003-000590, 25-SAブロッティングサンプル用 
ガラス化装置とピンセットFEIVitrobot Mark III冷凍サンプル用
ミニグリッド収納ボックスTed Pella, Inc.160-40EMグリッド収納用
クライオトランスファーホルダーガタン626 シングルチルト液体窒素 クライオトランスファーホルダーイメージングサンプル用
半自動チルトシリーズ取得ソフトウェアシリアルEMhttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/イメージングサンプル用
画像処理ソフトIMOD eTomohttp://bio3d.colorado.edu/imod/画像処理用
クライオ電脳顕微鏡日本電子200kV JEM2100 LaB6電子顕微鏡サンプル撮影用
4k x 4k CCDカメラGatanN/Aサンプル撮影用
3DアノテーションソフトVisage Imaging GmbHAmira/Avizo3Dデータ処理
用 2D画像をデジタルスティッチングするソフトAdobeAdobe Photoshop2次元データDMEMの処理
High GlucoseInvitrogen11965-118海馬培養用
ホウ酸Sigma AldrichB-0252海馬培養用
四ホウ酸ナトリウムSigmaAldrich B-9876海馬培養用
Poly-L-lysine シグマ アルドリッチP2636-500MG海馬培養用
フィルターシステムコーニング430758海馬培養用
神経基礎培地Invitrogen21103-049DRG培養用
B-27サプリメントInvitrogen17504-044DRG培養用
ペニシリン/ストレプトマイシンInvitrogen15140-122DRG培養用
GlutaMAXInvitrogen35050-061DRG培養
用組換えラットb-NGFR&DRG培養用556-NG
ウリジンシグマU3003-5GDRG培養用
5'-フルオロ-2'-デオキシウリジンシグマF0503-100MGDRG培養用
マトリゲルBDバイオサイエンス356234DRG培養用
用 Dシステム

参考文献

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