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方法論記事

を光学的に検出 E.大腸菌のバクテリア

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DOI:

10.3791/50805

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2013年11月20日

 ,  , 
1Department of Biotechnology and Food Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Inter-Departmental Program of Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Russell Berrie Nanotechnology Institute, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

迅速な細菌検出用ラベルフリー光学バイオセンサーを導入する。バイオセンサーは、直接的にその表面上に標的細菌の細胞を捕捉するように設計されているナノ多孔質Siに基づいている。私たちは、捕捉プローブとして、多孔質のトランスデューサに固定化モノクローナル抗体を使用しています。我々の研究は、（例えば、細胞溶解など）なし優先検体処理に数分以内に、低濃度の細菌の検出のためのこれらのバイオセンサーの適用可能性を実証する。

要約

ナノ多孔質Siに基づくラベルフリー光学バイオセンサーは、モデル微生物として、 大腸菌 K12細菌の迅速な捕捉および検出のために設計されています。研究された試料の前処理なし（細胞溶解などにより ） が必要とされないながら、バイオセンサーは、その表面に標的細菌細胞の直接結合に依存しています。メソポーラスSi薄膜は、バイオセンサの光変換素子として使用される。白色光照明の下では、多孔質層は、その反射率スペクトルでよく解像ファブリ·ペロー干渉縞を表示する。高速フーリエ変換は、単一のピーク反射率データの結果に変換（FFT）を適用する。 FFTピークの強度の変化が監視される。したがって、標的細菌がバイオセンサー表面上に捕獲抗体 - 抗原相互作用を介して、細菌付着の「リアルタイム」の観察を可能にする、FFTのピークの強度における測定可能な変化を誘導する。 ntの ">電気化学的陽極酸化法により製造されたメソポーラスSi膜は、標的細菌に特異的なモノクローナル抗体とコンジュゲートされている。抗体の固定化、免疫活性および特異性を、蛍光標​​識実験により確認されている。バイオセンサーが曝露されると標的細菌は、細胞を直接抗体修飾多孔Si表面上に捕捉され、これらの特異的捕捉のイベントは、バイオセンサーの薄膜光干渉スペクトルの強度変化をもたらす。我々は、これらのバイオセンサ（検出比較的低い細菌濃度を検出することができることを実証時間未満で10 4細胞/ ml）の上限。

概要

病原菌の早期かつ正確な識別は、食品や水の安全性、環境モニタリング、およびポイントオブケア診断の1のために極めて重要である。伝統的な微生物学技術は時間がかかり、面倒であり、「リアルタイム」で微生物を検出する能力を欠いているか、実験室環境の外ように、バイオセンサーは、これらの課題2-5を満たすように進化している。

近年では、多孔質Si（PSI）は、センサーやバイオセンサー6月20日の設計のための有望なプラットフォームとして浮上している。過去十年間PSI-ベースの光学センサーやバイオセンサーに関する多くの研究は、21,22を発表した。ナノ構造のPSi層は、典型的には単結晶Siウェハからの電気化学陽極エッチングにより作製される。ナノ材料は、このような大規模な表面と、自由体積など多くの有利な特性を示し、その結果、PSI制御され、調整可能な最適可能な孔の大きさCALの特性10,16。このような光ルミネ8,11と白の光の反射率に基づく干渉7,19などのPSI層の光学特性は、強く、環境条件の影響を受けている。フォトルミネッセンススペクトルの変調として又は反射率スペクトル10の波長シフトとして観察されたフィルムの平均屈折率の変化、多孔質層における結果内でゲスト分子/標的分析物の捕捉。

PSiは、光バイオセンサー技術の広大な革新が、細菌検出6,8,20,23-29ためのPSI-ベースのプラットフォームでのみ報告は少ない。さらに、これらの概念実証研究のほとんどは、「間接的」細菌検出を実証した。したがって、細胞の溶解は、一般的に従来検討細菌に特徴的な29、標的タンパク質/ DNA断片を抽出するために必要とされる。我々のアプローチを直接標的細菌を捕捉することであるのPSIバイオセンサーへの細胞。したがって、細菌を標的とする特異的であるモノクローナル抗体は、多孔質表面上に固定化される。抗体-抗原相互作用を介して、細菌細胞の結合は、バイオセンサーの表面に反射率スペクトル24-26の振幅（強度）の変化を誘導する。

本研究では、光PSI-ベースのバイオセンサーの構築に報告し、 大腸菌の検出（モデル微生物として使用される）（ 大腸菌 ）K12菌用のラベルフリーバイオセンシングプラットフォームとしての用途を示しています。監視対象光信号は、光によるファブリペロー薄膜干渉（ 図1A）へのPSiナノ構造からの反射である。光振幅/強度の変化は、細菌の迅速な検出および定量を可能にする、バイオセンサー表面上に標的細菌細胞の特異的な固定化に相関している。

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プロトコル

1。酸化された多孔性のSiO 2の調製

  1. 定電流で30秒間水性HFおよび無水エタノールの3:1（v / v）の溶液中でエッチングSiウエハ（片面が<100>面に研磨し、高濃度にドープされたp型、0.0008Ω·cm）で385ミリアンペア/ cm 2の密度。 HFは腐食性の高い液体であり、それは、細心の注意を払って処理する必要がありますのでご注意ください。
  2. 無水エタノールで得られた多孔質Siの（PSI）膜の表面を数回すすぎ、乾燥窒素ガス下でフィルムを乾燥させる。
  3. （オフにし、1時間、炉内に残して、800℃まで炉を加熱し、室温で炉内にサンプルを置き、周囲の空気中で1時間、800℃で管状炉中の新たエッチングのPSIサンプルを酸化炉のみ室温で炉からサンプルを削除します）。

2。 PSIO 2足場の生体機能化

  1. 酸化したPSi（PSIをインキュベートメル中で1時間（トリ-3）95％のO 2）のサンプル（MPTS）溶液（トルエン中108 mm）である。
  2. トルエン、メタノール、アセトンでシラン処理PSIO 2サンプルをすすぎ、乾燥窒素ガス下で乾燥させます。
  3. 100 mMのPEO-ヨードアセチルビオチン溶液を1ミリリットル中に30分間シラン変性PSIO 2サンプルをインキュベートする。
  4. 0.1Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液で数回、ビオチン処理PSIO 2サンプルを洗浄します。
  5. 100μg/ mlのストレプトアビジン（SA）の溶液1ミリリットル中に30分間ビオチン修飾PSIO 2サンプルをインキュベートする。
  6. 0.1MのPBS溶液で数回、SA処理PSIO 2サンプルを洗浄します。
  7. 100μg/ mlのビオチン化Eの1ミリリットル中に30分間その結果、SA-修正PSIO 2サンプルをインキュベート大腸菌モノクローナル抗体（免疫グロブリンG、IgG）の溶液または100μg/ mlのビオチン化ウサギIgGで（モノクローナル抗体のモデルとして）。

3。蛍光標識し、蛍光顕微鏡

  1. 15μg/ mlのフルオレセイン（FITC）でIgGを修飾された表面をインキュベート40分間抗ウサギIgGをタグ付け15μg/ mlのフルオレセイン（FITC）でコントロールとして抗マウスIgGタグ付き。
  2. 0.1MのPBS溶液で数回変更されたサンプルを洗浄します。
  3. 蛍光顕微鏡下でサンプルを調べる。

4。細菌培養物

  1. Eを養う大腸菌 K12（1Lの脱イオン水で培地組成：NaClを5gの酵母エキス5g、及びトリプトン10g）をルリアベルターニ（LB）培地5mlで10mlチューブ中の細菌。細菌は一晩37℃で振とう培養する
  2. 波長600nmでの光学密度（OD）を読み取ることにより、細菌濃度を監視します。 LB培地で一晩増殖させた後、細菌濃度を決定するために分光光度計を用いてOD 600を読む。細胞の数は悲惨ですOD 600の測定値（1 OD 600 = 10 8個/ ml）にCTLY比例。

5。細菌検出

  1. カスタムメイドのプレキシグラスフローセル中のIgGで修飾されたPSIO 2できちんとPSIO 2（対照として）サンプルを置きます。サンプルの反射率は、全ての測定中に同じ場所で測定されることを確実にするために、フローセルを修正します。
  2. Eでサンプルをインキュベート大腸菌 K12懸濁液（10 4細胞/ ml）を、室温で30分間インキュベートした。その後、30分間のW / V食塩水0.85％でセルをフラッシュすることによって、細菌懸濁物を除去します。
  3. 実験を通して反射率データの変化を監視する。全ての光学測定は、周囲の水性中で実施される必要がある。先に説明したように25,26スペクトルは、CCDスペクトロメーターを用いて収集し、高速フーリエ変換（FFT）を適用することによって分析されるべきである。
  4. 上の細菌の存在を確認バイオセンサ表面は、すぐにバイオセンシング実験後の直立光顕微鏡下での試料の観察による。

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結果

プロトコルのテキストセクションに記載したように酸化されたPSi（PSIO 2）膜が調製される。 図1Bは、熱酸化後に得られたPSi膜の高分解能走査電子顕微鏡写真を示す。 PSIO 2層は30〜500nmの範囲の直径を有する明確に定義された円筒状の細孔によって特徴付けられる。

モノクローナル抗体（IgG）の分子は、ビオチン-SAシステムと結合された十分に確立されたシラン化技術を用いてPSIO 2の表面上にグ ​​ラフトされている。詳細な合成スキームを図2に概説されている。まず、熱酸化表面がチオールシラン化表面（ 図2c）、その結果、MPTSによりシラン化されている。次のステップでは、活性化された表面は、ビオチン-SA架橋を介してビオチン修飾表面へのSAタンパク質の結合に続いて、SH-反応性ビオチンリンカー分子（ 図2d）とインキュベートする図2E）。バイオセンサー表面の機能化...

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ディスカッション

PSIO 2ナノ構造（ファブリペロー薄膜）に基づくラベルフリー光学免疫センサーは、製造されており、細菌検出用バイオセンサーとしての適用可能性が確認された。

修正とトラブルシューティング

免疫センサの設計の主要な関心事の一つは、バイオセンサの感度31,32の低下につながる可能性固体基板上に堆積及びパターニング中の望ましくないコンフォメーション変化を受けるための抗体の感受性である。この問題を最小限に抑えるために、PSIO 2表面への抗体の結合は、ビオチン-SAブリッジを介して達成される。 SAとビオチンは、一般に、それらの高い結合親和性（K dが約10 -13 M）に多くの生物工学用途で使用されている。ビオチン-SAリンクは、バイオセンサーの開発10,32,33,34で実践受容体固定化のための最も一般的な化学的性質の一つである。固定化抗体の接近は、固体表面とのIgG 31,35間の柔軟...

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開示事項

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

謝辞

この作品は、イスラエル科学財団（助成番号1118から1108と認可番号1146から1112年）と、みんなのクロール記念研究基金によってサポートされていました。 ESは感謝ラッセルBerrieのナノテクノロジー研究所の財政支援を認めるものです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Siウェーハシルトロニクス(株)高Bドープ、p型、0.0008Ω-cm抵抗率、<
50 mM Na2HPO4、17 mM NaH2PO4、および 68 mM NaCl を Milli-Q 水 (18.2 MΩ) に溶解して調製したPBS 緩衝液 (pH 7.4)
0.85 g NaCl を 100 mL Milli-Q 水 (18.2 MΩ) に溶解して調製生理食塩水 0.85% w/v
95% (3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン (MPTS)Sigma Aldrich Chemicals175617
PEO-iodoacetyl biotinSigma Aldrich ChemicalsB2059
Streptavidin (SA)Jackson ImmunoResearch Labs Inc.016-000-114
フルオレセイン(DTAF)-ストレプトアビジンJackson ImmunoResearch Labs Inc.016-010-084
ビオチン化ウサギIgG JacksonImmunoResearch Labs Inc.011-060-003
蛍光タグ付き抗ウサギIgG JacksonImmunoResearch Labs Inc.111-095-003
蛍光タグ付き抗マウスIgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.115-095-003
ビオチン化大腸菌抗体Jackson ImmunoResearch Labs Inc.1007
E. coli (K-12)は、テクニオンのシマ・ヤロン教授から寛大に提供されました
100> 配向水性 HF (48%)Merck 101513 Ethanol absolute Merck 818760した

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