Method Article

非ヒト霊長類の肺脱細胞化と特殊大型臓器バイオリアクターを用いた再細胞化

DOI:

10.3791/50825

⸱

December 15th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Stem Cell Research and Regenerative Medicine, Tulane University School of Medicine, 2Division of Regenerative Medicine, Tulane National Primate Research Center, 3Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine, 4Department of Pharmacology, Tulane University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

全臓器の脱細胞化は、再生医療に使用できる可能性のある天然の生物学的足場を生成します。肺全体の細胞が脱細胞化され、血管循環と液体媒体の換気を促進するバイオリアクターで成体幹細胞と内皮細胞が播種される肺再生の非ヒト霊長類モデルの説明が提示されます。

Abstract

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現在および将来の臓器移植のニーズを満たすために利用可能な肺の数が不足しています。バイオ人工組織再生は、従来の臓器移植に代わる魅力的な治療法です。この技術は、臓器の自然な生物学的細胞外マトリックス(ECM)を足場として利用し、その足場に自家細胞または幹細胞/前駆細胞を播種し、元の組織の再生を促進する方法で培養することができます。天然のECMは、脱細胞化と呼ばれるプロセスによって分離されます。脱細胞化は、組織を一連の界面活性剤、塩、酵素で処理し、ECMを無傷のまま細胞物質を効果的に除去することによって達成されます。げっ歯類の肺の脱細胞化とそれに続く再細胞化を利用して行われた研究では、生体内でのガス交換が可能な肺様組織の生成にわずかな成功が示されました。ネズミのモデルは、基本的な概念実証を提供しますが、人間が直接使用することはできません。非ヒト霊長類(NHP)は、最終的な臨床使用のためのバイオ人工臓器産生の使用を調査するためのより適切なモデルを提供します。

NHPアカゲザルから獲得した肺の完全な脱細胞化を達成するためのプロトコルが提示されます。得られた無細胞肺には、間葉系幹細胞や内皮細胞など、さまざまな細胞を播種することができます。この原稿では、細胞播種されたマカクの肺を、負圧換気による機械的伸張とひずみ、および血管系を介した拍動性灌流の条件下で培養できるバイオリアクターシステムの開発についても説明しています。これらの力は、それぞれ肺系統と内皮系統に沿って分化を指示することが知られています。脱細胞化と細胞播種の代表的な結果を提供します。

Introduction

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組織や臓器のバイオエンジニアリングは、再生医療の分野に魅力的な追加です。患者への移植に適した「実験室で育てられた」臓器を作製し、疾患臓器の機能を置き換えることは、現在および将来の移植ニーズの需要を満たすために非常に望ましいです。組織工学の原理は、目的の細胞タイプまたはその前駆細胞を、遺伝子操作された組織の形状を支える足場に播種すると同時に、発生または再生プロセスを模倣するために必要な適切な成長因子と培養条件を供給することを中心にしています。合成足場は組織工学に使用されてきましたが、天然の細胞外マトリックス(ECM)は、この目的のための臓器特異的な足場の最良の供給源である可能性があります。全臓器脱細胞化は、天然ECMの化学的および構造的側面をそのまま残しつつ、細胞の除去を可能にするプロセスです。得られた無細胞マトリックス足場は、再生細胞をin vitroで播種および培養するためのプラットフォームとして使用できます1,2。

この技術の実現可能性を研究するために、肺の脱細胞化とその後の再細胞化のいくつかのげっ歯類モデルが開発されました3-6。げっ歯類のモデルは、基本的な概念実証を提供しますが、人間の臨床ニーズに直接変換することはできません。最近の研究では、外傷性損傷(および関連する炎症)に対するゲノム応答は、マウスとヒトの間でうまく相関していないことが指摘されています。これらの発見は、マウスをヒトのそのような複雑な生化学....

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Protocol

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1. 全臓器マカクザルの肺の脱細胞化

  1. ソリューションの準備
    1. 10〜15Lの脱イオン水(dH2O)を1〜2Lのボトルにオートクレーブします。
    2. マグネチックスターラーで攪拌しながら、1 mLのTriton X-100を999 mlのdH2Oに混合して、「Triton溶液」(0.1% Triton X-100 in dH2O)を調製します。0.22 μmのフィルター装置で溶液をろ過します。室温で保存してください。
    3. 攪拌しながら20 gのデオキシコール酸ナトリウム(SDC)を~900 mLのdH2Oにゆっくりと加えて、「SDC溶液」(2% SDC in dH2O)を調製します。SDCが溶解したら、溶液をメスシリンダーに移し、dH2Oで容量を1 mLにします。室温で保存してください。
    4. 58 gのNaClを~900 mlのdH2Oに加えて「NaCl溶液」を調製し、完全に溶解するまで攪拌します。最終容量1LにdH2Oを加え、ろ過して室温で保存します。
  2. 臓器の準備
    1. マカクの組織を扱うときは、感染性曝露事故を防ぐために細心の注意を払う必要があります。ヒト以外....

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Results

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以下に示す結果は、気道または血管コンパートメントのいずれかに、アカゲザルの骨髄由来間葉系幹細胞またはアカゲザル肺由来の微小血管内皮細胞をそれぞれ播種した別々の実験を表しています。これらは、以前に述べたように単離され、特徴付けられました16-18。

脱細胞化の過程を通じて、マカクザルの肺は進行性の白化を示し、その過程の終わりには半透明の外観を見せたが、肺は肉眼的な解剖学的特徴を維持し、大部分が弾力性を保ち、液体で膨張した後に自然な反動を生み出すことができた（図3Aおよび3B)).顕微鏡レベルでは、組織学的超微細構造は脱細胞化後も無傷のままでした。つまり、細気管支、呼吸細気管支、肺胞嚢、血管、および毛細血管は、低倍率顕微鏡法でも非常に明確に区別できました(図3Cおよび3D)。しかし、組織学的微小解剖学は、肺の肉眼的解剖学的構造と超微細構造が脱細胞化によって軽度に乱された一方で、組織には無傷の細胞が完全に欠けていることを示しました(.......

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Discussion

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組織は、物理的、化学的、および酵素的薬剤を使用する多くの方法によって効率的かつ効果的に脱細胞化することができる12,20。大きな臓器から3D生体マトリックスを作製する際の課題には、大量の脱細胞化溶液、高価な商用機器(バイオリアクターなど)、最終的な組織由来生成物を得るために必要な目まぐるしい量の方法論的摂動などがあります。私たちの方法は、物理的な操作、試薬の量、コストを最小限に抑える簡単なアプローチを提供します。アカゲザルの肺の完全な脱細胞化と滅菌にはわずか3日しかかかりません。さらに、当社の脱細胞化組織は、汚染や足場の劣化の兆候なしに、4°Cで数週間保存できます。私たちは最近、脱細胞化されたマカクの肺足場の詳細な特性評価を報告し、Triton X-100/デオキシコール酸法(Price et al.4)肺マトリックスへの影響を最小限に抑えながら、細胞を効率的に除去しました4,19。

当社の社内バイオリアクターは、生物学的研究所で日常的に見られる部品で構成されています。バイオリアク.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

開示するものは何もありません。

Acknowledgements

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著者は、このレポートで以前の出版物からの画像を使用することを許可してくれたTissue Engineeringの編集者に感謝したいと思います。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ナトリウムnitroprussideシグマAldrich71778-25G
ヘパリンナトリウム塩フィッシャーBP2425
トリトンX-100ッシャーBP151-100
デオキシコール酸ナトリウムフィッシャーBP349-100
塩化ナトリウムッシャー7647-14-5
ウシ膵臓DNaseシグマアルドリッチDN25ストックを調製し、分注し、凍結
硫酸マグネシウムFisher10034-99-8
塩化カルシウムFisherC614-500
PBS (Ca/Mg なし)Gibco, Life Technologies10010-031
Antibiotic-AntimycoticGibco Life Technologies15240062
Cell Culture Media
アルファ MEMギブコ ライフ テクノロジー12561-072
ミディアム 199ギブコ ライフ テクノロジーズ 11150067
プレミアム ウシ胎児血清アトランタ バイオロジカルズS11150
L-グルタミン 100xギブコ ライフ テクノロジー25030-081
内皮細胞増殖サプリメント (ECGS)ScienCell1052
抗生物質-抗真菌剤Gibco Life Technologies15240062
細胞播種およびバイオリアクター培養
チェックバルブコールパーマーEW-98553-20
Y コネクタコールパーマーED-30614-08
3 ウェイ ストップコックハーバード装置721664
MasterFlex L/S 14 チューブコールパーマー96420-14
MasterFlex L / S 16チューブコールパーマー96420-16
パーマーEW-45505-04オスロックルアー1/8
マーSI-45502-04メスルアー1/8パーマーSI-45502-04
オスルアーロックプラグコールパーマーEW-45505-56
インジェクションポートメディドーズEPS IV2004
ラテックスチューブセントルイスメディカルサッピーHN10910
ホースクランプコールパーマーEW-06832-02
2 L 広口ジャーフィッシャー05-719-276
60 ml シリンジフィッシャーNC9035364
フィフィする ズ ズ コールのコールパーのコール

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  2. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue....

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