方法論記事

廃水由来の電気活性微生物バイオフィルム:成長、維持、および基本的な特性評価

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DOI：

10.3791/50800

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2013年12月29日

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

この記事について

サマリー

ポテンショスタットによって制御される3電極セットアップを使用したフェッドバッチリアクターでの陽極電気活性微生物バイオフィルムのクロノアンペロメトリック成長が実証されています。細胞外電子移動は、電子供与体の存在下および電子供与体の存在下でのサイクリックボルタンメトリーを用いて特徴付けられます。基本的なデータ分析が実証されています。

要約

供給バッチ反応器内の廃水接種物からの陽極電気活性微生物バイオフィルムの成長は、ポテンショスタットによって制御される3電極セットアップを使用して実証されます。これにより、ポテンショスタットを使用することで、電極電位を正確に調整し、再現性のある微生物培養条件を確保することができます。成長中、現在の生産量はクロノアンペロメトリー(CA)を使用して監視されます。これらのデータに基づいて、生体電気触媒性能の特性評価の尺度として、最大電流密度(jmax)とクーロン効率(CE)について説明します。サイクリックボルタンメトリー(CV)、非破壊、すなわち非侵襲的方法は、電気活性細菌の細胞外電子移動(EET)を研究するために使用されます。CV測定は、微生物基質の存在下で陽極バイオフィルム電極上で行われます。ターンオーバー条件、および基板がない場合、つまり非ターンオーバー条件で、異なるスキャンレートを使用します。続いて、データ解析を例示し、微生物EETの基本的な熱力学的パラメータ、すなわちピーク電位(Ep)、ピーク電流密度(jp)、形式電位(Ef)、ピーク分離(ΔEp)を導き出し、説明します。さらに、メソッドの限界と最先端のデータ分析にも対処します。したがって、このビデオ記事は、基本的な実験手順と基本的なデータ解析のガイドを提供します。

概要

微生物の細胞外電子移動(EET)の基礎の解明と、その工学的システムにおける利用は、研究開発の重要かつ急速に増加している分野です1-3。これらの電気活性(または生体電気触媒または電気化学的に活性な)微生物の研究には、純粋な菌株、定義された共培養物、複雑なコンソーシアムなど、技術、方法、およびプロトコルの複雑な武器が必要です4。これらの方法は、電気化学、材料科学、微生物学などの多様な科学分野に由来し、さまざまな階層レベル、つまり微生物バイオフィルム全体から単一分子まで。したがって、電気化学および電気化学的方法は、すべての活動の基礎を表しています。

従来、燃料電池タイプのセットアップは、これらの工学的システムの原型である微生物燃料電池(MFC)5の電気活性微生物培養の成長と維持によく使用されていました。残念ながら、これらのタイプのMFCは、単一の電極の電位を監視したり制御したりすることさえできないことが多く、したがって、電極プロセスに関する限られた洞察しか得られず、セル電圧のみが報告されました。現在では、MFCの単一電極の電位を個別に監視および制御することが、基礎研究だけでなくエンジニアリングにとっても明らかな利点であることがますます認識されています。さらに、修復、淡水化、合成、さらにはバイオコンピューティングなど、いわゆる微生物生体電気化学システム(BES)2,6,7における微生物電気化学技術の応用が多様化するにつれて、個々の電極電位の外部制御がしばしば重要になります。この制御は通常、外部電源またはポテンショスタットを使用して実現されます。これにより、ポテンショスタットを使用すると、他のタイプのセットアップとは対照的に、個々の電極電位を正確に調整することができます。電極は、細胞外電子移動の末端微生物電子受容体(アノード用)または電子供与体(カソード用)を表すため、これは非常に重要です。図1は、アノードでの微生物EETに関する知識の現在の状態を示しています-詳細については、例えば2,4,6,8,9を参照してください。

したがって、電極電位の制御は、再現性のある微生物培養条件の使用だけでなく、EET熱力学11の観点からのその調整も可能にする。この記事では、クロノアンペロメトリー(CA)とサイクリックボルタンメトリー(CV)を使用したフェドバッチリアクター実験から、電気活性微生物バイオフィルムの特性パラメータを抽出する方法を示します。これには、性能パラメータの最大電流密度(jmax)とクーロン効率(CE)、およびEET特性が含まれます。ここでは、可能な電子伝達サイトと実際の電子移動サイトの形式電位(EF)の同定に焦点を当てます。これらのパラメータの抽出は、Geobacter specによって支配される廃水由来の混合培養バイオフィルムの例に示されています。12 これらの廃水由来のバイオフィルムは、世界中の多数の研究グループによって実証されているように、単純な電気化学的選択手順によって得られます13-16。

微生物の細胞外電子移動を研究するための動的電気化学的手法

電気活性微生物培養物のEETの熱力学的特性評価には、動的電気化学的技術が必要です。一般に、これらの技術には、電位制御、すなわちボルタンメトリック、および電流制御、すなわちガルバノダイナミック、テクニック17.これにより、電位制御技術がより一般的であり、例えば、矩形波ボルタンメトリーおよびリニアスイープボルタンメトリー18が含まれる。ただし、最も人気があるのはサイクリックボルタンメトリー(CV)19,20です。CVは、電池研究から材料科学、酵素生体電気化学まで、電気化学のさまざまな分野でよく知られており、広く普及しています21。生きた微生物細胞へのその適用は、10年以上前にさかのぼることができ22 そして最後の年の間に大幅に増加します23,24。特に、CV法と分光法の組み合わせは、EETメカニズムとその分子的性質について前例のない洞察を提供しました、例えば25,26並行して、微生物EETの熱力学的および理論的特性の抽出のための理論的枠組みは拡大され、深められました27-30。しかし、対照的に、実験的な取り扱いの誤りや不適切なデータ解析は、微生物生物電気化学の分野でCVの適切な適用を妨げることがよくあります。したがって、ワークショップ(EU-ISMET 2012など)とチュートリアル19に加えて、このビデオ記事は、電気活性細菌の周期ボルタンメトリー実験の実施に関する基本的なガイドを提供します。したがって、基本的な実験ステップと基本的なデータ分析に焦点を当てており、速度論的分析の最新のプロトコルを提供することを意図したものではありません。次の議論で最も重要な終端は、ボックス 1 に要約されています (Harnisch と Freguia19 から改作され、修正されました)。

プロトコル

生体電気化学フェドバッチリアクターでの選択手順は、基質と無酸素条件の選択により非常に特殊であるため、示された例では無菌状態での作業は必要ありません。

1. 成長培地の準備

  1. Kimらによるリン酸緩衝液を使用して、適切な量の増殖培地を調製します。13 (表 1 を参照)。ここでは、酢酸ナトリウム(10 mM)が基質として機能しています。この記事で使用されている増殖培地は一例にすぎず、実験目的に応じてその成分が異なる場合があります。
  2. 増殖培地20 mlあたり1 mlの一次廃水を接種材料として追加します。.廃水サンプルは、機械的ろ過後に都市廃水処理プラントから採取され(図2などを参照)、4°C.
    の密閉容器で使用するまで最大3か月間保存できます (注:実験の目的によっては、正確な初期細胞数が重要になる場合があり、その後で決定する必要があります。実証された例では、バイオフィルムが定常状態に達するため、初期細胞数は重要ではありません。
  3. 接種物を含む培地を窒素で少なくとも 30 分間洗い流して脱気するには、培地に針を挿入して窒素の流れをオンにします。流れは、培地の完全な混合を観察できるほど強力である必要があります。
    (注:媒体の体積によっては、脱気時間を延長することも検討する必要があります。脱気セットアップ中、フェッドバッチリアクター(ステップ2.1-2.2))

2. フェドバッチリアクターのセットアップ

  1. 適切な反応容器を取ります-ここでは、改造された4ネックの250ml丸底フラスコが使用されます
    (注:一般的に、船舶には少なくとも4つの入口が必要です。これらは、3つの電極とサンプリング/メディア交換に必要です。サンプリングや媒体交換のために反応器が定期的に開かれると、生成されたガス量は無視でき、代わりにバブルカウンターを設置する必要があります。望ましくない光屈性成長を避けるために、反応器は直接光にさらされないようにシールドする必要があります。
  2. 3電極のセットアップ(詳細については図3とセクション3を参照)の場合、参照電極(RE)(ここではAg/AgCl、衛星KCl、0.197V対SHE)、作用電極(WE)、および対電極(CE)をフラスコにシリコンプラグを介して個々の入口から配置します>< (注:WEおよびCEグラファイトロッドが使用されているため。電極のワイヤーはシリコンプラグを通して引っ張られ、外部に固定されます。参照電極は、ドリル穴を介してシリコンプラグに通されます。短絡を避けるために、攪拌中や媒体の再循環中でも、電極が物理的に接触していないことを確認してください。電極を中溶液で完全に覆われているように配置します。シーリングのために、すべてのインレットのシリコンプラグをパラフィルムで包みます。
  3. 接種物を含む増殖培地(ここでは250ml)をサンプリングポートから窒素で洗い流しながら反応器に注ぎます。
  4. 最後のインレットをシリコンプラグで閉じ、気密に密閉します。注:微量の酸素は、混合種のバイオフィルムに害を及ぼすことはありません。それらは低レベルの酸素に耐えることができ、さらには消費することができ、それが次にCEを減少させる可能性があります。

3. クロノアンペロメトリックバイオフィルムの成長

  1. 電極をポテンショスタットのそれぞれのケーブルに接続します。容器を温度制御されたチャンバーに入れ、ここでは35°Cを使用して31、一定の環境条件を確保します。
  2. ポテンショスタットを制御するソフトウェアを開き、手法を選択します:クロノアンペロメトリー。たとえば、パラメータを次のように設定します:500時間(≈20日)の期間tで、0.2Vの定電位EWE(対Ag/AgCl)。電流は毎分時間刻みで記録されます
    注:印加電位の選択は、研究対象のシステム/微生物によって異なります。一般に、アノードプロセスは正の電位で研究され、カソードプロセスは負の電位で研究されます。また、電子供与体/受容体の標準電位と予想される微生物の電子移動部位の形式電位から適切な電位を推論することもできますので、ここでは出発点として、最近の文献を参照してください。
  3. クロノアンペロメトリーを開始します。測定された電流の経時的なグラフはソフトウェアによってプロットされ、セクション4および5で説明したように、観測された最大電流(imax)は重要なオンラインパラメータです。

4. バイオフィルムのメンテナンス

  1. 温度などの環境条件に応じて、酸化電流が流れ始め、プラトーに達します (図4を参照)。再び電流がゼロになったら、クロノアンペロメトリック測定を一時停止し、培地溶液を補充します。バイオフィルムの成長を早めるには、最大電流のプラトーに達した直後に培地を交換します。サンプリングポートを開き、薄いバイオフィルムを壊さずに慎重に媒体を排出します。培地を再び窒素で洗い流しながら補充します。Sampリングポートを閉じ、気密シールします。
  2. 最大酸化電流が定常状態に達するまで、手順4.1.の手順を繰り返します(図4を参照).
    (注:定数imaxは、安定した定常状態のバイオフィルム形成を示すと考えられています。
  3. 新鮮溶液と交換した培地溶液の1 mLサンプルを採取し、HPLCなどの基質分析を行います。初期基板(酢酸)濃度(c0)と残りの基板溶液(c1)の濃度は、その後、効率計算に必要になります(「データ分析」の項を参照)
    注:基板のさらなる消費など、変更のない結果を得るには、基板サンプルをすぐに分析してください。これが不可能な場合は、サンプルを最低-18°Cの冷凍庫で1か月以内に保管してください。

5. EET研究へのサイクリックボルタンメトリーの応用

  1. 示されているように、電流の流れの最大値と最小値でサイクリックボルタンメトリーを実行します(図4)。関心のある問題にもよりますが、CVは通常、システムが定常状態に達したときに実行され、同等の結果が得られます。(注:電流の発生はターンオーバー条件と呼ばれ、基質の微生物酸化とそれに続く電子移動に関連しています:微生物生体電気触媒;一方、非ターンオーバーCVはCAで(ほぼ)ゼロの電流流れで実行されます。
  2. ポテンショスタット制御ソフトウェアで技術を選択します:サイクリックボルタンメトリー、および適切なパラメータを、ここで設定します:スキャンレートv=dE / dtが1 mV /秒のE iから0.3V対REの頂点電位E1に0.3V対REのE 2 = Eiに戻り、開始電位E2 = E i -0.5 V.
    に戻る 注:サイクリックボルタンメトリーを使用する場合、WEの印加電圧はポテンショスタットによって時間とともに直線的に変化します(図5を参照)-ボックス2は、実験パラメータの選択とトラブルシューティングに関する原則的なルールを提供します)。
  3. サイクリックボルタンメトリーを開始し、再現可能なCVを実行するために必要な数のサイクルを記録します。通常、少なくとも3サイクルが必要です。結果のプロットはサイクリックボルタンモグラムと呼ばれます(図7も参照)。注:測定条件によっては、次のセクションに示すように、さまざまな情報を取得できます。

6. データプロット

ここでは、データのプロットについてのみ説明します。より詳細な論文は、次のセクションで説明します。

  1. 適切なデータ分析ソフトウェアを使用して、ここではすべてのデータがテキストとしてエクスポートされ、ASCIIファイルとしてインポートされます。
  2. 絶対電流(i)ではなく、電流密度(j)を優先的に計算して使用します。
    (注:ただし、jを計算するためのさまざまなプロトコルが存在するため、どれが使用されたかを明確にしてください。ここでは、幾何学的な電流密度、つまり投影された電極の表面積が使用されます。
  3. クロノアンペロメトリー:測定された電流密度を時間の関数としてプロットします。
  4. サイクリックボルタンメトリ:測定された電流密度をWE Eweの電位の関数としてプロットします。

結果

1. クロノアンペロメトリー

クロノアンペロメトリー測定から、2つの動作特性を算出できます。最大電流密度（j最大), すなわち 1秒あたりの最大電子流量、およびクーロン効率（キャピラリー電気泳動), すなわち消費された基質に対する全電流流量。 図4 フェドバッチ反応器を用いた数回の増殖サイクルにおける、典型的なクロノアンペロメトリーによるバイオフィルム増殖曲線を示す。初期のラグフェーズの後、最初の電流密度最大値が始まる。その後、基質の枯渇により電流は再び減少する。電流が（ほぼ）ゼロになった時点で、図に示されるように培地交換を行う。この基質補充の後、電流密度は再び上昇し、次に来る最大電流密度は1回目よりも高くなる。数回の増殖サイクルの後、 j最大 は一定であり、これはバイオフィルム形成が定常状態にあることを示しています。14定常状態になると、 j最大 値はいくつかのパラメータに依存しています。 例： 電極材料、リアクター温度、およびバイオフィルム組成は、特定の電気活性微生物バイオフィルム／電極システムの特性であるとしばしば考えられています。（フロースルーリアクターの場合、そうではなく j最大、ただし、一定の定常状態電流密度が用いられます。）2つ目の動作特性は、クーロン効率です。 (CE) (式1）。これが、電流の流れとして記録された電子数です。 Qp 理論上の最大電子数に関連した、分注培養サイクルあたりの Qth, これは、このサイクル中の基質消費量から算出されます。

静的平衡式 CE=QP/Qth×100。プロセス図における効率計算。

(式 1)

全転送電荷量は、CA曲線を積分することで得られます（図6も参照してください）。

電荷の計算式、\( Q_P = \int_0^t i \, dt \)、積分法。

(式 2)

理論的に可能な電荷量は、ファラデーの法則を用いて次のように算出されます。

熱力学方程式 Qth=ΔcVzF、化学ポテンシャル分析、教育用。

(式 3)

ここで、V は培地の容量、Fはファラデー定数（F = 96,485.34 C/mol）、zは酸化された基質から放出される電子数（酢酸の場合、CO2への酸化過程で8個の電子が放出される）、Δc = c0-c1は基質の消費量（HPLCなどの化学分析法によって決定される）である。

2. サイクリックボルタンメトリー：

非ターンオーバー条件およびターンオーバー条件（図4に記載）でサイクリックボルタモグラムを記録します。どちらの場合においても、異なる種類の情報を得ることができます。以下では、潜在的なEET部位と実際のEET部位をどのように識別できるかについて解説します。

2.1 非ターンオーバー条件下での検討 – 潜在的な EET部位の特定：

図7は、非ターンオーバー条件下、すなわち基質が存在しない場合の代表的なCVを示しています。図7Aは、高い走査速度（ここでは50 mV/sec）におけるバイオフィルムのCVであり、1組のピークのみが確認されるため、形式電位Efを1つだけ特定できます。一般に、レドックス対の形式電位は、酸化ピークのピーク電位EpAと、対応する種の還元ピークのピーク電位EpCの算術平均を求めることで算出できます（図7Cも参照してください）。

電気化学方程式：Ej = (EpA + Epc)/2。ボルタンメトリー研究における酸化還元電位の解析。

(式 4)

同一のバイオフィルムに十分に低い走査速度（ここでは 1 mV/sec）を適用すると、最大4つの redox pair を特定できます（それぞれの形式電位はFigure 7Bに示されています）。その理由は、走査速度を低くすることで容量性背景電流が減少するためです。詳細はBox 1およびe.g.17,21を参照してください。しかし、非ターンオーバーCVでは、電極上のすべての redox-active 化合物、すなわち可能性のある EET サイトの Ef しか示されません。ターンオーバーCVの解析のみが、実際の EET 転移サイトの Ef を提供します（ステップ 2.2. 参照）。

非ターンオーバーCVをさらに解析する場合、ピーク分離 ΔEp (式 5) や最大ピーク電流 ipA および最小ピーク電流 ipC など、他の特徴的なパラメータを解析できます（図 7C 参照）。

静的平衡方程式 ΔEP=EpA-EpC。教育目的の数式図。

(式 5)

これらのパラメータは、特に異なる走査速度で記録された場合、電極における電子伝達プロセスの機構的および速度論的解析に使用できます。しかし、化学系では十分に確立されているこの速度論的解析は、電気化学的に活性な微生物バイオフィルムに対しては単純ではありません（e.g.19,30を参照）。

  1. ターンオーバー条件 – 実際の EET部位の特定：

基質存在下でCV測定を行うと、ターンオーバーCVが得られます（参照 図8A）。データをプロットすると、典型的なS字型の、いわゆる生物電気触媒曲線を確認できます。17-19データをさらに解析すると、一次導関数の最大値が、 すなわちCV曲線の変曲点は、形式電位を与えます。 Ef の 実際的な EET部位（参照 図8B）。若年者の場合、 すなわち薄い、 ゲオバクター科-主導のバイオフィルムにおいて（ここではCA開始から168時間後）、2つの変曲点が観察される。続いて、微分曲線は、生物電極触媒活性を持つEETサイトの形式電位に対応する2つの極大値（Ag/AgCl（飽和KCl、SHEに対し0.197 V）に対して-0.376 Vおよび-0.295 V）を示す。 図7B これらの部位は～と称される Ef,2 および Ef,3それぞれである。この知見はまた、形式電位に関連する酸化還元プロセスが Ef,1 および Ef,4 （非ターンオーバーCVにおけるものは）生物電気触媒作用に関連していません。バイオフィルムが成長し厚くなるにつれて、CVには変曲点が1つだけ現れるようになります。 すなわちすなわち、微分曲線に最大値が1つ存在することを意味します。この形式電位 Efここで、は-0.32 V vs. Ag/AgCl (sat KCl)であり、これは薄いバイオフィルムのEETに割り当てられた2つの形式電位の算術平均に（ほぼ）等しい（例： 翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳する英文をご提示ください。 Ef,2 および Ef,3）– 参照 図9これは、この極めて基礎的なサイクリックボルタンメトリー（CV）解析によって、電子伝達（EET）の熱力学的知見を迅速かつ非侵襲的に得られることを示しているが、注目すべき点として、これ以上の機構的または速度論的な結論を導き出すことはできない。

特筆すべき点として、本プロトコルの特定条件下で形成されたバイオフィルムは、～が極めて優勢である。 ジオバクター 種（本動画では示していない）12,15選択したパラメータの変更 例： 基質、温度、 などまた、微生物組成に影響を与え、その結果として電気化学的特性にも影響を及ぼします。

表1. Kim et al.32による増殖培地

構成要素(mg/L) / (ml/L)   
水素化ナトリウム2PO4•H2O2,690.00
Na2高倍率光学顕微鏡44,330.00
NH4Cl310.00
塩化カリウム130.00
酢酸ナトリウム820.00
金属溶液12.50
ビタミン溶液12.50
表2. 金属およびビタミン溶液の組成33.
微量元素溶液イオン：ビタミン溶液：
構成要素mg/L   構成要素mg/L   
ニトリロ酢酸1,500.0ビオチン2.0
硫酸マグネシウム4•7時間2O         3,000.0葉酸2.0
MnSO₄4•2時間2O         500.0塩酸ピリドキシン10.0
NaCl  1,000.0塩酸チアミン5.0
硫酸第一鉄4•7時間2O          100.0リボフラビン5.0
CoSO4 または CoCl22     100.0ニコチン酸5.0
CaCl₂2•2時間2O            100.0DL-パントテン酸カルシウム5.0
ZnSO₄4   130.0ビタミンB120.1
CuSO₄4•H2O10.0p-アミノ安息香酸5.0
AlK(SO₄)4)2               10.0リポ酸5.0
H3BO3 10.0
Na2酸化モリブデン4•2時間2O     10.0
注：ニトリロ酢酸をKOHでpH 6.5まで溶解させ、その後ミネラルを添加してください。


生物電気化学用語の図；電気化学における方程式および公式を含む。
サイクリックボルタンメトリーのパラメータ設定およびトラブルシューティングガイド。最適なCV実験のための電位窓および走査速度の調整に焦点を当てている。

微生物電子伝達の模式図；MET、DET、MIET、DIET経路；電子伝達解析。
図1. 考えられる微生物細胞外電子伝達メカニズムの概略図。 ここをクリックして拡大画像を表示してください。

採水プロセス。バケットサンプラーを用いて廃水処理の流れから試料を採取している。
図 2. グリッドコレクター後の廃水処理施設におけるサンプリング（ドイツの廃水処理施設）。 ここをクリックして拡大画像を表示してください。

ポテンショスタット、電極構成を備えた電気化学セルの図と写真。CE、RE、WEのラベル付き。
図 3. 3電極系構成。 (A) 概略図、(B) 実際のリアクター。CE = 対極、RE = 参照電極、WE = 電気活性微生物バイオフィルムを含む作用電極、SP = サンプリングポート。ここをクリックして拡大画像を表示します。

電気化学グラフ；CV解析；電流対時間；定常状態への接近；単位はマイクロアンペアおよび時間。
図4. クロノアンペロメトリーによる、廃水接種物を用いた流加培養ベースのバイオフィルム成長のプロット. 培地交換を3サイクル行った後、酸化電流が定常状態に達している。ラグフェーズ、培地交換のタイミング、および定常状態のバイオフィルム条件におけるターンオーバーサイクリックボルタンメトリー（CV）および非ターンオーバーCVの実施タイミングが示されている（生データはLiu14より）。ここをクリックして拡大画像を表示してください。

電気化学分析、E-t図、サイクリックボルタンメトリー、電位対時間、分析化学。
図 5. サイクリックボルタンメトリーの1サイクルにおける電位-時間経過の原理。 CVは初期電位 Ei から開始される。その後、印加電圧は走査速度 v で時間とともに線形に変化する。設定された頂点電位 E1 に達すると、電圧は終点電位 E2 まで戻る。ここでは E2 = Ei である。ここをクリックして拡大画像を表示。

電流密度 j 対 時間 t の電気化学分析グラフ。ピーク jmax を示している。
図 6. 廃水由来バイオフィルムの1成長サイクルの代表的なクロノアンペログラム。ここで、最大電流密度 jmax、流れた（実効）電気量 Qp、初期基質濃度 c0 のサンプリング、および1成長サイクル後の基質濃度 c1 が示されている。ここをクリックして拡大画像を表示します。

電気化学分析グラフ；電流対電圧の結果を示すサイクリックボルタモグラム。
図 7. G. sulfurreducens バイオフィルムの非ターンオーバーサイクリックボルタモグラム。 走査速度：(A) 50 mV/sec, (B) 1 mV/sec 23; (C) B の拡大図であり、最大値におけるアノードのピーク電流密度（jpA）およびそれぞれのピーク電位（EpA）を示している。同様に、最小値におけるカソードのピーク電流密度（jpC）およびそれぞれのピーク電位（EpC）が示されている。形式電位 Ef およびピーク電位差 ΔEp は、それぞれ 式 4 および 式 5 から算出される（詳細は後述の本文を参照）。ここをクリックして拡大画像を表示してください。

電気化学分析；ボルタンメトリーグラフ；電流対電位；ピーク検出；データ解析。
図 8. (A) 代謝中の G. sulfurreducens バイオフィルムのターンオーバーサイクリックボルタンモグラム。走査速度は 5 mV/sec でした。(B>) ボルタンメトリー曲線の一次微分23。実際のEETサイトの形式電位である Ef,2 および Ef,3 が示されています。ここをクリックして拡大画像を表示してください。

サイクリックボルタンメトリーのグラフ。電流対電位。電気化学的分析。データ結果。
図 9. より厚い代謝活性を持つ G. sulfurreducens バイオフィルムの (A) ターンオーバーサイクリックボルタモグラムおよび (B) 一次導関数. 走査速度は 5 mV/sec であった（図 8 と比較）。 ここをクリックして拡大画像を表示してください。

ディスカッション

提示されたプロトコルは、フェドバッチ反応器で3電極セットアップを使用して、廃水接種物から電気活性微生物バイオフィルムを成長させるための簡単で簡単な方法を示しています。クロノアンペロメトリーは、多様な接種物からの電気活性微生物バイオフィルムの成長と選択、および最大電流密度とクーロン効率の観点からのバイオフィルムの基本的な特性評価を可能にします。サイクリックボルタンメトリーは非侵襲的な技術であるため、微生物バイオフィルムのEET熱力学に関する基礎研究を実行し、可能な実際のEET転移部位を特定することができます。これらのパラメータを組み合わせることで、i)同一の条件下で異なる微生物バイオフィルムを特徴付けて比較すること、およびii)同一の電気活性微生物バイオフィルムに対する異なる動作条件の影響を研究することができます。ただし、これらの実験は出発点にすぎません。一方では、微生物生体電気化学の多面的な分野では、電気化学的方法とプロトコルのさらなる詳細な活用が必要です。これには、例えば、速度論的および機構的データを抽出するためのモデル、ならびに電気化学的インピーダンス分光法34,35などのさらなる方法が含まれます。一方、電気化学的方法では、分子の性質、微生物組成、空間微生物の組織 などに関する情報は得られません。ここでは、非侵襲的で電気化学または侵襲的な技術のいずれかが必要です4. ボックス 2 では、実験を実行する際の重要なステップと最初のトラブルシューティングについて簡単に説明します。

工学的観点からは、電気活性バイオフィルム陽極は現在の微生物生体電気化学システムの1つのコンポーネントにすぎず、システム全体については他の多くの要因を分析する必要があることを考慮に入れる必要があります36。しかし、このビデオ記事が、将来的にBESのコア要素、 つまり 微生物電極を理解し、調整するのに役立つことを願っています。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

F.H.は、BMBF(研究賞「次世代バイオテクノロジープロセス - バイオテクノロジー2020+」)およびヘルムホルツ協会(Young Investigators Group)の支援を認めています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
一次廃水廃水処理プラント機械ろ過後に撮影
250ml 丸底フラスコと3つの追加インレット付きTh.Geyer Berlin GmbH, Germany9.011 845追加のインレットは、社内のガラスブロ
ワーAg/AgCl参照電極(SAT.KCl、0.195V対SHE)とセラミックダイアフラムによってSensortechnik Meinsberg, GermanySE 11
グラファイトロッド(Ø= 1 cm、l = 3および5 cm)CP-Handels-GmbH、ヴァハトベルク、ドイツ材料として使用
、No.1.4301、ワイヤーFe / Cr18 / Ni10Goodfellow GmbH、バートナウハイム、ドイツ155-923-05
シリコンプラグTh.GeyerBerlin GmbH、ドイツ9.230 512および
ParafilmneoLab、ハイデルベルク、ドイツ3-1011嫌気性条件を維持するためのシーリング用
ポテンショスタット/ガルバノスタットモデル MPG2BioLogic Science Instruments, France
EC-LabBioLogic Science Instruments, フランス電気化学測定用ソフトウェア
Origin 8.6OriginLabデータ分析ソフトウェア
取り付けられました 電極ステンレス鋼

参考文献

  1. Rabaey, K., Angenent, L., Schröder, U., Keller, J. Integrated Environmental Technology Series. Lens, P. , IWA Publishing. London, New York. (2010).
  2. Logan, B. E., Rabaey, K. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals using microbial electrochemical technologies. Science. 337, 686-690 (2012).
  3. Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production. Nat. Rev. Microbiol. 8, 706-716 (2010).
  4. Harnisch, F., Rabaey, K. The Diversity of Techniques to Study Electrochemically Active Biofilms Highlights the Need for Standardization. ChemSusChem. 5, 1027-1038 (2012).
  5. Logan, B. E., et al. Microbial Fuel Cells: Methodology and Technology. Environ. Sci. Technol. 40, 5181-5192 (2006).
  6. Harnisch, F., Schröder, U. From MFC to MXC: chemical and biological cathodes and their potential for microbial bioelectrochemical systems. Chem. Soc. Rev. 39, 4433-4448 (2010).
  7. TerAvest, M. A., Li, Z., Angenent, L. T. Bacteria-based biocomputing with Cellular Computing Circuits to sense, decide, signal, and act. Energy Environ Sci. 4, 4907-4916 (2011).
  8. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4, 12 (2006).
  9. Lovley, D. R. Reach out and touch someone: potential impact of DIET (direct interspecies energy transfer) on anaerobic biogeochemistry, bioremediation, and bioenergy. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 10, 101-105 (2011).
  10. Rosenbaum, M., Aulenta, F., Villano, M., Angenent, L. T. Cathodes as electron donors for microbial metabolism: Which extracellular electron transfer mechanisms are involved. Bioresource Technol. 102, 324-333 (2011).
  11. Schröder, U. Anodic electron transfer mechanisms in microbial fuel cells and their energy efficiency. Phys. Chem. Chem. Phys. 9, 2619-2629 (2007).
  12. Harnisch, F., et al. Revealing the electrochemically driven selection in natural community derived microbial biofilms using flow-cytometry. Energy Environ. Sci. 4, 1265 (2011).
  13. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  14. Liu, Y., Harnisch, F., Fricke, K., Sietmann, R., Schröder, U. Improvement of the anodic bioelectrocatalytic activity of mixed culture biofilms by a simple consecutive electrochemical selection procedure. Biosens. Bioelectron. 24, 1006-1011 (2008).
  15. Torres, C. sI., et al. Selecting Anode-Respiring Bacteria Based on Anode Potential Phylogenetic, Electrochemical, and Microscopic Characterization. Environ. Sci. Technol. 43, 9519-9524 (2009).
  16. Virdis, B., Harnisch, F., Batstone, D. J., Rabaey, K., Donose, B. C. Non-invasive characterization of electrochemically active microbial biofilms using confocal Raman microscopy. Energy Environ. Sci. 5, 7017-7024 (2012).
  17. Scholz, F., Bond, A. M. Electroanalytical Methods: Guide to experiments and applications. 2, edn,(2010).
  18. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  19. Harnisch, F., Freguia, S. A Basic Tutorial on Cyclic Voltammetry for the Investigation of Electroactive Microbial Biofilms. Chemistry. 7, 466-475 (2012).
  20. Marsili, E., et al. Shewanella secretes flavins that mediate extracellular electron transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3968-3973 (2008).
  21. Bard, A. J., Inzelt, G., Scholz, F. Electrochemical Dictionary. , Springer. (2008).
  22. Kim, B. H., et al. Electrochemical activity of an Fe(III)-reducing bacterium, Shewanella putrefaciens IR-1, in the presence of alternative electron acceptors. Biotechnol. Tech. 13, 475-478 (1999).
  23. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energy Environ. Sci. 1, 144 (2008).
  24. Marsili, E., Sun, J., Bond, D. R. Voltammetry and Growth Physiology of Geobacter sulfurreducens Biofilms as a Function of Growth Stage and Imposed Electrode Potential. Electroanalysis. 22, 865-874 (2010).
  25. Busalmen, J. P., Esteve-Núñez, A., Berná, A., Feliu, J. M. C-Type Cytochromes Wire Electricity-Producing Bacteria to Electrodes. Angew. Chem. 120, 4952-4955 (2008).
  26. Millo, D., et al. In Situ Spectroelectrochemical Investigation of Electrocatalytic Microbial Biofilms by Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 50, 2625-2627 (2011).
  27. Hamelers, H. V., et al. New applications and performance of bioelectrochemical systems. Applied Microbiol. Biotechnol. 85, 1673-1685 (2010).
  28. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci.. 2, 506 (2009).
  29. Torres, C. I., Kato Marcus, A., Rittmann, B. E. Proton transport inside the biofilm limits electrical current generation by anode-respiring bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 872-881 (2008).
  30. Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 3-17 (2010).
  31. Patil, S. A., Harnisch, F., Kapadnis, B., Schröder, U. Electroactive mixed culture biofilms in microbial bioelectrochemical systems: The role of temperature for biofilm formation and performance. Biosens. Bioelectron. 26, 803-808 (2010).
  32. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  33. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43, 260-296 (1979).
  34. He, Z., Mansfeld, F. Exploring the use of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) in microbial fuel cell studies. Energy Environ. Sci. 2, 215-219 (2009).
  35. Ter Heijne, A., et al. Identifying charge and mass transfer resistances of an oxygen reducing biocathode. Energy Environ. Sci. 4, 5035-5043 (2011).
  36. Logan, B. Scaling up microbial fuel cells and other bioelectrochemical systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 1665-1671 (2010).

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