膜脊柱：膜タンパク質のタンパク質 - タンパク質相互作用を識別するために、生化学的ツールインビボ

サマリー

生化学的ア ​​プローチは、膜タンパク質のin vivoでのタンパク質-タンパク質相互作用（PPI）を識別するために記載されている。この方法は、タンパク質架橋、アフィニティー精製および質量分析を組み合わせて、ほぼすべての細胞型または生物に適用可能である。このアプローチでは、一過性のPPIのさえ識別が可能となる。

要約

膜タンパク質は、細胞の生存に必須であり、したがって、重要な治療標的である^1-3。これらは複合体⁴で機能するので、それらの相互作用を同定し、特徴付けるための方法が⁵必要です。この目的のために、我々は、膜- SPINE ⁶と呼ばれる膜のStrep-タンパク質相互作用実験を、開発した。この技術は、 インビボ Strepタグ膜ベイトタンパク質のアフィニティー精製の ​​可逆架橋剤ホルムアルデヒドを用いて架橋で組み合わせる。処置中に、架橋された獲物タンパク質は、膜ベイトタンパク質と共精製し、続いて沸騰させることによって分離される。イムノブロッティングによって提案された相互作用パートナーの第一、確認、および質量分析による新たな相互作用パートナーの第2の識別：膜 - SPINEを用いた膜タンパク質のタンパク質 - タンパク質相互作用薬（PPI）を分析するとき、したがって、二つの主要なタスクを実行することができる。また、あってもLOW親和性、一過性のPPIは、この技術によって検出可能である。最後に、膜 - SPINEは、膜タンパク質の同定のPPIをスクリーニングするための強力なツールとして、適用すること、ほぼすべての細胞型に適用可能である。

概要

タンパク質の機能を理解するためには、その相互作用パートナーを知ることが不可欠である。いくつかの古典的な手法は、可溶性タンパク質の相互作用パートナーの同定のために用意されています。しかし、これらの技術は、簡単に自分の疎水性の性質⁴による膜タンパク質に譲渡することはできません。この制限を克服するために、我々は、膜のStrep-タンパク質相互作用実験（膜- ^SPINE）6を開発した。これは、可溶性タンパク質⁷にのみ適した脊椎法に基づいています。

架橋剤のホルムアルデヒドの二つの利点から、膜-背骨の利点は：まず、ホルムアルデヒドは簡単に膜を透過し、そのため生細胞⁸のインタラクトームの正確なスナップショットを生成することができます。第二に、ホルムアルデヒド架橋が^9を沸騰させることによって逆転させることができる。ここで、これらの二つの利点は、膜proteの永久的でなく、過渡のPPIだけを識別するために使用されプラグ^6。

要するに、Strepタグは内在性膜ベイトタンパク質のC末端に融合される。膜ベイトタンパク質を発現する細胞は、架橋は、膜ベイトタンパク質にタンパク質を捕食ホルムアルデヒド（ 図1）とともにインキュベートする。獲物タンパク質の修正は必要ありません。次に、膜画....

プロトコル

注意：プロトコルに示されたバッファに関する詳細な情報は、 表1で提供されています。

1。生細胞におけるホルムアルデヒド架橋によってタンパク質 - タンパク質相互作用の固定

1. 増殖培地、ストック溶液とバッファP1の準備を開始するには
   1. 培地500ミリリットルを準備します。媒体が膜baitタンパク質と獲物タンパク質間の相互作用をサポートする条件を提供する必要があります。さらに、1つの実験は、（ 例えば、架橋せず）の相互作用が期待されない条件下で行われるべきである。
      注意：我々は強調し、非ストレス細菌中のタンパク質 - タンパク質相互作用を比較する。そのため、私たちは、2Lの三角フラスコ中のストレス誘導剤（ 例えば 、0.5M NaCl）で補完する500ミリリットルルリアベルターニ（LB）培地（ 表1）を準備します。制御のために、我々は0.17のNaCl（pH7.0）で、通常のLB培地を使用しています。
   2. トリス緩衝液を調製し（20mMのTris-HClでpHを8.0）および0.1 Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、pH8.0の原液（ 表1）。
   3. バッファP1を準備します。トリス緩衝液中の0.5 Mの最終濃度になるようにスクロースを溶解させる。濾過によりバッファP1を滅....

結果

膜SPINE分析は、膜タンパク質の同時精製および一過性の相互作用タンパク質パートナーを可能にする。共精製は、架橋剤、ホルムアルデヒドを使用することによって達成される。ホルムアルデヒド濃度および架橋時間：2つのパラメータは、非特異的な架橋を防止するために重要である。ホルムアルデヒドのに十分ではなく、過度の使用を容易にイムノブロッティングによって制御することができる。ホルムアルデヒド架橋されたタンパク質複合体は、SDS処理により沸騰ではなくによって分離することができる。したがって、それらは、煮沸試料の免疫ブロットの上部のスメアとしてStrepタグ膜ベイトタンパク質をブロッティングした後に可視化することができる。

すべての必要なコントロールを含む膜SPINEアッセイの代表的結果を、 図2に示されている。ベイトタンパク質として大腸菌の内在性膜タンパク質CpxAは^6,11を用いた。 CpxAはセンサーキナーゼであるとで構成されています大きな細胞質外センサードメインとC末端の高度に保存された細胞質触媒ドメイン^1.......

ディスカッション

膜脊椎分析は1を確認し、この時点まで膜タンパク質の未知の相互作用パートナーを識別でき、生化学的なアプローチである。メンブレン背骨がStrep-tag IIタグの膜ベイトタンパク質の精製をホルムアルデヒドによって生体内架橋を兼ね備えています。免疫ブロット法との併用は、予測された相互作用パートナー（ 図2）の確認を容易にする。さらに、MS解析との組み合わせは、未知の相互作用パートナー（ 図3）の同定を可能にする。両方のアプリケーションのために、あなたの獲物タンパク質を修飾するための必要はありません。また、メンブレン背骨が内因獲物タンパク質⁶の検出を可能にするために十分に敏感である。

ここでは、グラム陰性細菌の膜タンパク質のための最適化されたプロトコルを提示する。グラム陰性細菌のエンベロープは、他に、環境や武装隊から細胞質を分離する細胞膜、外膜とムレイン球形嚢。したがって、我々のプロトコルは、いわゆるフェロプラスト、その結果、外膜の除去とムレイン球形嚢が含まれてい.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
37% ホルムアルデヒド	Roth	4979.1	1 年より古いものであってはなりません
DNaseI	Sigma	DN25
BCA タンパク質アッセイキット	Pierce	23225
マイクロマグネティックロッド	Roth	0955.2	長さ 5 mm、直径 2 mm
Triton X-100	Roth	6683.1	可溶化
用標準洗剤n-ドデシル-&β;-マルトシド	グリコン	D97002-CC	を可溶化するのに最適な界面活性剤 CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow重力フローカラム	IBA	2-1207-050
Strepタグタンパク質精製バッファーセット	IBA	2-1002-001	バッファーWとバッファーE
Amicon Ultra-4遠心フィルター	ミリポア	UFC803024
SuperSignal West Pico 化学発光基質	Pierce	34080
Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
超遠心分離機

が含まれています