同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

サマリー

膜電位または電流と細胞内カルシウム濃度の変化を同時に記録する手順が説明されています。視交叉上核ニューロンは、全細胞パッチクランプ構成のパッチクランプ電極を使用してカルシウムインジケーターbis-fura-2で満たされています。

要約

細胞内カルシウム濃度の調節における膜電位または電流の変化の役割を研究するために、電気生理学的および蛍光イメージング同時記録法が使用されました。明暗サイクルなどの環境条件の変化は、ニューロンや神経ネットワークの活動、哺乳類の脳のマスター概日時計の位置である視交叉上核(SCN)内の概日時計遺伝子ファミリーの発現を変化させる可能性があります。興奮性シナプス伝達は、概日時計遺伝子のリズミカルな発現をシフトするシグナル伝達経路を活性化すると考えられているシナプス後Ca²⁺濃度の増加につながります。SCNを含む視床下部スライスは、カルシウム指示薬bis-fura-2を含む内部溶液で満たされた微小電極を使用してパッチクランプされました。微小電極とSCNニューロン膜との間にシールが形成された後、穏やかな吸引で膜が破裂し、カルシウムプローブが体細胞と樹状突起の両方を埋めるニューロンに拡散しました。細胞内カルシウム濃度の定量的レシオメトリック測定は、膜電位または電流と同時に記録されました。これらの方法を用いて、シナプス活動や個々のニューロンの活動電位発火によって生じる細胞内カルシウム濃度の変化の役割を研究することが可能です。本発表では、脳切片に保持されている個々のSCNニューロンからの電気生理学的活動と細胞内カルシウムを同時に記録する方法を実演します。

概要

遺伝子発現の変化は、シナプスシグナル伝達の結果としてニューロンで起こることが知られています。興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸によるシグナル伝達は、神経膜電位を脱分極させ、最終的に遺伝子の転写と翻訳につながる^1,2。グルタミン酸によるイオン栄養受容体の活性化により、細胞外カルシウムイオンが細胞内に侵入するようになり、遺伝子転写を活性化するセカンドメッセンジャーとして重要な役割を果たすと考えられています。活動電位の発火頻度などの膜の電気的活動と細胞内カルシウム濃度の変化との関係を評価するには、全細胞パッチクランプと蛍光カルシウムプローブの定量的イメージング^3-5の2つの方法を組み合わせる必要があります。シングルセル記録技術により、脳の識別可能な部分における個々のニューロンの活動を記録することができます。全細胞記録技術により、膜の電圧または電流を制御することができ、特定のイオンチャネル電流を実験的に操作することができます。蛍光カルシウムプローブを充填したマイクロピペットを使用すると、ニューロンがカルシウムプローブで十分に満たされていることも確認できます。この技術は、成人スライス調製物からの脳スライス調製物を扱う際に明らかな利点を有する、なぜなら、これらのニューロンは、より一般的な細胞透過プローブを用いてロードすることが特に困難であり、潜在的なバックグラウンド蛍光問題6⁻⁸を低減するからである。

光は、哺乳類が視床....

プロトコル

1. 視床下部脳切片の調製

1. 動物が関わるすべての手続きについて、事前にIACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)の承認を得てください。ここで説明する動物の手順は、2013年の動物の安楽死に関するAVMAガイドラインと一致しており、オレゴン健康科学大学IACUCによって事前に承認されています。
2. MgCl₂およびCaCl₂を含まない500 mLのスライシングバッファーを調製します(表1)。室温で溶液を95%_O2と5%_CO2で泡立て、曝気を続けながらMgCl₂とCaCl₂を添加します。浸透圧をショ糖で300 mOsmに調整します。浸透圧は蒸気圧浸透計で測定されます。
3. MgCl₂とCaCl₂を含まない記録媒体1Lを調製します(表2)。溶液を95%_O2と5%CO₂で泡立て、曝気を続けながらMgCl₂とCaCl₂を添加します。NaOH(10 N)でpHを7.2-7.4に調整し、スクロースで浸透圧を300 mOsmに調整します。HEPES緩衝液の添加は....

結果

視床下部脳切片を用い、電位固定および電流固定の両条件下のホールセルモードにおいて、細胞内カルシウムの変化を同時に記録しました。Figure 1Aに示す微小電極を、少量の正圧をかけながら高倍率（40X または 63X UV対物レンズ）で所定の位置まで降下させます。ニューロンに接触した後、緩やかな吸引によってギガオームシールを形成します。電位固定モードにおいて、細胞膜電位を -60 mV に設定した後、さらに吸引を行うことで膜を破り、ホールセル構成とします。モニターで観察すると、ニューロン内にプローブが急速に充満します。細胞体と同様の焦点面にある樹状突起を可視化できます（Figure 1A 挿入図）。あるいは、焦点を調整して遠位樹状突起におけるカルシウム変化を測定することも可能です。-60 mV の電位固定モードでの記録において、+20 mV への短時間（2 msec）のステップを 10 Hz で与えることで活動電位の発生をシミュレートしました。これは、多くの SCN ニューロンの日中の活動電位発火率の生理学的範囲内にあります(Figures 1B

ディスカッション

上記の方法は、ニューロン膜の電気的活動と細胞内カルシウム濃度の間の関連を同時に記録するための強力なツールを提供します。この方法には、全細胞パッチクランプの記録と蛍光色素を使用した細胞内カルシウムの測定という 2 つの非常によく特徴付けられた方法を組み合わせたという点で、多くの強みがあります。私たちのアプローチは、他の研究者によって説明されているものと似ています^_6,23。

この方法を使用する際には、いくつかの項目を考慮する必要があります。1つ目は、細胞内微小電極溶液による細胞内容物の透析につながる全細胞パッチ構成の使用です。透析は、電位依存性イオンチャネルのランダウンとセカンドメッセンジャー媒介シグナルの喪失につながる可能性があります^24〜26。第二に、細胞損傷またはギガオームシールの損傷は、細胞入力抵抗の低下に関連する可能性のあるカルシウムレベルの上昇をもたらす可能性があります²⁴。第三に、微小電極の先端が詰まらないように、プローブを含む細胞間溶液を微小電極に充填する直前にろ過する必要があります.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NaCl	ッシャーサイエンティフィック株式会社	S271-3
KCl	フィッシャーサイエンティフィック株式会社	P217-500
NaH2PO4•H2O	シグマケミカル(株)	S-9638
MgCl<サブ>2&ブル;6H2O	フィッシャーサイエンティフィック株式会社	M33-500
CaCl2•2H2O	フィッシャーサイエンティフィック株式会社	C79-500
D-グルコース	フィッシャーサイエンティフィック社	D16-500
NaHCO3	フィッシャーサイエンティフィック(株)	S233-500
糖	フィッシャーサイエンティフィック株式会社	S5-500
D-グルコン酸カリウム	Sigma-Aldrich	G4500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
アデノシン 5&�素	Sigma-アルドリッチ	A8937
グアノシン 5&�素 -三リン酸トリス塩	ΣAldrich	G9002
アガロース(超高純度)	Life技術	15510-027	無菌ペトリ皿に穴を開けたゲル 厚さ6 mmの層
KOH	Sigma-Aldrich	P-6310
NaOH	Sigma-Aldrich	S-5881
Bis-fura-2、ヘキサカリウム塩	Invitrogen	B6810	細胞不透過
機器の名前	会社	カタログ番号	コメント
ミクロトーム	ライカ	VT1000S	ティッシュスライス
シアノアクリル接着剤 (Roti-Coll1)	Carl Roth GmbH+Co	Art-Nr. 0258.1
Microelectrode Puller	Narshige International USA	PP-83
Microelectrode Capillary Tubes	World Precision Instruments	1B150F-4
Microfil 34 g	World Precision Instruments	MF34G-5
シリンジフィルター	Corning	#431212
顕微鏡	ライカ	DM LFS	4倍、40倍、40倍、63倍紫外線対物レンズ、落射蛍光付き
CCDカメラ	浜松	オルカ ER	12ビットCCD
Fura-2 フィルターキューブ	Chroma	71500A	UG11フィルター付きセット
ポリクロームIV	ティルフォトニクス GmBH		モノクロノメーター
紫外線防止安全メガネ	紫外線製品
EPC-9アンプ	HEKA Eletronik
Metafluor	Molecular Devices		イメージングソフトウェア
Patchmaster	HEKA Eletronik		データ収集ソフトウェア
Igor version 6	Wavemetrics		電気生理学 &Ca2+ データ分析
VAPRO 5520	Westcor		蒸気圧浸透圧計

フィショ性