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方法論記事

無血清全胚培養系で、マウス胚発生

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DOI:

10.3791/50803

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2014年3月1日

 , 
1Neuroscience Division of the Biomedical & Health Sciences Institute, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

この記事について

サマリー

胚培養に利用される血清は、特にシグナル伝達の相互作用を含む研究での実験の結果に影響を与えることができ、未知のコンポーネントが含まれています。ここでは、無血清酸素化培養系を利用し、16〜40時間培養妊娠中期のマウス胚が子宮内で発生中の胚に匹敵する形態的発展を示すことを示している。

要約

妊娠中期段階のマウス胚の酸素圧延ボトル培養系で商業的に入手可能な幹細胞培地補充物から調製された無血清培地を用いて培養した。 E10.5でのマウス胚を慎重に無傷の卵黄嚢と子宮から単離し、卵黄嚢と胎児の血管の連続性を維持しながら、正確な外科的手技を含むプロセスにおいて胚をゆっくりと卵黄嚢から体外た。無傷の卵黄嚢または削除卵黄嚢を用いて調製した胚と比較して、これらの胚は、優れた生存率と同様の条件下で培養し、発生の進行を示した。我々は、これらのマウス胚は、ときに16〜40時間、37℃で95％O圧延ボトル培養装置での2/5％CO 2の雰囲気中で定義された培地で培養し、匹敵する形態学的成長と発展を示すことを示して胚は子宮内での開発。我々は目を信じるこの方法は、胚器官形成において重要なシグナル伝達相互作用を研究するために全胚培養を利用する必要が捜査のために有用である。

概要

全体の胚を用いた体外培養法では子宮内でアクセスしにくい胚の器官形成に関与するメカニズムのシグナリングの研究に非常に適しています。全胚組織の完全性を提供し、必要不可欠なシグナル伝達機構の適時発生に重要である組織の相互作用のための適切なサポート器官形成中に異なる細胞プロセスのため。全胚培養物は、移植研究、遺伝的および組織操作、ビード移植研究、毒物学的研究等のような用途の過多のためのプラットフォームを提供しているが、現在利用胚培養システムは、胚の適切な成長および維持のために血清に主に依存している文化1-9。

血清は、培養培地6-8、10、11 10〜100％の範囲の主要成分の一つとして利用されている。;しかし、血清の組成物は、明確なものではなく、動物に、動物異なり、血清が収集されるたびにすることができる。血清の実験室の準備は時間がかかり、厳しい手順が含まれますが、血清調達は、商業的に異なるロット間でかなりのばらつきを示し、実験的なコストを発生させます。これらに加え、血清は、潜在的に特定の実験の結果に影響を与えることができ、このような成長因子、ホルモン、または他のタンパク質などの未知の要因、組織の相互作用において重要なシグナル伝達分子の研究を含むことを特に含むことができる。研究は、培養物への血清の添加は潜在的にそのようなサイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）および分裂促進シグナル伝達およびホスホイノシチド3に関与するタンパク質（PI 3） -キナーゼ経路の12-14シグナルのような特定のシグナル伝達分子の細胞内レベルを変化させることができることを示している。これらとは逆に、無血清培養系は、抗原を含まない環境の利点を提供する細胞プロセスを変化させ、実験間の一貫性を可能にすることができ、生物学的に活性な酵素から禁欲。

本研究では、37℃で圧延ボトル培養装置で95％O 2/5％CO 2の雰囲気中で培養妊娠中期段階の胚全体に市販されている幹細胞培地補充物から調製された無血清培地を利用したC 15,16°。これらの定義された条件の下で16から40時間培養したマウス胚は、細胞の増殖、遊走、分化および組織の相互作用の適切なレベルを示す全体的な胚の体と、心臓、手足、脳や目などの異なる構造の形態的発展の進行を示した。眼などの複雑な器官系の1のため、培養中の胚発生の分子解析はEMBRで眼組織で観察されたものと一致するように、眼の開発を明らかにした（準備中、Kalaskarとローダーデール）の子宮内での開発ヨーヨー。したがって、私たちは、妊娠中期段階で培養したマウス胚は、 子宮内で発生中の胚で観察されたものに匹敵する進歩的な成長と形態的発展を示すことを示している。

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プロトコル

マウス胚培養：

すべての実験手順を見直し、継続的な規制監督を維持グルジア機関動物実験委員会、大学によって承認されたプロトコル番号のA2010 07から119、次の健康ガイドラインの国立研究所に厳密に従って行った。

1。培養培地の調製

  1. ノックアウトDMEM、ノックアウト血清代替（KSR）（10％）、N-2サプリメント（1×）、アルブミン、ウシ血清から（2％）、ペニシリン（以下の量で市販されている幹細胞培地およびサプリメントを用いて培地を調製50 IU / ml）を、ストレプトマイシン（50μg/ ml）を、およびアンホテリシン-B（1.25μg/ ml）を。李を参照して、抗真菌剤を添加して特定の試薬 ​​や機器の詳細については、抗生物質の濃度の2倍を（使用して：調製した培養培地は、以前に以下のように変更して15を説明したものと同様であるマテリアルのST）。
    注：以前に使用され（ムーア·スコットら 15）のような抗生物質の濃度は、胚培養物は24時間の期間まで搬送するために十分であった。培養は24時間を超えて継続したときしかし、我々は、培養物の汚染を経験し、これは正常に抗生物質濃度を倍にすることによって制御した。
  2. 4℃で、またはメーカーの推奨に従って、-20℃でメディアコンポーネントを格納します。 KSRとN-2サプリメントは凍結融解の繰り返しを避けるために、-20℃で一定分量で保存してください。一度開いたノックアウトDMEMを、製造者の推奨に従って30日以内に利用されるべきである。使用前に、37℃の水浴中で成分を温め
  3. 無菌条件下でのメディアを準備します。培養フードでそれらを配置する前に70％アルコールを噴霧して培地成分を含むすべての機器や瓶の表面を消毒。
  4. 培地成分は、滅菌ビーカーに直接フィルターシステム（コーニング）のいずれかで混合することができる。最初のノックアウトDMEM中にアルブミン粉末を追加します。アルブミンは、完全に溶解するまで穏やかに振とうして完全に混合する。次いで、N-2サプリメント、KSRと抗生物質を追加し、ピペッターを使用して完全に混合する。次いで、真空吸引により0.22μmの孔径のフィルターを用いて培地を滅菌濾過する。使用するまで4℃で50ミリリットルコニカルチューブとストアにメディアを分注する。一旦調製メディアは、培養のために4〜5日以内に使用しなければならない。

2。文化の機器の準備

  1. ガラス培養ボトルとゴムコルクを殺菌。アルミ箔で培養瓶をラップし、水のビーカーにゴムコークスボトルを配置し、オートクレーブで滅菌する。
  2. 文化を開始する前に、70％アルコールスプレーし、37℃に加温して、培養室（精密インキュベータユニット）滅菌する。培養チャンバは、Eである培養ボトルを保持している中央のローリングディスクと皮肉を言った。チャンバ内へのガス流は、圧力計によって調節され、流量は、端部にガラス管中の水を介しての気泡の流出を観察することによって調整することができる。このローリングボトル培養装置は、新機能とコックロフト17によって導入され、元の装置の変形バージョンです。
  3. 培養室に95％O 2/5％CO 2のガス混合物を含有するガスボンベを接続した50cc /分の流速を与え、十分な酸素供給を確実にする"1秒に1回の気泡として「ガス流量を調整する培養胚へ。

3。マウス胚コレクションと文化のための準備

  1. 野生型マウス胚を得るために、我々は、C57BL/6J及びCD-1（チャールズ·リバー·ラボラトリーズ）の遺伝的バックグラウンド系統のマウスを用いた。
  2. 毎日の朝の膣プラグ用雌マウスをチェックしてください。目を発見当日の正午E膣プラグがE0.5 DPC（日性交後）として考慮されるべきである。
  3. 標準プロトコルに従って妊娠マウスを安楽死させることで、E10.5、DPCでマウス胚を収集します。動物の安楽死（2013年）のためのアメリカ獣医師会（AVMA）のガイドラインで指定されたマウスをCO 2吸入装置を使用して安楽死させた。死を確実にするために、頸椎脱臼がCO 2への曝露後に実施した。
  4. 機器に腹部の毛の付着を回避するために腹側の腹部表面に70％エタノールをスプレー。その後、子宮を見つけるために鉗子をmicrodissectingに鋭い鈍い運転はさみや4-3/4のペアを使用して腹腹腔を開きます。 microdissecting鉗子4を使用すると、子宮全体を持ち上げ、子宮体時および子宮角の先端に軽い操作ハサミで切断することにより、本体から分離。
  5. すぐに洗い流し1X PBS中子宮全体を37℃に加温し子宮に任意の血液付着を除去し、直ちにDMEMに配置するペトリ皿中で37℃に温めた。さらに使用する前に70％エタノールスプレーで楽器を殺菌。
    注意：PBS、DMEMおよび培養液を含むソリューションを予熱し、全体の手順の間、37℃でそれらを維持することをお勧めします。
  6. 解剖顕微鏡下で、子宮は分節軽い操作ハサミで切開しなければならない。これは、（末端を平滑化）修飾microdissectingのピンセットを穏やかに開口部を広げること挿通可能なセグメント化された子宮の両側に小さな開口を生じる。これはゆっく​​りライヘルト膜と頭頂卵黄嚢（PYS）を公開するmicrodissectingのピンセットで引き裂くことによって除去することができる胎盤脱落膜の露出を可能にします。ピンセットの1辺を使用すると、静かにPYSとともにライヘルト膜を貫通し、目とは別E基盤となる内臓卵黄嚢（VYS）はそのままVYSで胚を露出するために層を形成する。栄養膜コーンと栄養外胚葉誘導体は、胎盤の脱落膜の有無ライヘルト膜のいずれかで削除することができます。ケアは胚がすぐに飛び出しとしてVYSの破裂を避けるようにしなければならない。
  7. 無傷VYS有する胚を、次いで、培養培地をプラスチックトランスファーピペットを用いて37℃に温め含むペトリ皿に移されるべきである。
    注意：すぐに子宮から分離した後、培養培地に移し、培養中の胚のより良い発展のために役立ちます。
  8. 小さな開口部は、主要な血管を避けmicrodissectingのピンセットで卵黄嚢になされるべきである。ピンセットの鋭い一対穏やか頭部領域に隣接する領域に穿孔することによって、開口部を作製するために使用することができる。代替的に鈍いピンセット二対の小さな開口部を作るために卵黄嚢、穏やかに涙を保持するために使用することができる。ゆっくり胚の頭にフィットするだけで十分な大きさにピンセットで拡張することで開口部を広げる。密接に胚をラップしている羊膜優しく身体から離れて保持され、ピンセットを使用して引き裂かれるべきである。卵黄嚢15のそれと胚血管系の整合性を維持しながら、胚の頭とそれ以降の全胚を静かに卵黄嚢から体外にする必要があります。
    注意：卵黄嚢血管系への任意の損傷は、潜在的に、培養中の胚の発達に影響を与えることができます。損傷した血管系を有するこのような胚培養のために使用すべきではないし、後で廃棄することができる胚のステージング用に使用することができます。
  9. 胚ステージング基準：各グループから少なくとも2胚について体節の数（複数可）をカウントすることにより、四肢と目、形態とステージ、身体と頭の大きさなどの形態学的基準によって解剖顕微鏡およびグループの下胚を調べます。
    <強い>注意：通常胚が子宮内で開発中の同腹ショーの違いから得られ、体の大きさ、形態的特徴や体節の数が異なる。しかし、我々は我々の形態学的基準によってグループ化された胚は、通常、同様の体節の数（±1）を示したことがわかった。この理由から、これは、培養を開始するための時間を遅らせるであろうように、各胚のための体節をカウントする必要はない。
    注：培養のための体節をカウントするために使用された胚を使用しないでください。培養を開始する時間遅延を回避するために、他の胚培養開始後の体節を数える。子宮からの分離後の培養に遅れが出た胚は通常、貧しい発展を示す。
  10. 新鮮な培養培地でペトリ皿にすぐに胚を移し、37℃に加温し、胚は再度滅菌culturでペトリ皿に転送されるべき培養フードに持っていくEメディアは、メディアとの培養瓶にそれらを入れる前に培養を開始します。
    注：胚のために複数のメディア転送を培養は、胚の収集と解剖の異なるステップを培養フード内に設置されなかった解剖顕微鏡下で実施したように、汚染の防止に役立ちます前に。
    ゴミサイズが大きい（> 12胚）である場合は、ステップ半分の胚や文化を開始したり、培養液で皿に入れ、37℃のCO 2インキュベータに入れてください。注意胚を長期間（> 35〜40分）のために外に残っていたとき、我々は減速するハートビートを観察し、これは文化の中で後の開発に影響を与えます。

4。マウス胚を培養する

  1. 培養フードでオートクレーブ培養瓶を開き、適切にラベルを付けます。転写培地3mlを、tの各々に37℃に温め彼は、ボトルや、マウス胚を滅菌プラスチックホールピペットを用いて培養ボトルに静かに転送する必要があります。培養ボトルは、培養装置内のローリングディスクに培養瓶を保持するために役立つゴムコークスボトルでキャップされるべきである。
    注：メディアで培養瓶、マウスを安楽死前に調製し、培養装置のローリングディスク上に配置することができる。これは、培養ボトル中に胚の転送に時間が短縮される。
    注：マウス胚は、個々に、または同じ培養ボトル中の二、三の胚と共培養物として培養することができる。
  2. 培養ボトルに無菌的37℃で培養装置へ搬送し、しっかりとゴムコルクと転がりディスクの穴にそれらをフックする必要があります。 EMBRの自由浮上を可能にする、毎分35回転（rpm）の一定速度で回転するローリングディスクの電源を入れますメディアでのYOSとも胚組織による遊離ガス交換に役立ちます。培養チャンバに接続されたシリンダからのガスは培養ボトルに圧延ディスク、ゴムコルク流れる。
  3. 文化を定期的に16〜40時間とするための胚はガス流出、培養室の温度を確認してください。
    注：培養液中のマウス胚操作：胚を少なくとも30分間培養条件に適応しましょう。次いで、パフォーマンスが低下し、微弱な心拍を示す胚を廃棄することができ、残りの胚は、さらなる操作の研究のために利用することができる。例えば、エレクトロポレーション5,9,16、マイクロインジェクション18、ビード16移植、薬物治療や他の手順などの胚操作は、この時点で行うことができる。我々は、正常に初期の眼の発生におけるそれらの役割を研究するために、特定のシグナル伝達分子で処理しアフィゲルアガロースビーズの移植を行う。胚の後操作は、新鮮な培地中に戻さ、培養を継続することができる。
  4. 9月10日時間と文化の18〜19時間の培養を40時間継続した後に特定の間隔で完全に新鮮な培地で培養培地を交換してください。
    注：培養は16〜18時間で停止した場合に培養培地の交換が必要とされない場合があります。
  5. 文化の中での成功の尺度：培養での胚の成長は体の大きさの増加、体節の数や頭、手足、心臓や目の形態学的発達によって評価されるべきであるが、培養中の胚の生存率は、体内に表示心拍、血液の​​循環によって決定されるべきである。
  6. E11.0 DPC（〜40〜41秒）とE12.0 DPC（〜49-50 s）で子宮内発生した胚では 、それぞれ16〜18時間と38〜40時間、培養した胚を比較するためのコントロールとして使用する必要があります。
  7. 培養中および子宮内段階で CAPTが可能のための種々の時点で胚発生解剖顕微鏡下ured。スポットイメージングソフトウェアは、画像をキャプチャするために利用され、それ以降の画像処理ソフトウェアを用いて処理した。

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結果

マウス胚の開発は子宮外子宮が受精卵を培養する時に、本 ​​体から分離された時点から開始して、複数の要因によって異なります。 図1に示されるように、手順は、身体から妊娠子宮の分離（ 図1A）、インタクトな卵黄嚢（ 図1B）を有する胚の単離、を含む一連の工程を含む、卵黄嚢からの胚の具象化（ 図1C）、および37℃でのローリングボトル培養装置で95％O 2/5％CO 2の雰囲気下で無血清培地中で胚を培養することすぐに子宮から分離した後、培養培地に移したときに胚を100％の生存率を示した。 16〜40時間培養して、 途上同等の段階の胚で観察されたものと成長と形態的発展が同程度の展示、これらの培養条件、マウス胚の下で子宮内（ 図2）。

E10.5（〜34〜35秒）（ 図2A）16〜40時間培養で生存し、十分に35秒の段階を超えて開発...

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ディスカッション

妊娠中期段階のマウス胚は、37℃でのローリングボトル培養装置で95％O 2/5％CO 2の雰囲気下で無血清培地中で培養した。胚発生の元の子宮は、子宮は培養終了します（ 図1）に安楽死させたマウスから単離した時点から手術中の各段階で複数の要因に決定的に依存していた。現像に影響を与えた最も重要な要因は、培養を開始するのに要する時間であった。最も注意が必要手順の間に他の重要な点は、このような完全な卵黄子宮から嚢と卵黄嚢からの胚の具象化した胚の分離などの工程を含む。げっ歯類は、円盤状の胎盤を持っているように、子宮の分節解剖は胎盤の脱落膜がやや角部に損傷を受けた場合であっても、胚への血液供給を損傷していませんでした。実際、これはEIに小さな開口部を残した鈍ピンセットでそっと開いて子宮とそのまま卵黄嚢と胚の容易な単離を可能に胎盤の脱落膜を引き裂くように挿入可能なT​​HERが終了。しかし、卵黄嚢からの胚の具象化の次のステップは、卵黄嚢における主要な血管の損傷は、潜在的に、培養中の胚の発達に影響を与えるだろうという点で非常に重要です。胚は卵黄嚢に血管系の完全性を維持した卵黄嚢か...

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開示事項

私たちはどんな競合する経済的利益を持っていません。

謝辞

我々は、培養技術との有益な助言のために博士ジュリー·ゴードン博士ナンシーマンリーに感謝したいと思います。この作品は子供の緑内障財団とシャロン·スチュワート無虹彩症研究の信頼によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ノックアウト DMEMInvitrogen10829-018
ノックアウト血清補充Invitrogen10828-028
N-2 サプリメントInvitrogen17502-048在庫:100x
アルブミン、ウシ血清SigmaA9418-50G在庫:100%
抗生物質 - 抗真菌剤Cellgro30-004-Cl在庫:ペニシリン(10,000 IU / ml);ストレプトマイシン(10,000 & micro;グラム/ミリリットル;アムホテリシン(250 µg/ml) 
DMEMの  Cellgro15-013-CV
精密インキュベーターユニットB.T.C. Engineering Milton Cambridge EnglandId.No. 840-374
回転ユニット用ガラス瓶B.T.C. Engineering
シリコーンゴムコルクB.T.C. Engineering
95% O2/5% CO2 CylinderAirGas Inc.
ステミSV11アポ解剖顕微鏡ツァイス
ステミSV6ツァイス
CO2ウォータージャケットインキュベーターフォーマサイエンティフィックモデル:3110
カルチャーフードヌアイレ 生物学的安全キャビネット クラスII タイプA2モデル:Nu-425-600
ウォーターバスフィッシャーサイエンティフィックIsoTemp205
計量天秤メトラー・トレドAG285
遠心分離管、50 mlコーニング430291
軽量操作ハサミRobozRS-6702
操作用シャープ - 鈍いハサミ RobozRS-6812
マイクロ解剖鉗子、RobozRS-5211
解剖鉗子-ハドソン(cWALD)、RobozRS-5237
5/45)RobozRS-5005修正-鋭い端が鈍くなりました
マイクロ解剖ピンセット(5)RobozRS-5060修正-鋭い端が鈍くなりました
マイクロダイセクションピンセット (55)RobozRS-5063修正 - 鋭い端が鈍くなった
計器トレイRobozRT-1401S
計器トレイ蓋RobozRT-1401L
ペトリ皿-100 mmフィッシャーサイエンティフィック087571Z
ペトリ皿-60 mmフィッシャーサイエンティフィ0875713A
ペトリ皿-35 mmフィッシャーサイエンティフィック0875711YZ
フィルターシステム(0.22&マイクロ;m 酢酸セルロース)-150 mlCorning431153
フィルターシステム (0.22 & micro;m酢酸セルロース)-250 mlコーニング430756
フィルターシステム(0.22&マイクロ;m 酢酸セルロース)-500 mlCorning430758
Pipet-aid PipettorDrummond Scientific Co.D57849
血清ピペット-10 mlVWR89130-898
使い捨て血清ピペット-25 mlCorning4251
トランスファーピペット - 7.7 mlThermo Scientific202-20S
溶液 顕微鏡 マイクロマイクロ解剖ピンセットの4-3 / 4(ック

参考文献

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