超微細構造解析のための神経突起を維持するために、我々は、ガラス質氷の層に懸濁したサンプルを得瞬間冷凍に続く電子顕微鏡グリッド上に、一次ニューロンのメッキのためのプロトコルを記述します。これらのサンプルは、ナノメートルスケールでの構造を可視化するために低温電子顕微鏡で調べることができる。
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この記事について
サマリー
要約
神経突起、樹状突起と軸索の両方が、神経細胞間の電気的インパルスの伝導を可能にする神経細胞の細胞プロセスである。神経突起の構造を定義すると、これらのプロセスは、シナプスのコミュニケーションをサポートする材料や信号を移動させる方法を理解することが重要です。電子顕微鏡（EM）は、伝統的に、神経突起内の超微細構造の特徴を評価するために使用したが、脱水、包埋樹脂中の有機溶媒への曝露は、構造を歪ませることができる。重要な満たされていない目標は、成果物の影響を受けていない構造的な評価を可能にする手順の製剤である。ここでは、成長していると低温電子断層撮影法（クライオ-ET）との試験に続いて、電子顕微鏡グリッド上の別の一次ニューロンのフラッシュ凍結全体の神経突起のための詳細かつ再現性のあるプロトコルを確立している。この技術は、ASSEを容易にする、ナノメートル分解能での凍結、水和した神経突起の3次元視覚化を可能にするその形態学的差異のssment。我々のプロトコルは、後根神経節（DRG）神経突起とそのネイティブに近い状態での海馬神経突起の可視化の前例のないビューが得られます。このように、これらの方法は、通常の神経細胞と神経疾患の影響を受けたものの両方の神経突起上の今後の研究のための基盤を作成します。
概要
ニューロンは、下流の神経細胞と通信するために、多くの場合、非常に長い、情報および軸索を受け取るために樹状突起を工夫することにより、中枢神経系および末梢神経系の機能のために複雑な回路が必要不可欠確立。神経突起伸長は、神経突起の胚発生と神経分化やメンテナンス時の基本的な役割を果たしている批判的に神経系の機能をサポートしています。神経突起は、神経の損傷と再生だけでなく、神経系疾患で批判的に備えています。神経細胞の建築の研究では、正常および疾患脳の両方を理解することが重要である。幸いなことに、生理学的に関連する神経細胞培養系は、複雑な異種の細胞構造を再現することができますが存在する。固体実験プラットフォームの解明に基づいて、ニューロン形態の定性的および定量的分析を可能にする効果的な可視化戦略が必要とされている。特に有用なのだろうナノメートルスケールでの神経突起、軸索と樹状突起の両方を可視化するための一貫性のあるプラットフォームを提供し、詳細な方法論であること。
伝統的な電子顕微鏡検査は、それらの真の状態から試験片の歪みを誘発することができ、脱水、包埋樹脂中の有機溶媒の使用を必要とする。従って、4,9,25所見の解釈を制限する-これまでに、ナノメートルスケールで最も構造的特徴付けは、このような過酷な化学物質にさらされる大きな細胞または組織に基づく。また、電子ビームの浸透のために、切片を1μm12よりも大きい厚さを示す生物または細胞の突起に必要....
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プロトコル
1。メッキ初代神経細胞のためのEMグリッドの料理を準備する
- 少なくとも25倍の倍率で光学顕微鏡を用いて金のEMグリッド上に穴あきカーボンの整合性を検討する。カーボン穴が> 98％で完全な状態であることを確認してください。
- 一次ニューロンをめっきするため、EMグリッドを火炎殺菌し、同時にそれらを親水性にするブンゼンバーナーを使用しています。その縁ではなく、中央グリッド面積で、EMグリッドを拾うためにピンセットを使用してください。注意：無人点灯ブンゼンバーナーを離れることはありませんし、次の手順を実行している間プラスチック部品に手袋やピンセットを使用していない。
- ブンゼンバーナーを点灯する前に、最低限の開いた位置に空気およびガスの調整を設定します。
- ストライカー火打ち石やブタンライターを使用してブンゼンバーナーを点灯。
- 背の高い、明るい青/紫の炎内の小さな青い内炎を達成するために、空気やガスの調整を変更します。内炎の先端が炎の最も熱い部分である。下のノブバーナーは、バーナーのバレルに入る空気の量を調整するためにオンにすることができるが、バーナーは、バーナー管に入るガスの量を調整するニース。空気調整を時計回りに回すと（紫の炎を生じる）空気を減少させ、反時計回り（黄色の炎を生じる）空気を向上させます。
- カーボン面を上に直面して、二度の炎をすばやく渡すことは、EMグリッドを保持するために金属製ピンセット（NOプラスチック部品）を使....
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結果
クライオET経由凍結イメージング、光学顕微鏡像の前には、神経細胞が成長しているのEMグリッドの注意が必要です。神経突起は、互いにかなりの重複せずにはっきりと見えるはずです。 図3Aのカラーボックスは、ズームインされる神経突起グリッドの格子を横切って延びている図3Bのより高い倍率を表示するために領域を表す。各グリッド正方形は、神経細胞とその神経突起をサポートする穴あきカーボン膜で構成されている。これらの穴は外側に突出し神経突起、そこから比較的大きく、暗い、電子密度の高い物体（ 図3C）、などのニューロン体を示している4K倍率で撮影された低用量低温電子顕微鏡画像で明らかである。
炭素の穴の上に載って神経突起の一部は、図3Cに着色されたボックスで選択し、ズームアップ高倍率（20K）で、図3Dにされている。このプロトコルに従うことによって生成されるように、この倍率では、微小管、小胞、ミトコンドリアなどの明確な内部細胞構造は.......
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ディスカッション
我々は、ラット胚性ニューロン（後根神経節および海馬）は金電子顕微鏡（EM）グリッド上に成長した2-DクライオEM及び3-Dクライオを用いて撮像されるそれらの神経突起のために十分に薄いガラス質氷中で凍結することができることを示してET。海馬の神経突起が以前に凍結ET 8,10,18,23を使用して画像化してきたが、市販の装置を使用して正常なレプリケーションのための十分な詳細なプロトコルが欠けていた。彼らの研究は、海馬の神経突起を可視化するためのクライオ-ETの使用を開拓しているが、さらに、我々の研究は、神経標本の複数のタイプにクライオ-ETの適用可能性を探る。
ここでは、EMが最適に薄い氷を達成するためにそれらを吸い取り、海馬および後根神経節（DRG）ニューロンのいずれかでグリッド準備詳細なプロトコルを記述し、プランジ凍結クライオ-ETによる撮影のためにそれらを。最適なブロッティング時間は、氷中で電子ビームが貫通するために厚すぎもたらさないものであるガラス質氷が穴あき炭素の端から穴あき炭素の最も内側に著しく異なる勾配で表示されていることも薄すぎる。さらに、ガラス.......
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開示事項
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
謝辞
本研究は、NIHの助成金（PN2EY016525とP41GM103832）によって支えられてきた。 SHSは湾岸コンソーシアム（NIH認可番号T32EB009379）の学際的バイオサイエンス教育のためのWMケックセンターのナノバイオロジー学際大学院教育プログラムからの交わりによってサポートされていました。
SHSは、解剖し成長し、DRGおよび海馬細胞をガラス化し、低温電子顕微鏡およびDRGと海馬軸索の凍結ETデータを収集し、再構成され、チルトシリーズは色注釈付き。 MRGを切開し、MNRの研究室での海馬細胞を提供した。 SCは、チルトシリーズ注釈を支援。 SHSは、神経細胞を分析し、成長する方法についてのCWで訓練された。 SHS、WCMとトイレは実験を考案。 SHSは他の著者からの入力に原稿を用意しました。
このビデオは、TのBiozentrumの細胞イメージングとNanoAnalyticsセンター（C-シーナ）で撮影されました大学バーゼル彼。 C-シーナは、スイスのバーゼルに位置連邦工科大学チューリッヒのバイオシステムズ科学工学部門（D-BSSE）に統合されています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| デュモン #7 ピンセット | 電子顕微鏡科学 | 72803-01 | EMグリッドの取り扱い用 |
| ガラス底皿 | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | 成長サンプル用 |
| 電子顕微鏡グリッド | クォンティフォイル | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | 成長サンプル用 |
| カルシウムフリー濾紙 | Whatman | 1541-055 | ブロッティングサンプル用 |
| 大型フラットポイントロングピンセット | エクセルタコーポレーション | E003-000590, 25-SA | ブロッティングサンプル用 |
| ガラス化装置とピンセット | FEI | Vitrobot Mark III | 冷凍サンプル用 |
| ミニグリッド収納ボックス | Ted Pella, Inc. | 160-40 | EMグリッド収納用 |
| クライオトランスファーホルダー | ガタン | 626 シングルチルト液体窒素 クライオトランスファーホルダー | イメージングサンプル用 |
| 半自動チルトシリーズ取得ソフトウェア | シリアルEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | イメージングサンプル用 |
| 画像処理ソフト | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | 画像処理用 |
| クライオ電脳顕微鏡 | 日本電子 | 200kV JEM2100 LaB6電子顕微鏡 | サンプル撮影用 |
| 4k x 4k CCDカメラ | Gatan | N/A | サンプル撮影用 |
| 3Dアノテーションソフト | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | 3Dデータ処理 |
| 用 2D画像をデジタルスティッチングするソフト | Adobe | Adobe Photoshop | 2次元データDMEMの処理 |
| High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | 海馬培養用 |
| ホウ酸 | Sigma Aldrich | B-0252 | 海馬培養用 |
| 四ホウ酸ナトリウム | Sigma | Aldrich B-9876 | 海馬培養用 |
| Poly-L-lysine | シグマ アルドリッチ | P2636-500MG | 海馬培養用 |
| フィルターシステム | コーニング | 430758 | 海馬培養用 |
| 神経基礎培地 | Invitrogen | 21103-049 | DRG培養用 |
| B-27サプリメント | Invitrogen | 17504-044 | DRG培養用 |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Invitrogen | 15140-122 | DRG培養用 |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | DRG培養 |
| 用組換えラットb-NGF | R&DRG | 培養用 | 556-NG |
| ウリジン | シグマ | U3003-5G | DRG培養用 |
| 5'-フルオロ-2'-デオキシウリジン | シグマ | F0503-100MG | DRG培養用 |
| マトリゲル | BDバイオサイエンス | 356234 | DRG培養用 |
参考文献
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
- Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like ....
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