方法論記事

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

DOI：

10.3791/50794

⸱

2013年12月8日

 , 
1Center for Research on Occupational and Environmental Toxicology, Oregon Health & Science University, 2Department of Behavioral Neuroscience, Oregon Health & Science University

この記事について

サマリー

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膜電位または電流と細胞内カルシウム濃度の変化を同時に記録する手順が説明されています。視交叉上核ニューロンは、全細胞パッチクランプ構成のパッチクランプ電極を使用してカルシウムインジケーターbis-fura-2で満たされています。

要約

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細胞内カルシウム濃度の調節における膜電位または電流の変化の役割を研究するために、電気生理学的および蛍光イメージング同時記録法が使用されました。明暗サイクルなどの環境条件の変化は、ニューロンや神経ネットワークの活動、哺乳類の脳のマスター概日時計の位置である視交叉上核(SCN)内の概日時計遺伝子ファミリーの発現を変化させる可能性があります。興奮性シナプス伝達は、概日時計遺伝子のリズミカルな発現をシフトするシグナル伝達経路を活性化すると考えられているシナプス後Ca2+濃度の増加につながります。SCNを含む視床下部スライスは、カルシウム指示薬bis-fura-2を含む内部溶液で満たされた微小電極を使用してパッチクランプされました。微小電極とSCNニューロン膜との間にシールが形成された後、穏やかな吸引で膜が破裂し、カルシウムプローブが体細胞と樹状突起の両方を埋めるニューロンに拡散しました。細胞内カルシウム濃度の定量的レシオメトリック測定は、膜電位または電流と同時に記録されました。これらの方法を用いて、シナプス活動や個々のニューロンの活動電位発火によって生じる細胞内カルシウム濃度の変化の役割を研究することが可能です。本発表では、脳切片に保持されている個々のSCNニューロンからの電気生理学的活動と細胞内カルシウムを同時に記録する方法を実演します。

概要

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遺伝子発現の変化は、シナプスシグナル伝達の結果としてニューロンで起こることが知られています。興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸によるシグナル伝達は、神経膜電位を脱分極させ、最終的に遺伝子の転写と翻訳につながる1,2。グルタミン酸によるイオン栄養受容体の活性化により、細胞外カルシウムイオンが細胞内に侵入するようになり、遺伝子転写を活性化するセカンドメッセンジャーとして重要な役割を果たすと考えられています。活動電位の発火頻度などの膜の電気的活動と細胞内カルシウム濃度の変化との関係を評価するには、全細胞パッチクランプと蛍光カルシウムプローブの定量的イメージング3-5の2つの方法を組み合わせる必要があります。シングルセル記録技術により、脳の識別可能な部分における個々のニューロンの活動を記録することができます。全細胞記録技術により、膜の電圧または電流を制御することができ、特定のイオンチャネル電流を実験的に操作することができます。蛍光カルシウムプローブを充填したマイクロピペットを使用すると、ニューロンがカルシウムプローブで十分に満たされていることも確認できます。この技術は、成人スライス調製物からの脳スライス調製物を扱う際に明らかな利点を有する、なぜなら、これらのニューロンは、より一般的な細胞透過プローブを用いてロードすることが特に困難であり、潜在的なバックグラウンド蛍光問題6−8を低減するからである。

光は、哺乳類が視床下部視交叉上核(SCN)に位置する概日時計を調整する主要な方法です。網膜で伝達された光情報は、グルタミン酸がSCN12,13で放出される網膜視床下部路(RHT)を介して9-11に伝達されます。グルタミン酸は、SCNニューロン上に位置するNMDAおよびAMPAイオノトロピック受容体を開き、カルシウムおよびナトリウムの流入を生じさせ、細胞内シグナル伝達カスケードを開始し、最終的に時計遺伝子14-17のファミリーの発現を変化させ、概日時計18-20の位相をシフトさせる。しかし、カルシウムは、イオン型グルタミン酸受容体を介して直接ニューロンに侵入するか、膜脱分極と電位依存性カルシウムチャネル(VDCC)の活性化を通じてニューロンに侵入する可能性があります21。したがって、我々は、活動電位発火やシナプス入力22から発生するような、SCNニューロンの細胞内カルシウム濃度と膜電気活性との関係を調査するための実験プロトコルを開発した。

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プロトコル

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1. 視床下部脳切片の調製

  1. 動物が関わるすべての手続きについて、事前にIACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)の承認を得てください。ここで説明する動物の手順は、2013年の動物の安楽死に関するAVMAガイドラインと一致しており、オレゴン健康科学大学IACUCによって事前に承認されています。
  2. MgCl2およびCaCl2を含まない500 mLのスライシングバッファーを調製します(表1)。室温で溶液を95%O2と5%CO2で泡立て、曝気を続けながらMgCl2とCaCl2を添加します。浸透圧をショ糖で300 mOsmに調整します。浸透圧は蒸気圧浸透計で測定されます。
  3. MgCl2とCaCl2を含まない記録媒体1Lを調製します(表2)。溶液を95%O2と5%CO2で泡立て、曝気を続けながらMgCl2とCaCl2を添加します。NaOH(10 N)でpHを7.2-7.4に調整し、スクロースで浸透圧を300 mOsmに調整します。HEPES緩衝液の添加はオプションであり、pHをさらに安定させるために使用しました。
  4. スライス液および記録液は、使用前に数日間冷蔵庫に保管することができます。
  5. 3%アガロースを調製し、滅菌シャーレ(深さ6 mm)に注ぎ、冷蔵します。
  6. 約6 mm x 6 mm x 6 mmのアガロースを3つの立方体に切ります。
  7. 生後4〜8週齢のSprague-Dawleyラットにイソフルランを深く麻酔します。麻酔の深さをテストします。麻酔の深さは、フットパッドをつまんだ後に後肢の離脱反射がない場合に適切であると見なされます。適切に麻酔をかけられると、ラットは迅速な斬首によって安楽死されます。
  8. 最初に視神経を切断するように注意しながら脳を迅速に取り出し、5%CO2と95%O2で飽和した氷冷スライス溶液に入れ、2〜3分間冷まします。
  9. 脳をトリミングします。氷の上に置かれたガラスのペトリ皿にセットされた湿らせた(スライス溶液を含む)円形の濾紙に鉗子を使用して脳を置きます。
  10. 脳を冠状に切開して残りの小脳と脳幹を取り除き、次に吻側皮質と側面を取り除き、視床下部を含む脳のブロックを残し、SCN、視神経、視交叉を含む側を慎重に保存します。
  11. 脳とアガロースブロックを取り付けるのに十分な大きさのシアノアクリル接着剤の薄層を、氷のように冷たく乾燥したミクロトームスライスチャンバーに広げます。
  12. 氷のように冷えた脳ブロックの尾側を下にして接着剤に移し、SCNを含む側を最初に切断するために配置し、視神経が上向きの「V」を形成します。
  13. アガロースブロックを他の3つの側面に置きます。5%のCO2と95%のO2で連続的に泡立った氷冷スライシングバッファーをチャンバーに充填します。シアノアクリル接着剤は、脳とアガロースブロックを所定の位置に保持する水分で固化します。
  14. SCNを含む冠状視床下部スライス(厚さ220-250μm)を振動ブレードミクロトームで切断します。通常、視交叉が直径約2〜4 mmのスライスが選択され、SCNが背側にある白い帯のように見え、3番目の脳室の両側の視交叉に2つの小さな「くぼみ」として現れます(図1A)。
  15. ライカDMLFS顕微鏡のステージに取り付けられた記録チャンバー(36°C)にスライスを置きます。チャンバーには、95% O2 と 5% CO2 で曝気され、インラインヒーターで予熱された連続流記録溶液 (2 ml/分) が充填されています。
  16. スライス調製の0.5〜8時間後に、SCNニューロンの全細胞パッチクランプおよびカルシウムイメージング記録を実行します。

2. パッチクランプ録音

  1. 電極溶液(細胞内)溶液を、全最終水量の半分に調製します。
  2. KOH(1N)で溶液をpH7.3に調整します。
  3. 残りの水を追加します。溶液の最終的な浸透圧は、280〜290 mOsmの範囲である必要があります。
  4. 電極溶液を0.2μmフィルターに通し、分注(0.5 mL)をマイクロチューブに入れ、-20°Cで保存します。
  5. 1 mg のビスフラ-2 ヘキサカリウム塩を 99.29 μl の 0.2 μm ろ過水と混合して、カルシウムプローブ bis-fura-2 ヘキサカリウム塩ストック溶液 (10 mM) を調製します。
  6. 分注を別々のチューブ (各2-5 μl) に入れ、凍結 (-20 °C) します。
  7. 使用直前に内部溶液とCa2+プローブのアリコートを解凍します。2 μl の bis-fura-2 ストック溶液を 400 μl の内部溶液に加えると、最終的に 50 μM のカルシウムプローブ濃度が得られます。溶液を混合するために簡単に縮小します。カルシウムプローブ濃度(10-250 μM)は、実験デザインとイメージングシステムによって異なります。bis-fura-2は、結合した2つのfura-2分子で構成されていることに注意してください。
  8. 全細胞パッチ電極を、細胞内溶液で満たされたときに約1μmの先端直径と7〜10MΩの抵抗に2段階で引き込みます。
  9. カルシウムプローブを含む内部溶液数μlを電極に戻し、Microfilチューブを介して少量サンプル用の4mmシリンジフィルター(0.2μm)でろ過します。
  10. 電極がビデオモニターで見ながら赤色光照明の下で記録チャンバーに導かれるので、電極に少量の正圧を加えます。
  11. 低電力対物レンズ(4X)を使用して、SCN上に微小電極を配置します。SCNは、第3脳室の両側と視交叉の背側にある2つの半透明の領域として識別されます(図1A)。
  12. 顕微鏡を高倍率(40倍または63倍)に切り替えます。SCNおよび個々のSCNニューロンのサブ領域は、より高い倍率で記録の対象とすることができます。
  13. 微小電極がニューロンの表面に進むときに、微小電極に穏やかな陽圧を加えます。
  14. 微小電極に穏やかな負圧を加えて、3〜10GΩの抵抗でシールを形成します。
  15. メンブレン電圧を-60mVに調整し、アクイジションソフトウェアでアンプを制御します。
  16. 電極に追加の負圧を加えて、細胞膜を全細胞モードに破裂させます。
  17. 全細胞モードに入ると、SCNニューロン、体細胞、樹状突起は蛍光プローブで満たされます。
  18. 膜電圧は、カルシウムプローブの画像データを監視および保存している間に、電流クランプモードまたは電圧クランプモードで電流を測定します(以下で説明)。実験中に取得した画像を、340 nm/380 nm比の蛍光データのグラフとともに表示します。

3. 細胞内Caの測定2+

  1. 定量的なCa2+測定は、10nm帯域幅のモノクロノメーターを介して340nmおよび380nmのUV光で組織を急速に励起し、UG11光学フィルターを通過して400nmを超える高調波波長を制限することにより、一対の画像を記録することによって得られます、400nmのDCLPダイクロイック、および510±40nmの発光フィルターを介して放出された光。
  2. 画像は冷却されたCCDカメラを使用して取得され、取得時間とビニングが調整され、光退色を最小限に抑え、記録速度を最大化します。
  3. 定量的イメージングソフトウェアを使用して、画像を取得して表示します。
  4. 初期画像から関心領域を選択し、相対蛍光強度単位データ(体細胞、樹状突起など)に変換します。また、バックグラウンド蛍光の測定領域も選択します(図1B)。
  5. 生画像と定量化された光学データは、実験中に継続的に保存されます。実験後、定量化する対象領域をより正確に選択するためにより多くの時間をかけることができる場合、保存された画像は一般的に再分析されます。
  6. データは、推定された細胞内カルシウム濃度(Est[Ca2+]i)として表すことができます。340 nmでの励起およびバックグラウンド減算後に放出される光の比(R)を380 nmで割った値と、340 nmおよび380 nmでの蛍光の最大および最小の蛍光を使用して、カルシウム濃度を計算します4。バックグラウンド減算などの計算は、データ解析ソフトウェアを使用して行います。
  7. ビス-フラ-2の最大蛍光と最小蛍光のin vitro測定は、Ca2+結合に10 mM CaCl2、Ca2+フリー条件に10 mM EGTAを使用して行うことができます。プローブの Ca2+ 解離定数 Kd は、bis-fura-2 (Invitrogen) で 370 nM と見なされます。

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結果

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視床下部の脳スライスを用いて、電圧と電流の両方のクランプ条件下で全細胞モードの細胞内カルシウムの変化を同時に記録しました。図1Aに示す微小電極は、高倍率(40倍または63倍のUV対物レンズ)下で、少量の正圧を加えた状態で所定の位置に下げられます。ニューロンに触れると、優しく吸引することでギガオームシールが形成されます。電圧クランプモードでは、細胞膜電位を-60mVに設定した後、追加の吸引により膜が破壊され、細胞全体の構成が形成されます。ニューロンは、モニターで見ると急速にプローブでいっぱいになります。体細胞と同様の焦点面での樹状突起過程を視覚化できます(図1A挿入図)。あるいは、遠位樹状突起のカルシウム変化を測定するために焦点を調整することもできます。-60 mVの電圧クランプモードでの記録では、多くのSCNニューロンの日中の活動電位発火速度の生理学的範囲内である10 Hzで+20 mVまでの短い(2 msec)ステップを使用して活動電位の発火をシミュレートしました(図1Bおよび1C)。近位樹状突起を含...

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ディスカッション

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上記の方法は、ニューロン膜の電気的活動と細胞内カルシウム濃度の間の関連を同時に記録するための強力なツールを提供します。この方法には、全細胞パッチクランプの記録と蛍光色素を使用した細胞内カルシウムの測定という 2 つの非常によく特徴付けられた方法を組み合わせたという点で、多くの強みがあります。私たちのアプローチは、他の研究者によって説明されているものと似ています6,23。

この方法を使用する際には、いくつかの項目を考慮する必要があります。1つ目は、細胞内微小電極溶液による細胞内容物の透析につながる全細胞パッチ構成の使用です。透析は、電位依存性イオンチャネルのランダウンとセカンドメッセンジャー媒介シグナルの喪失につながる可能性があります24〜26。第二に、細胞損傷またはギガオームシールの損傷は、細胞入力抵抗の低下に関連する可能性のあるカルシウムレベルの上昇をもたらす可能性があります24。第三に、微小電極の先端が詰まらないように、プローブを含む細胞間溶液を微小電極に充填する直前にろ過する必要があります...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

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この研究は、国立総合医科学研究所(GM096972)からの助成金によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
NaClッシャーサイエンティフィック株式会社S271-3
KClフィッシャーサイエンティフィック株式会社P217-500
NaH2PO4•H2Oシグマケミカル(株)S-9638
MgCl<サブ>2&ブル;6H2Oフィッシャーサイエンティフィック株式会社M33-500
CaCl2•2H2Oフィッシャーサイエンティフィック株式会社C79-500
D-グルコースフィッシャーサイエンティフィック社D16-500
NaHCO3フィッシャーサイエンティフィック(株)S233-500
糖フィッシャーサイエンティフィック株式会社S5-500
D-グルコン酸カリウムSigma-AldrichG4500
HEPESSigma-AldrichH4034
アデノシン 5&�素Sigma-アルドリッチA8937
グアノシン 5&�素 -三リン酸トリス塩ΣAldrichG9002
アガロース(超高純度)Life技術15510-027無菌ペトリ皿に穴を開けたゲル 厚さ6 mmの層
KOHSigma-AldrichP-6310
NaOHSigma-AldrichS-5881
Bis-fura-2、ヘキサカリウム塩InvitrogenB6810細胞不透過
機器の名前会社カタログ番号コメント
ミクロトームライカVT1000Sティッシュスライス
シアノアクリル接着剤 (Roti-Coll1)Carl Roth GmbH+CoArt-Nr. 0258.1
Microelectrode PullerNarshige International USAPP-83
Microelectrode Capillary TubesWorld Precision Instruments1B150F-4
Microfil 34 gWorld Precision InstrumentsMF34G-5
シリンジフィルターCorning#431212
顕微鏡ライカDM LFS4倍、40倍、40倍、63倍紫外線対物レンズ、落射蛍光付き
CCDカメラ浜松オルカ ER12ビットCCD
Fura-2 フィルターキューブChroma71500AUG11フィルター付きセット
ポリクロームIVティルフォトニクス GmBHモノクロノメーター
紫外線防止安全メガネ紫外線製品
EPC-9アンプHEKA Eletronik
MetafluorMolecular Devicesイメージングソフトウェア
PatchmasterHEKA Eletronikデータ収集ソフトウェア
Igor version 6Wavemetrics電気生理学 &Ca2+ データ分析
VAPRO 5520Westcor蒸気圧浸透圧計
フィショ性

参考文献

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  1. Bading, H., Ginty, D. D., Greenberg, M. E. Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways. Science. 260, 181-186 (1993).
  2. Ghosh, A., Ginty, D. D., Bading, H., Greenberg, M. E. Calcium regulation of gene expression in neuronal cells. J. Neurobiol. 25, 294-303 (1994).
  3. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  4. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
  5. Higley, M. J., Sabatini, B. L. Calcium signaling in dendrites and spines: practical and functional considerations. Neuron. 59, 902-913 (2008).
  6. Colwell, C. S. Circadian modulation of calcium levels in cells in the suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 12, 571-576 (2000).
  7. Ikeda, M., Yoshioka, T., Allen, C. N. Developmental and circadian changes in Ca2+ mobilization mediated by GABAA and NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 17, 58-70 (2003).
  8. Irwin, R. P., Allen, C. N. GABAergic signaling induces divergent neuronal Ca2+ responses in the suprachiasmatic nucleus network. Eur. J. Neurosci. 30, 1462-1475 (2009).
  9. Berson, D. M., Dunn, F. A., Takao, M. Phototransduction by retinal ganglion cells that set the circadian clock. Science. 295, 1070-1073 (2002).
  10. Hattar, S., Liao, H. W., Takao, M., Berson, D. M., Yau, K. W. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 295, 1065-1070 (2002).
  11. Hartwick, A. T., et al. Light-Evoked Calcium Responses of Isolated Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells. J. Neurosci. 27, 13468-13480 (2007).
  12. Castel, M., Belenky, M., Cohen, S., Ottersen, O. P., Storm-Mathisen, J. Glutamate-like immunoreactivity in retinal terminals of the mouse suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 5, 368-381 (1993).
  13. Card, J. P., Moore, R. Y. The organization of visual circuits influencing the circadian activity of the suprachiasmatic nucleus. In Suprachiasmatic Nucleus - The Mind's Clock. Reppert, S. M., Klein, D. C., Moore, R. Y. , Oxford University Press. Oxford. 51-76 (1991).
  14. Shigeyoshi, Y., et al. Light-induced resetting of a mammalian circadian clock is associated with rapid induction of the mPer1 transcript. Cell. 91, 1043-1053 (1997).
  15. Albrecht, U., Sun, Z. S., Eichele, G., Lee, C. C. A differential response of two putative mammalian circadian regulators, mper1 and mper2, to light. Cell. 91, 1055-1064 (1997).
  16. Yan, L., Silver, R. Differential induction and localization of mPer1 and mPer2 during advancing and delaying phase shifts. Eur. J. Neurosci. 16, 1531-1540 (2002).
  17. Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of the mammalian circadian system: Photic entrainment, circadian pacemaker mechanisms, and posttranslational regulation. Annu. Rev. Genet. 34, 533-562 (2000).
  18. Ding, J. M., et al. Resetting the biological clock: Mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO. Science. 266, 1713-1717 (1994).
  19. Ding, J. M., Fairman, L. E., Hurst, W. J., Kuriashkina, L. R., Gillette, M. U. Resetting the biological clock: mediation of nocturnal CREB phosphorylation via light, glutamate, and nitric oxide. J. Neurosci. 17, 667-675 (1997).
  20. Ding, J. M., et al. A neuronal ryanodine receptor mediates light-induced phase delays of the circadian clock. Nature. 394, 381-384 (1998).
  21. Bollmann, J. H., Helmchen, F., Borst, J. G., Sakmann, B. Postsynaptic Ca2+ influx mediated by three different pathways during synaptic transmission at a calyx-type synapse. J. Neurosci. 18, 10409-10419 (1998).
  22. Irwin, R. P., Allen, C. N. Calcium Response to Retinohypothalamic Tract Synaptic Transmission in Suprachiasmatic Nucleus Neurons. J. Neurosci. 27, 11748-11757 (2007).
  23. Smetters, D., Majewska, A., Yuste, R. Detecting action potentials in neuronal populations with calcium imaging. Methods. 18, 215-221 (1999).
  24. Spruston, N., Johnston, D. Perforated patch-clamp analysis of the passive membrane properties of three classes of hippocampal neurons. J. Neurophysiol. 67, 508-528 (1992).
  25. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).
  26. Marty, A., Neher, E. Tight-seal whole-cell recording. Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. 2, Plenum Press. New York. 31-52 (1995).
  27. Sarantopoulos, C., McCallum, J. B., Kwok, W. M., Hogan, Q. Beta-escin diminishes voltage-gated calcium current rundown in perforated patch-clamp recordings from rat primary afferent neurons. J. Neurosci. Methods. 139, 61-68 (2004).
  28. Hatae, J., Fujishiro, N., Kawata, H. Spectroscopic properties of fluorescence dye fura-2 with various divalent cations. Jap. J. Physiol. 46, 423-429 (1996).
  29. Poenie, M. Alteration of intracellular Fura-2 fluorescence by viscosity: a simple correction. Cell Calcium. 11, 85-91 (1990).

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Bis fura 2

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