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方法論記事

心筋梗塞マウスモデルにおけるMRIとPET

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DOI:

10.3791/50806

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2013年12月19日

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1Wolfson Brain Imaging Centre, Department of Clinical Neurosciences, Unversity of Cambridge, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3Behavioural and Clinical Neurosciences Institute, University of Cambridge

この記事について

サマリー

マウスの心臓のMRIおよびPETイメージングの実行方法について説明します。このプロトコルは、心筋梗塞と心不全のモデルにおける治療効果を評価するように調整されています。

要約

心筋梗塞は、西洋世界における主要な死因の一つです。マウスの心臓は人間の心臓に類似しているため、新しい治療戦略をテストするための理想的なモデルとなっています。

in vivo 磁気共鳴画像法 (MRI) は、明確な解剖学的詳細とともに心臓の優れたビューを非侵襲的に提供し、正確な機能評価に使用できます。造影剤は、組織の生存率の基本的な測定を提供できますが、これらは非特異的です。陽電子放出断層撮影法(PET)は、分子イメージングに非常に特異的な補完的な技術ですが、MRIの解剖学的詳細が欠けています。これらの技術を併用することで、疾患の心臓の評価と治療後の回復のための高感度で特異的かつ定量的なツールを提供します。

この論文では、これらの方法が急性心筋梗塞のマウスモデルでどのように行われているかを説明します。ここで説明する手順は、推定される保護薬物治療の評価のために設計されました。MRIを用いて後期ガドリニウム増強に伴う収縮機能や梗塞の大きさを測定し、PETとフルオロデオキシグルコース(FDG)を用いて梗塞領域の代謝機能を評価した。この論文では、スライス計画、正確なゲーティング、薬物送達、画像のセグメンテーション、マルチモーダルコレジストレーションなどの実用的な側面に焦点を当てています。ここで紹介する方法は、高いスループットを維持しながら、優れた再現性と精度を実現します。

概要

前臨床試験における心筋梗塞(MI)の新たな治療戦略の有効性を測定するためには、急性期と長期転帰の評価が必要である1。組織病理学、心臓内カテーテル2、ex vivo心臓モデル3などの方法は、マウスの前臨床試験に一般的に使用されます。しかし、ex vivo や高侵襲的な方法で治療をフォローアップすることは不可能です。in vivo磁気共鳴画像法(MRI)や陽電子放出断層撮影法(PET)などの非侵襲的測定技術により、単一被験者の疾患病期分類の縦断的実験デザインが可能になります。Cine-MRI は、左心室質量 (LVM)、駆出率 (EF)、心拍出量 (CO) などの全体的な機能パラメーターを導き出すために使用されます。さらに、ガドリニウム造影剤の注射後、梗塞での灌流障害とウォッシュアウトにより、後期ガドリニウム増強(LGE)MRIで組織の生存率を評価できます。補完的に、PETは、組織の代謝を評価するために、放射性標識分子の感度測定を提供します。これらの技術の高精度により、心筋梗塞を標的とする新薬の試験に必要な動物の数を大幅に減らすことができます。

PETとMRIの手順が関与しており、慎重に設計されたプロトコルの再現性を維持するのは困難です。患者のためにクリニックで確立された手順は、マウスで使用するために大幅な変更が必要です、なぜなら、そのかなり速い心拍数と心臓の寸法が小さいためです4。ベースライン時と誘発された傷害に対する反応の両方で、個々の被験者間で大きなばらつきがあるため、治療効果を確立するにはかなりの数のマウスが必要です。

本報告では、マウスの心臓の逐次PET/MRIイメージングの方法について述べる。どちらのモダリティも、尾静脈を介して送達される静脈内造影剤を使用します。MRI は、Cine-MRI5 による標準的な評価と、以前の研究6 で説明した LGE の最適なプロトコルで構成されています。MRI検査の全時間は30分です。私たちは、器具のベッドに一貫したフィッティングを得ているので、機械間で同じモニタリングおよび麻酔薬送達装置を備えたプラットフォーム上で動物を移すことが可能です。PETスキャンは、スキャンが開始されるとin situ注入で45分間続きます。最後のステップは、共レジストレーション後にMRI画像とPET画像の両方からパラメータを測定することです。

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プロトコル

この研究のすべての構成要素は、1986年の英国動物(科学的手続き)法に従って、ケンブリッジ大学の倫理審査委員会の承認を得て実施されました。

1. 動物の調理法

  1. 外科的介入で梗塞を誘発する7,8.急性期での測定には、介入の24時間後に画像診断を行います。
  2. 薬物送達用の細いシリンジチューブを準備し、一方の端に25Gの針が付いたシリンジをもう一方の端に取り付けます。ラインの長さは、磁石のボアの外側(約1.5 m)から注入できる長さにする必要があります。
  3. 食塩水でGadovistを希釈した溶液を調製します。マウスの体重に合わせて調整された3 mmol/kgを達成するために、適切な量の溶液をシリンジにセットします。注入量は50〜100μlに保ちます。
  4. Gadovistソリューションをラインに事前入力します。血液凝固を避けるために、カニューレに近いラインの先端をヘパリン生理食塩水で満たします。
  5. 必要に応じて、マウスをインダクションボックスに置き、O2 1 L / minに3%イソフルランを入れた麻酔を3〜5分間行います。正しい麻酔の深さは、呼吸速度が遅くなることで特定でき、呼吸数は70bpm未満に減少するはずです。
  6. 事前に準備したラインを使用して尾静脈をカニューレで切り、手術中に針を所定の位置に保持するためにサージカルテープを使用します。

2. 動物の位置決めと監視

  1. マウスをMRIベッドに置き、必要に応じて麻酔維持のために1 L / min O2に1〜2%イソフルランを送達します。呼吸数を20〜70bpmに維持します。
  2. MRIコイルの中心がマウスの心臓の位置より上にあることを確認します。
  3. 呼吸枕センサーを横隔膜の少し下に配置して、呼吸を監視します。潤滑済みのカバースリップを備えた直腸温度計を使用して、コア温度を監視します。スキャン中の温度が37±2°Cで一定に保たれていることを確認してください。
  4. ECGモニタリングでは、つま先の手のひらが完全に開いていることを確認しながら、前足と左後足に3つの電極を配置します。ECGを導出するために、最高の信号品質を達成する電極のペアを選択します。ECGケーブルを一緒にねじって、パルスシーケンスを実行するときにECG信号を著しく破損するMRI共振周波数で共振回路を形成しないようにします。
  5. 電極がテープを使用してベッドにしっかりと取り付けられていることを確認してください。電極とノーズコーンは、全手順で動物を所定の位置に保持します。
  6. 水で加熱されたブランケットをマウスの上に置き、モニターリード線とコイルリード線をカプセル化して体温を維持します。
  7. ベッドのレーザーを心臓の位置に合わせ、つま先の前線を目印にします。これを自動ベッドを使用して磁石の等角中心に配置します。
  8. MRIシステムの標準調整を実行します。
  9. ECGのR波を検出するように監視装置を設定します。各マウスのしきい値とイメージングセッション内のしきい値を調整して、信頼性の高いトリガーが得られるようにします。

3. MRI検査

  1. パイロット イメージを取得して、多平面パイロット イメージを計画します。
  2. 画像内の心臓は、そのフローアーティファクトによって最も簡単に識別できます。画像でマウスがコイルまたはアイソセンタの中心にうまく配置されていないことが示されている場合は、ベッドを引っ込めて配置を繰り返します。
  3. ECGゲーティングをオンにした状態で、向きごとに5つのスライスと3cmの視野(FOV)を持つ高速グラディエントエコー(GE)画像を取得します。
  4. PET共レジストレーションのために、心臓を中心とした非標識3Dスキャンを実行します(スキャンパラメータについては表1を参照)。このスキャンの実行中に、連続するスキャンを計画します。
  5. 4チャンバー(4 ch)ビュースキャンを計画します(スキャンパラメータについては表1を参照)。これにより、頂点と三尖弁および僧帽弁が切断され、4つのチャンバーすべてが表示されます。
  6. 2チャンバー(2チャンネル)ビューを計画します(スキャンパラメータについては表1を参照)。それは頂点と三尖弁を切断し、左心房と心室を示す必要があります。
  7. 2 つの長軸ビューの形状をクロスチェックします。スライス計画が最適でない場合は、スキャンを繰り返します。
  8. 4チャンネルと2チャンネルビューの両方に直交する短軸スライスのスタックを計画します(スキャンパラメータについては表1を参照)。血液プールのない最初の頂端スライスからRVのない最初の基底スライスまで、心臓全体を覆います。

4. 後期ガドリニウムの強化

  1. ゲートの空白時間を増やして、他のすべての心拍を取得します(TR = 550-750ミリ秒)。ECG の拡張末期に取得が行われるように、遅延を適用する必要があります。
  2. 注入前に低分解能バージョンのLGEシーケンス(スキャンパラメータについては表1を参照)を実行して、ゲーティングが正しく、フローアーチファクトが存在しないことを確認します。拡張期にフローアーチファクトが存在する場合は、遅延をわずかに増やすと(つまり、収縮期の非常に早い段階でのイメージング)、それらを取り除くことができます。
  3. Gadovist溶液の注入を15秒かけてゆっくりと着実に行います。
  4. 注入後にLGEイメージングを開始します(スキャンパラメータについては表1を参照)。最初の15分以内にイメージングすると、良好なコントラストが得られます。

5. PETイメージング

  1. MRIベッドをPETスキャナーに移し、レシーバーを所定の位置に置き、PETベッドサポートにしっかりと固定します。麻酔薬と監視機器を接続します。
  2. 心臓をPET視野の中央に配置し、ベッドを軸方向にのみ動かします。
  3. ゲルマニウム源を使用したシングルパス伝送スキャンを取得します。
  4. 放射性標識されたFDGをシリンジで容器から10〜30 Mbq抽出します。放射性物質の取り扱いには十分注意してください。井戸カウンターで活動を測定します。マウスの適切な注入量は50〜100μlの範囲ですが、容量が少なすぎる場合は、溶液を生理食塩水で希釈してください。
  5. エミッションスキャンを開始し、リストモードゲートPETを45分間取得するように設定し、同時に、トレーサーを15秒以上ゆっくりと着実に注入します。放射性トレーサー全体を送達するのに十分な生理食塩水でラインを洗い流します。
  6. 動物の健康のために、3回の注射で300μlを超えないようにしてください(つまり、Gadovist、FDG、flush)。
  7. シリンジをウェルカウンターに戻し、残留活性を測定します。
  8. 放射性物質の取り扱いについては、常に地域の規則に従ってください。

6. MRIセグメンテーション

  1. Cine-MRI 画像を Segment v1.9 9 に読み込みます。
  2. セグメンテーションの自動ツールを実行します。心室の内側の点から始めて、これらは最適な一致が見つかるまで推定された心室壁を膨らませます。
  3. 収縮期末期 (ES) と拡張期末期 (ED) で LV と RV を手動で描き、それぞれグローバル LV ボリュームが最大および最小のフレームとして定義されます。全体を通して乳頭筋と小柱を除外します。コントラストに一貫性がないと、部分ボリューム効果の解釈が異なるため、画像のコントラストを調整しないでください。
  4. 図6に示すように、LV質量計算のためにESおよびEDの心外膜を手動で描きます。心筋は非圧縮性であるため、LV質量はESとEDで一貫している必要があります。差が5%を超える場合は、オペレーターのエラーの可能性が高いため、これらを確認する必要があります。
  5. 心室の基部で、図6に示すように直線を使用して心室と心室を区別し、長軸ビューの助けを借りてスライスの角度を特定します。
  6. 長軸ビューのセグメンテーションをクロスチェックします。
  7. LGE画像の傷跡領域を描きます。瘢痕の体積をシネイメージングで導き出された LV 質量で割って、梗塞を LV のパーセンテージとして求めます。

7. PET分析とMRIとの同時登録

  1. 3D フィルター付きバックプロジェクション アルゴリズムを使用して PET 画像を再構築し、標準取り込み値を示す Nifti 形式 (http://nifti.nimh.nih.gov/) にデータをエクスポートします。
  2. PETとMRIシステム間の固定変換マトリックスを使用して、すべてのPET画像を変換します。マトリックスが不明な場合は、幾何学的ファントムに放射性物質を充填してMRIを行い、ベッドをPETに移動してエミッションスキャンを行います。PETをMRI画像に変換するために得られたマトリックスは、PETからMRIシステムに移行するための標準的なマトリックスです。
  3. SPMマウス一括登録ツール10を用いて、平均PET画像を3D MRIに登録する。
  4. Cine-MRIからスライスを積み重ねて3D再構成を取得し、補間して0.3mmの等方性分解能を取得します。拡張末期PETボリュームを拡張末期MRIボリュームにSPM-Mouse共登録ツールを使用して登録します。他のすべての心臓の相に同じマトリックスを使用します。
  5. PET梗塞のサイズを評価するには、心臓の最大強度の50%を選択して、梗塞と非梗塞のボクセルを区別します。梗塞したボクセルをLVのパーセンテージとして表します。

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結果

MRIを用いる利点の一つは、疾患のステージ判定に縦断的研究デザインを採用できることです。これは、効果のタイムコースが未知である場合が多い新規化合物の評価において特に重要です。同一個体における疾患の進行に伴う心容積の変化を図4に示します。この図は、心筋梗塞後のリモデリングによる影響を明確に示しています。

心臓MRI実験を成功させるには、正確なスライスジオメトリが不可欠です。さまざまなMRIスキャンの代表的なスライスプランニングと、それによって得られるジオメトリをFigure 5に示します。2枚のMRI短軸スライスのセグメンテーションをFigure 6に示します。当研究のCine-MRI手順では、LV massで4%、EDVで3%、ESVで5%、SVで2%、EFで2%、および梗塞サイズで4%の精度（変動係数。野生型マウス n = 4匹を用い、データ取得とセグメンテーション手順の両方を各個体につき2回ずつ繰り返して測定）を達成しました。

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ディスカッション

PET/MRI は、心筋梗塞のマウス モデルにおける収縮機能、組織生存率、および特定の代謝マーカーを非侵襲的かつ縦断的に評価するための包括的な測定方法です。ここでは、MRIとPETを順次実行するためのプロトコルについて説明し、システム間で同じベッドを移動することで共同登録が簡素化されます。この戦略は、臨床システム11の製造業者によっても採用されており、PET/MRIスキャナーの組み合わせを必要とせず、標準機器で実行することができる。2 つのシステム間の変換のために固定マトリックスを測定した後、PET と MRI データの同時登録が軸方向の並進で取得されます。この単純化は、運動によって共同登録が複雑になる心臓研究で特に役立ちます。

このプロトコルは、市販のさまざまなスキャナーを使用して実行できます。MRIベッドをPETに適切に接続することで、正確な位置決めが可能であれば、さまざまなPETカメラを使用できます。パルスシーケンスが適切に変更されれば、小口径および臨床システム16で、異なる電界強度12〜15でMRI測定を実行...

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開示事項

開示することは何もありません。

謝辞

私たちは、英国心臓財団からTKへの資金提供、および英国医学研究評議会からのGBへの大学院研究生としての資金提供に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
GadovistBayer Schering PharmaPL 00010/0535
FDGIBA Molecular
Equipment
Bruker BioSpec 47/40Bruker
Bruker マウスベッドBrukerこのベッドには、麻酔送達と清掃用のチューブが含まれています。
直径12cmのバードケージトランスミッタブルカーT5346
直径2cmの表面コイルレシーバーブルカーT7027
レッドドット 新生児モニタリング電極3MP/N: 2330
モニタリング機器SAシステムモニタリングキットには、呼吸用ピローと体温測定用の直腸プローブが含まれています。
麻酔器一般麻酔サービス
誘導ボックスVet Tech Solutions Ltd
ケンブリッジスプリットマグネットPET/MRIスキャナーケンブリッジカスタムメイドのPET/MRIスキャナー22を使用してPETを実行し、そのPET性能はF120マイクロペットスキャナー23
Segmentソフトウェアと同様でした。Medviso, Lund UniversityFreely available
SPM-mouseUniversity of CambridgeFreely available
ー 大学

参考文献

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