での採餌行動のためのシングル·フライアッセイショウジョウバエ

サマリー

このビデオの記事では、我々は大人のフルーツキイロショウジョウバエを飛んでの嗅覚に依存する食品の検索行動に空腹や満腹の効果を測定するための自動化されたアッセイを説明します。

要約

多くの動物の場合は、飢餓は、適切な食料源の検索を容易にする方法で、嗅覚系の変化を促進する。このビデオの記事では、我々は大人のフルーツキイロショウジョウバエを飛んでの嗅覚に依存する食品の検索行動に空腹や満腹の効果を測定するための自動化されたアッセイを説明します。ショウジョウバエには見えない赤い光で照明光を通さない箱では、カスタムデータ収集ソフトウェアにリンクされたカメラは、同時に6ハエの位置を監視します。各ハエを中心に食品の匂いを含む個々の競技場の中を歩くに限定されている。臭いの蓄積を防ぐために機能し、多孔性床に残りアレナステスト。臭気源、異なる生理学的状態の下で嗅覚感度を反映したメトリックを検索するレイテンシは、ソフトウェア分析により決定される。ここでは、この行動パラダイムを実行する重要な仕組みを議論し、フライLOADIに関する具体的な問題をカバーngの、臭気汚染、アッセイ温度、データ品質、および統計分析。

概要

食品の検索と食料消費^1：飢餓の状態は欲求行動の2種類を推進しています。この単純な行動アッセイは^、2,3採餌に関連する走化性行動の研究のために有用である。具体的には、食品の匂いターゲットを見つけるに飛ぶ位置、歩行速度と遅延を追跡します。食品所見のレイテンシは、その内部欲求状態の変化の下流フライ臭気検出システムの感度の変化を測定するための測定基準として機能する。このアッセイの説明書のバージョンは、以前はGABA-B受容体シグナル伝達が^3ハエ成虫における臭気定位挙動にとって重要であることを示すために使用した。アッセイの現在の自動化されたバージョンはどのように短い神経ペプチド-F（sNPF）のシグナル伝達の研究に尽力したショウジョウバエの嗅覚マップの形状を変更し、影響が行動^2を食欲。

試験は暗い、温度及び湿度制御された部屋で行われる。デジタル透明アクリルのテストプレートの上に設定されたビデオカメラは、660 nmのLED照明によりバックライトハエを追跡。カメラからの情報は、次の検査エリアに駐留するコンピュータによりリアルタイムで処理される。我々は、試験期間中にフライ位置の座標を記録して保存するデータ取得ソフトウェアを使用する。

このパラダイムでは、被写体が中央に食べ物の匂いが含まれているアリーナ中に放出され、臭気オブジェクトは、フライ食品の検索動作を誘導アリーナ内の食品のにおいのグラデーションを作成します。同じような匂い検索プロトコルは、単一のショウジョウバエの幼虫⁷における化学感覚の研究に向かって適用されている。このような4フィールドオルファクトメーター^4,5またはT-迷路⁶など他の行動アッセイは、臭気嫌悪やアトラクションの行動を評価しながら、このパラダイムは、嗅覚感度および走化性行動を評価することが最も適しています。

いくつかの重要な利点は、このASSAに同行Y。データ収集と分析は主に自動化されているので、第一に、それは、大規模なデータセットの迅速な取得を可能にする。第二に、このアッセイは、単離するので、それらの挙動に影響を与え得る社会的嗅覚の手がかりを排除する、単一のハエの行動を測定する。第三に、プロトコルとシンプルな実験デザインのシンプルさは、アッセイが、効率的で他の人を教えることが簡単になります。

さらに、このアッセイは、さらに、 キイロショウジョウバエ ⁸で使用可能な大規模な遺伝的ツールキットと組み合わせることにより、食物探索行動の基礎となる神経回路をプローブするために使用することができる。無音またはするニューロンを興奮させることを目標と導入遺伝子の発現は、GAL4-UASシステムだけでなく、UAS-shibireの^TS1、UAS-破傷風毒素、およびUAS-TRPA1（B）の導入遺伝子^9月12日などのツールを用いて達成することができる。

プロトコル

1。ハエ収集と飢餓

1. 12時間の明/暗サイクルで制御された温度および湿度条件下で、実験後方ハエ（ 例えば、21°C、相対湿度50〜60％）。
2. 女性は羽化の日に飛ぶ収集し（最大30バイアル当たり）新しい食品バイアルに、4〜5人の男性と一緒に、それらを配置する。年齢は2〜5日飛ぶ。
3. フライ飢餓のための室を準備します。
   1. 空のプラスチックバイアルの底に、単一の組織（4.8×8.4インチ）を押します。完全に蒸留水を用いて組織を浸す。組織を押し下げ、ゆっくりと余分な水分を絞り出すようにオブジェクトを使用します。
   2. 余分な水を廃棄するように、バイアルを反転します。湿った、しかし、ハエを紛らすのに十分ではないで水和ハエや飢餓室を維持するのに十分な水があるはずです。
4. 飢餓室に食品のバイアルからハエを転送し、実験を開始する前に、バイアルを約18〜24時間後に接続します。保存する一晩、制御された温度と湿度の条件の下でバイアル実験は次の日に開始されるまで。

2。食品臭気の調製

1. アガロースガラスフラスコ内の10mlの蒸留水に低い溶融温度を0.1gを添加して1％アガロース溶液を調製する。それが沸騰し始めるちょうどまで電子レンジでアガロース溶液を加熱しますが、それは上に沸騰するかなり前。
   1. 電子レンジを止めて、一度、フラスコを旋回。アガロースが完全に溶解するまでさらに2回、この手順を繰り返します。 50℃に設定したホットプレート上で、フラスコを暖かく保つことにより液体状態でアガロース溶液を保つ
2. 1％のリンゴ酢液を作るために1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに1％アガロース溶液を990μLとリンゴ酢の10μlを加える。ボルテックス混合するまで溶液を50℃に設定し、ドライ風呂インキュベーター内の場所

3。テストルームと行動室のセットアップ

1. 希望条件（ 例えば 、温度、湿度）に試験室を設定します。
2. LEDパネル（660 nm）をオンにします。
3. お湯で篩および試験プレートをすすぎ、水分が全て蒸発するまで乾燥オーブンでそれらを加熱する。実験を開始する前に、試験室温にモレキュラーシーブ、プレートを冷却する。
4. 拡散板の上に浅い皿を置き、現地の湿度を高めるために、アガロース液滴の水をマスクするために水でそれを埋める。
5. 水皿の上でモレキュラーシーブを配置します。

4。テストプレートにロードして飛ぶ

テスト版の仕様との図は、補足ファイル]セクションにあります。テストプレートは、透明なアクリル製で、6テストアリーナで構成されている。シンプルなスライダーがで、それぞれの室にハエのロード、一時的な封じ込め、および6ハエの同時放出を可能に保持チャンバーが含まれています実験開始。プレート中の各競技場の中央でエッチング十字線は、匂い物質をピペットでされるべき場所を示す。

1. アクリルテストプレートにスライダーを挿入します。
2. 優しく綿栓過去バイアルに吸引器をスライドさせて約6ハエがaspirator.itに歩くことを許可することは、それらを取り扱う際にはできるだけ優しくすることが重要です。一つは、薄暗い光源に向けて、バイアルの開口部を指すことによって吸引器に向かってクロールするハエを誘導することが走光性フライの動作を利用することができる。必要であれば、人はまた、約6メスのハエを吸引する穏やかな吸引を適用してもよい。
3. テストプレートの第1穴に吸引器の先端を挿入します。シングルフライ、保持セル内に通過させ、ゆっくりと次のホールにフライをロードするために前進スライダを進めることができます。ハエは、プレートの全6保持セルを占有するまで継続する。
4. CRの中心に直接1％リンゴ酢アガロース溶液をピペット5μLテスト板の内側面におけるOSS-毛。

5。テストプレートを配置

1. テストプレートを中央に、「位置決めTool.vi.」という名前のファイルを開きます位置決めツールの「LabVIEWのVI。 viは補足ファイル]セクションにあります。画面の左上隅にある白い矢印をクリックして、ファイルを実行します。
2. アリーナの開口部がふるい床に面しており、臭気ターゲットはプレートの天井になるように、ふるいの上にテストプレートを置きます。モニター画面上の十字線を使用したテストプレートの背面にエッチングされた十字線の位置を合わせます。
3. アライメントが完了すると、ディスプレイの左上隅に位置する赤い点をクリックすることで実行を中断する。

6。実験中にフライ位置を記録

1. 各食品の検索試験中にハエの座標を追跡し、記録するために、収集ソフトウェアファイルを開き「FLYトラッキング - シックスZones.vi「LabVIEWのVIは「フライ追跡 - シックスZones.viは「補足ファイルのセクションを参照してモニターの左上隅にある白い矢印をクリックして、ファイルを実行します。 。
2. ファイルに名前を割り当てて、上で「OK」をクリックします。
3. テストアリーナにハエを解放するために、試験室でスライダを進める。これは解析ソフト座標との不適切なアライメントにつながるように、試験室を移動させないように注意してください。
4. "スタート"（録音が始まる）をクリックして、検査室での光の唯一の供給源は、660nmのLEDパネルであることを確認してください。
5. 試験が終了すると、ふるいや行動チャンバーを取り外します。ふるいからテストプレートを持ち上げ、氷の中にプレートを浸漬することでハエを削除します。そっとお湯でプレートをきれいにし、任意のアガロース片を除去。水分を除去するために乾燥炉での試験プレートを配置します。
6. Smalのをオンにすることで、テスト場所を換気約2分間のLファン。ファンの電源をオフにして、次のテストプレートにハエの次のグループをロードします。

7。カスタムソフトウェアを使用したデータ分析

「フライトラッキング6つのゾーンを持つデータ分析「補足ファイル]セクションにあります。データ取得中に、取得ソフトウェア·レコードの個々のハエ位置は、テキストフ​​ァイル内の各時点の座標。試験プレートの上方に配置された単一のデジタルカメラは、0.5ヘルツのフレームレートで画像を取得する。 「フライ·トラッキング·6つのゾーンをデータ解析」は、そのテキストフ​​ァイルから情報を抽出し分析ソフトウェアプログラム）が平均速度を計算し、b）正常臭気源を配置し、フライc）は、グラフィカルウィンドウを構築する時点を決定するそれは見ることができるように、場所、時間をかけて、時間と平均フライオーバースピード臭気源からのハエの距離を飛ぶ。また、SPREに簡単にエクスポート用のデータをフォーマットadsheetプログラム。このマクロでは、食品検索遅延はアリーナの中央の半径5mm以内に少なくとも5秒を費やすハエた時点として定義される。

1. " - 6つのゾーンフライ追跡のためのデータ解析「解析ソフトウェアファイルを開きます。の「Windows」タブで、「新しいテーブルを作成します。」をクリックしてください6テーブルが作成されるまで、この手順を繰り返します。
2. 「マクロ」タブで、をクリックして「Foodfinding。 "メインパネルには、以下のオプションを使用して表示されます：オープン生データは、レイアウト用のファイル、オープンRAWデータは、データ·ファイルのファイル、フライ場所、距離、スピード、レイアウト、FormatDataFile。
3. 、テキストフ​​ァイルに値を追加することなく、生のデータを表示するにはをクリックして「レイアウトのためのオープンRAWデータファイル。 "表示されるブラウザウィンドウでの実験データファイルを探し、選択します。をクリックして「開く」
4. 6アリーナ（各フライを描いた6 XYプロット」のそれぞれで各ハエの場所を表示するには、 "フライの場所」をクリックします時間をかけてs位置）は画面に表示されるはずです。
5. （時間の経過に臭気源からハエの距離を描いた6プロットが画面に表示されます）臭気源からの各ハエの距離を表示するには、「距離」をクリックします。 yは5ミリメートルでの水平線は、フライ食品源に位置していると考えられるしきい値を示す。
6. （時間をかけてハエのスピードを描いた6プロットが画面に表示されます）試験期間中に、各ハエの平均速度を表示するには、「スピード」をクリックします。
7. （最初の50秒の間）の平均速度に加えて、各ハエ（図1）のための臭気源を見つけるの待ち時間、すべてのハエの位置、距離、速度グラフでレイアウトを表示するには、「レイアウト」をクリックします。適切にレイアウトを表示するためには、マージンを調整する必要があり得る。これを行うには、最初のレイアウトウィンドウをクリックしてください。 「ファイル」タブで、「レイアウトのページ設定。」をクリックしてくださいに余白をリセット0.2インチとで「OK」をクリックします。すぐにそれぞれの場所プロットの左の見出し「速度」とした小さなテーブルで「レイテンシ」各見出しの下に入力した値は、秒単位の平均速度100mm /秒と食品の検索の待ち時間を示す。レイテンシの下の空白のエントリは、ハエが臭気発生源を突き止めることができなかったを示している。食品検索遅延はハエは、チャンバの中心から半径5mm以内に少なくとも5秒を過ごした時点として定義される。
8. レイアウトを印刷するには、レイアウト領域（現在のファイルへの更新·レイアウト）をクリックしてください。 「ファイル」をクリックし、をクリックして「印刷レイアウト。 "
9. 次のファイルを表示するには、単にクリックして「レイアウトのためのオープンRAWデータファイル。 "あなたが上で表示し、クリックしたい次の生データファイルをクリックして「OK」新しいデータファイルを使用してウィンドウを更新するために、レイアウトウィンドウをクリックします。
10. 設定は、後で使用するために、実験ファイルに保存することができる。

8。からのデータのエクスポート表計算プログラムへのデータ解析ソフトウェア

1. それぞれのファイルに対して、速度とレイテンシのデータをエクスポートするには、をクリックして「開く生データがデータ·ファイルのファイル。 "実験データファイルを選択し、をクリックして「開く。」新しいブラウザウィンドウが表示されます。
2. 新しいブラウザウィンドウで、「新規作成」を右クリックしてをクリックして「テキストドキュメント。 "新しいテキストドキュメントに名前を付けます。新しい名前のテキストフ​​ァイルを選択し、をクリックして「開く。」これはテキストフ​​ァイルに生データファイルからのデータを格納します。
3. 別のファイルからデータをエクスポートするには、「オープン生データがデータ·ファイルのファイル。」をクリックしてください別のファイルをクリックし、をクリックして「開く。」 ）ステップ8.2からテキストフ​​ァイルを選択します。エクスポートする残りのデータファイルに対してこの処理を続行します。
4. すべての必要なデータファイルがテキストフ​​ァイルに追加されたら、をクリックして「形式のデータファイル。 "ドキュメントは、前のステップからのデータを保存し、「開く」をクリックするために使用されるテキスト（新しいWINDOを選択wは自動的に）開きます。
5. ウィンドウ内に新しいテキストフ​​ァイルを作成し、ファイル名を割り当てて、をクリックして「保存」。これは、各フライのテキストフ​​ァイル名を含むファイル、平均速度、および待ち時間を作成し、表計算プログラムにインポートすることができます。
6. 累積的なプロットは、時間の関数（図3）などの食品臭ターゲットに到達するハエの総数のデータから構築される。
7. 実験データセットは、比率のZ検定を用いて統計的有意性について分析する。

結果

データ解析ソフトウェア及びレイアウトは、 図1に見られるその一例は、分析基準のセットに従って、その10分間の試験中に、各ハエの性能を評価するために使用される。以下の基準は、各ハエからのデータがデータ分析のために使用され、負傷、疾病、ストレス、または意欲の欠如のために、食品検索タスクが実行できないそれらのハエを排除するように設計されているかどうかを決定するために使用される。

300以上の秒アクティブではハエが「非アクティブ」であると考えられ、これらはA）がすでに食料源を見つけることに成功しているか、b）少なくとも100秒の平均速度> 10ミリメートル/秒を発揮しない限り、データセットから拒否されます非アクティブ期間（図2a、図2b、図2c）は、以下の。

健康的なハエは、その保持室から解放されると、すぐに強力な検索行動を示す。このように、そののみハエを選択するには唯一の試験の最初の50秒間の速度の一定の範囲内でその動きを飛ぶ、アクティブな臭気検索の初期段階...

ディスカッション

このプロトコルでは、食品の検索行動の分析のためのステップバイステップの手順を説明します。食品関連臭気に加えて、それはまた、他の臭気のオブジェクトを検索するハエの能力の研究のために適合させることができる。例えば、それは男性のハエ³におけるメイトローカリゼーション行動の研究に向かって適用してもよい、いくつかの追加の考慮事項は、我々は、この手順についてここで言及します。このプロトコルのためにあります。：

まず、飼育温度が実験ハエが試験前に熟成させなければならない期間が決まります。それは、年齢の範囲は、実験のために最も適切な年齢を決定するために検査することをお勧めします。 21℃で飼育するとき、彼らは4〜5日齢された後に、たとえば、我々の経験では、給餌や飢えフライ応答の間の違いは、最も堅牢である。

第二に、LEDは、目の下に一定作成するのに役立つ、ガラス拡散板、均一な照明を照らす電子アクリルチャンバ。も十分、定数、明るい照明がハエの動きを自動的に追跡するために重要である。不均一な照明や光源をちらつきがハエの位置を...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アップルサイダービネガー	スペクトラム		市販の
アガロース、タイプVII	シグマアルドリッチ	A0701	低ゲル化温度アガロー
アクリルテストプレート		カスタム	プレートには6つのアリーナが含まれています。各アリーナの直径は60mm、高さは6mmです。特定の測定については、テストプレート図を参照してください。
LabVIEW V.8.5	National Instruments	776670-09	プログラム用プラットフォーム:PositioningTool.vi、FlyTracking--Six Zones.vi 注:「経過 time.vi」、「file.vi への時間」、「2つのオブジェクト detect.vi」は、メインのデータ収集プログラム「FlyTracking--Six zones.vi」を実行するために利用可能でなければならないサブルーチンが含まれています。
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision入力ソフトウェア 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6	Wavemetric, Inc.		マクロ用プラットフォーム:フライトラッキング用データ分析--シックスゾーン
Basler scA1390-17fm	National Instruments	779980-01	デジタルカメラ 注:カメラ用ドライバー Baslerweb.com
8mmレンズ	National Instruments	780024-01	Baslerデジタルカメラ用レンズ
すりガラス ディフューザープレート	Edmund Optics	custom	拡散光、25 cm x 30 cm
USNo. 100	フィッシャー・サイエンティフィ	04-881X	ふるい (公称開口数 150 μm
照明オプション 1
LED バックライト 660 nm (20 cm x 20 cm)	Spectra West	BL47192	、よりシンプルですが、より高価な照明オプションです。
LEDバックライト	用電源 Spectra West
Lighting Option 2
>660 nm LEDs	Superbrightleds	RL5R1330	Wavelength 660 nm (14.7インチ x 9.75インチパネル用約7 x 7 LEDアレイ)
リニアDC電源	GW Instek	GPS-1830D	LEDパネル用電源
無はんだブレッドボード	Digikey	922354-ND	LED用ブレッドボード