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方法論記事

非ヒト霊長類の肺脱細胞化と特殊大型臓器バイオリアクターを用いた再細胞化

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DOI:

10.3791/50825

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2013年12月15日

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1Center for Stem Cell Research and Regenerative Medicine, Tulane University School of Medicine, 2Division of Regenerative Medicine, Tulane National Primate Research Center, 3Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine, 4Department of Pharmacology, Tulane University School of Medicine

この記事について

サマリー

全臓器の脱細胞化は、再生医療に使用できる可能性のある天然の生物学的足場を生成します。肺全体の細胞が脱細胞化され、血管循環と液体媒体の換気を促進するバイオリアクターで成体幹細胞と内皮細胞が播種される肺再生の非ヒト霊長類モデルの説明が提示されます。

要約

現在および将来の臓器移植のニーズを満たすために利用可能な肺の数が不足しています。バイオ人工組織再生は、従来の臓器移植に代わる魅力的な治療法です。この技術は、臓器の自然な生物学的細胞外マトリックス(ECM)を足場として利用し、その足場に自家細胞または幹細胞/前駆細胞を播種し、元の組織の再生を促進する方法で培養することができます。天然のECMは、脱細胞化と呼ばれるプロセスによって分離されます。脱細胞化は、組織を一連の界面活性剤、塩、酵素で処理し、ECMを無傷のまま細胞物質を効果的に除去することによって達成されます。げっ歯類の肺の脱細胞化とそれに続く再細胞化を利用して行われた研究では、生体内でのガス交換が可能な肺様組織の生成にわずかな成功が示されました。ネズミのモデルは、基本的な概念実証を提供しますが、人間が直接使用することはできません。非ヒト霊長類(NHP)は、最終的な臨床使用のためのバイオ人工臓器産生の使用を調査するためのより適切なモデルを提供します。

NHPアカゲザルから獲得した肺の完全な脱細胞化を達成するためのプロトコルが提示されます。得られた無細胞肺には、間葉系幹細胞や内皮細胞など、さまざまな細胞を播種することができます。この原稿では、細胞播種されたマカクの肺を、負圧換気による機械的伸張とひずみ、および血管系を介した拍動性灌流の条件下で培養できるバイオリアクターシステムの開発についても説明しています。これらの力は、それぞれ肺系統と内皮系統に沿って分化を指示することが知られています。脱細胞化と細胞播種の代表的な結果を提供します。

概要

組織や臓器のバイオエンジニアリングは、再生医療の分野に魅力的な追加です。患者への移植に適した「実験室で育てられた」臓器を作製し、疾患臓器の機能を置き換えることは、現在および将来の移植ニーズの需要を満たすために非常に望ましいです。組織工学の原理は、目的の細胞タイプまたはその前駆細胞を、遺伝子操作された組織の形状を支える足場に播種すると同時に、発生または再生プロセスを模倣するために必要な適切な成長因子と培養条件を供給することを中心にしています。合成足場は組織工学に使用されてきましたが、天然の細胞外マトリックス(ECM)は、この目的のための臓器特異的な足場の最良の供給源である可能性があります。全臓器脱細胞化は、天然ECMの化学的および構造的側面をそのまま残しつつ、細胞の除去を可能にするプロセスです。得られた無細胞マトリックス足場は、再生細胞をin vitroで播種および培養するためのプラットフォームとして使用できます1,2。

この技術の実現可能性を研究するために、肺の脱細胞化とその後の再細胞化のいくつかのげっ歯類モデルが開発されました3-6。げっ歯類のモデルは、基本的な概念実証を提供しますが、人間の臨床ニーズに直接変換することはできません。最近の研究では、外傷性損傷(および関連する炎症)に対するゲノム応答は、マウスとヒトの間でうまく相関していないことが指摘されています。これらの発見は、マウスをヒトのそのような複雑な生化学的プロセスのモデルとして使用することの妥当性について疑問を提起します7。非ヒト霊長類(NHP)モデルは、ゲノム、解剖学、生理学レベルでヒトの生物学によく似ているという利点を提供し、ヒトの使用に対するより大きな外挿のためのより柔軟な操作を可能にします。アカゲザルは、さまざまな前臨床アプリケーションで使用されており、組織工学を研究するための優れたモデルです8-11。我々は最近、肺ECM12への影響が最小限である手順を利用して、アカゲザル(Macacca mulatta)肺の脱細胞化が成功したことを報告しました。肺の脱細胞化は、界面活性剤、塩、および酵素からなる4つの脱細胞化溶液で組織を連続的に処理し、脱イオン水(dH2O)とPBSの2つの1つのタイトルを、この手順は、Priceらによって最初に記述されたプロトコルを変更することにより最適化されました。4 さまざまな組織学的およびタンパク質分析技術を使用して、得られた無細胞マトリックスの成分を天然のマカクザルの肺と比較して特徴付けました。

このレポートでは、Calleらが最初に示した大型臓器バイオリアクターで、非ヒト霊長類の肺の脱細胞化と結果として生じる無細胞肺の足場の再細胞化のための詳細なプロトコルを示しています。大型動物の肺のサイズ、換気、および灌流要件に対応するように元のプロトコルを変更することにより、技術はげっ歯類モデルからアカゲザルモデルに成功裏に移行しました。このレポートで紹介されているすべての研究は、チューレーン国立霊長類研究センターで実施されている機関バイオセーフティ委員会(IBC)の方針に従って実施されました。解剖学的構造の特定やより大きな臓器の物理的操作は、プロトコルのステップを視覚化しなければ難しい場合があるため、この手法のデモンストレーションは不可欠です。これらの方法によって可能になった研究は、アカゲザルの肺における脱細胞化したアカゲザル肺における重要な前臨床試験の基礎を提供し、アカゲザル間葉系幹細胞とアカゲザル微小血管内皮細胞による再細胞化を評価できます。このバイオリアクターの私たちのバージョンは、発生環境をシミュレートし、大型動物の肺に機械的な伸張とひずみの力を加え、肺および内皮の発達を促進することが知られている条件下での肺の再細胞化の調査を可能にします13-15。

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プロトコル

1. 全臓器マカクザルの肺の脱細胞化

  1. ソリューションの準備
    1. 10〜15Lの脱イオン水(dH2O)を1〜2Lのボトルにオートクレーブします。
    2. マグネチックスターラーで攪拌しながら、1 mLのTriton X-100を999 mlのdH2Oに混合して、「Triton溶液」(0.1% Triton X-100 in dH2O)を調製します。0.22 μmのフィルター装置で溶液をろ過します。室温で保存してください。
    3. 攪拌しながら20 gのデオキシコール酸ナトリウム(SDC)を~900 mLのdH2Oにゆっくりと加えて、「SDC溶液」(2% SDC in dH2O)を調製します。SDCが溶解したら、溶液をメスシリンダーに移し、dH2Oで容量を1 mLにします。室温で保存してください。
    4. 58 gのNaClを~900 mlのdH2Oに加えて「NaCl溶液」を調製し、完全に溶解するまで攪拌します。最終容量1LにdH2Oを加え、ろ過して室温で保存します。
  2. 臓器の準備
    1. マカクの組織を扱うときは、感染性曝露事故を防ぐために細心の注意を払う必要があります。ヒト以外の霊長類組織を取り扱う前に、サージカルマスク、フェイスシールド、サージカルグローブ、使い捨てガウン、およびサージカルグローブの2層目の個人用保護具(PPE)を着用してください。
    2. 外部血液の凝固を防ぐために、50 U/mlのヘパリンを含むPBSで動物の剖検から無傷の心肺ブロックを収集します。.
    3. 肺を解剖トレイに平らに横たえた状態で、適切なサイズのバーブを備えたメスのルアーコネクタを使用して肺動脈をカニューレ挿入します。カニューレをアルコール滅菌した結束バンドで所定の位置に固定します。
    4. 滅菌ジップタイを気管の周りに滑り込ませ、0.250インチのメスルアーコネクタを気管開口部に挿入し、コネクタのバーブの周りのジップタイを締めて、気管をバーブの周りの所定の位置に保持します。
    5. 30 U/mlのヘパリンと5μg/mlのニトロプルシドナトリウム(SNP)を含むPBSを点眼して、肺から閉じ込められた空気を取り除きます。溶液が自然な反動によって排出されるのを許し、さらに2回点眼を繰り返します。3回目の点滴後、気管ルアーカニューレをルアープラグでキャップして、溶液を肺に保持します。
    6. 心臓の頂点を切り取り、PBS-ヘパリン-SNPで内心室を洗浄して残留血液を取り除きます。両方の心房を裂傷して、 ?? 流時の肺回路の排出を促進します。.
    7. 心肺ブロックをdH2Oに浸し、60 mlのシリンジにPBS-ヘパリン-SNP溶液を入れます。.鉗子を使用して、動脈カニューレを沈め、すべての気泡が血管開口部から逃げるようにします。シリンジを取り付け、プランジャーを慎重に取り外して、液体が血管系に流れ込むのを待ちます。
    8. 気管カニューレからプラグを取り外し、気道内の液体が自然な反動によって排出されるのを待ちます。動脈の上の ~15-20 cm H2O 圧力を維持するために、血管カニューレに接続されたシリンジに PBS-ヘパリン-SNP 溶液を引き続き追加します。肺血管系からできるだけ多くの血液が除去されるまで灌流を続けます。
  3. 脱細胞化
    1. 1日目:心肺ブロックをdH2Oに沈めます。水没した気管と動脈カニューレにそれぞれ取り付けられた60 mlの注射器を使用して、dH2Oで肺を膨らませて灌流します。気道洗浄と血管洗浄をdH2O 4倍以上で繰り返し、合計5回のすすぎを行います。
    2. 肺を水から取り出し、ブロックをトリトン溶液に浸します。以前と同様にトリトン溶液で肺を膨らませて灌流します。点眼を2回目に繰り返し、水中の臓器をTriton溶液で4°Cで一晩インキュベートします。
    3. 2日目:一晩インキュベーションした後、Triton溶液から肺ブロックを取り出し、dH2Oで外部洗浄し、ブロックを新鮮なdH2Oに沈めます。
    4. dH2Oから肺を取り出し、SDC溶液に浸します。ステップ1.3.2と同じ方法でSDC溶液で膨らませて灌流します。SDC溶液に4°Cで一晩沈めてインキュベートします。
    5. 3日目:1.3.1と同様に、dH2Oで組織を再度洗浄します。
    6. dH2Oから組織を取り出し、NaCl溶液に浸します。ステップ1.3.2と同じ方法でNaCl溶液で膨らませて灌流します。NaCl溶液に沈めて室温で1時間インキュベートします。
    7. ステップ1.3.1のように、NaCl溶液をdH2Oで肺からきれいに洗います。
    8. 新しい「DNase溶液」(30 μg/ml DNase、1.3 mM MgSO4、2.0 mM CaCl2 in dH2O)を準備し、この溶液で肺を浸し、ステップ1.3.2のように気道と血管系に点滴します。DNase溶液中で肺を室温で1時間インキュベー
      9. トします。
    9. 新鮮な「PBS溶液」(1x PBS + 5x抗生物質/抗真菌薬)を準備します。DNase溶液から肺を取り出し、PBS溶液で外部洗浄します。肺をPBS溶液に浸し、ステップ1.3.1のようにこの溶液で5回洗浄します。
    10. 肺をPBS溶液に入れ、密閉容器に入れて4°Cで一晩保存します。翌日(4日目)に、ステップ1.3.1と同様に、新鮮な氷冷PBS溶液で肺を5回洗浄し、使用まで4°Cの滅菌密閉容器にPBS溶液で保存します。

2. 大型臓器バイオリアクター

  1. 組み立てとティッシュの取り付け
    1. 呼吸ループと血管ループ構造、および気管と血管カニューレのアダプターを事前に組み立てます(図1)。滅菌パッケージされたエアフィルターとシリンジポートを除き、すべてのバイオリアクターコンポーネントをオートクレーブで洗浄します。
    2. 図2の概略図に従って、層流フードの下にバイオリアクターコンポーネントを組み立てます。バイオリアクターで使用する直前に、細胞培養インキュベーターの5% CO2雰囲気に平衡化した培地をメインチャンバーに充填します。
    3. 気管および血管カニューレアダプターを肺カニューレに適用し、肺を培養液に浸し、カニューレアダプターを変更された蓋の適切なポートに取り付けることにより、メインバイオリアクターチャンバーに臓器を取り付けます。接続したら、蓋をしっかりとしっかりと固定します。再細胞化の期間中、チャンバーは再び開かれません。
    4. 気管リザーバーを約半分まで培養液で満たし、修正したキャップを貼り付けます。
    5. 滅菌済みの0.22 μmシリンジフィルター、ルアープラグ、およびシリンジポートを、図のようにすべてのチャンバーに適用します。
    6. 気管リザーバーを呼吸ループ装置を介してメインチャンバーに接続します。図のように呼吸ループチューブを取り付けます。
    7. シリンジポートと18Gの針を取り付けた60mlシリンジを使用して、チューブから空気を吸引し、3方向ストップコックの方向性を動かして、シリンジへの液体の流れを誘導します。
    8. 密閉され、隣接して接続されたバイオリアクターチャンバーと設置された臓器を組織培養インキュベーターに移し、温度とガスを平衡化します。メインチャンバーに取り付けられたシリンジポンプを使用して、2 分ごとに ~1 回のフルブレスで肺を換気し、ペリスタルティックポンプを介して約 10 ml/分で合計 ~30 分間血管系を灌流します。
  2. 気道播種
    1. 所望の細胞密度で気道に播種する細胞の懸濁液を調製する(容量は臓器の大きさに依存する)。
    2. 呼吸ループの三方活栓に取り付けられたシリンジポートから穏やかに注入することにより、細胞懸濁液で肺を膨らませます。
    3. 肺を37°C、5%CO2で一晩、気道や血管灌流なしで静的に保持し、細胞が脱細胞化した肺マトリックスに付着できるようにします。
    4. 一晩のインキュベーション後、標準的な気道換気プログラムを再開し、臓器を3〜7日間(または他の望ましい期間)培養します。
  3. 血管播種
    1. 上記のように、気道細胞播種のために内皮細胞培養物の懸濁液を調製します。
    2. 細胞懸濁液を、小さな磁気攪拌棒を含む内皮播種リザーバーに移します。
    3. メインチャンバーから内皮播種リザーバーへの流路の方向性を、これら2つのコンパートメントを接続するチューブに配置されたストップコックのバルブを回転させて変更し、蠕動ポンプを使用して穏やかに攪拌しながら内皮細胞を徐々に播種します。
    4. 播種が完了したら(すなわち、内皮播種リザーバー内の内皮細胞懸濁液の量が枯渇した場合)、灌流を停止し、4~6時間静的にインキュベートします。メインチャンバー培地で血管灌流を~10 mL/分(またはモニターされている場合は所望の圧力)の速度で再開します。
    5. 連続血管灌流で3〜7日間培養します。

3. トラブルシューティングと代替アプローチ

  1. 気管カニューレ挿入:気管が小さすぎる場合は、結束バンドの代わりに縫合糸を使用してルアーカニューレを所定の位置に保持できます。1/4インチのメスルアー接続は、広範囲の気管直径に十分なカニューレとして機能します。
  2. 肺動脈灌流による血液の採取:組織は死体動物から採取されるため、微小血栓が一般的であり、肺毛細血管床の一部の領域から残留血液が完全に除去されるのを防ぎます。しかし、脱細胞化時には、これらの小さな血管が透過性になり、脱細胞化試薬は効率的にこれらの血栓を溶解・分解します。脱皮前灌流は、できるだけ多くの血液を除去するために実施されるべきですが、実質から血液の痕跡をすべて除去する必要はありません。
  3. 肺からの体液の排出:マカクの肺は、体液で膨らませても生体外で強い自然な反動を保持します。しかし、脱細胞化時には、細胞が溶解され、注入された液体の粘度を高める物質(DNAを含む)が放出されるため、細胞が排出されにくくなります。点眼液に浸した状態で4°Cで一晩インキュベートすれば、通常、肺が粘性液を完全に排出するのに十分です。あるいは、できるだけ多くの液体を肺から排出できるようにしてから、その後の溶液の点滴を続行します。洗剤の添加と脱イオン水洗浄により、通常、粘性流体の除去が容易になり、脱細胞化が効率的に進行します。
  4. 洗剤溶液への抗生物質の添加:抗生物質および抗真菌薬は、脱イオン水洗浄液および洗剤溶液に添加することができる;しかしながら、ペニシリン/ストレプトマイシンは、デオキシコール酸ナトリウムの存在下で沈殿し、これらの沈殿物は脱細胞化および洗浄プロセスを妨げる可能性がある。さらに、これらの濃度で使用される界面活性剤は微生物を溶解して殺すことができるため、脱細胞化中に抗生物質/抗真菌薬の存在は必要ありません。脱細胞化後、PBS溶液(5xペニシリン/ストレプトマイシン/アムホテリシンBを含む)ですすぎ、保存するだけでほとんどの汚染を防ぐことができます。
  5. バイオリアクターチューブからの空気の除去:三方ストップコックのニードルポートに針が挿入されたシリンジを使用して、バイオリアクターチューブから空気を効率的に吸引します。あるいは、1x PBSまたは培養培地をチューブを通して洗い流してから、同じ方法で取り付けられたシリンジを使用して臓器を固定することもできます。
  6. 再細胞化中および再細胞化後の肺の換気と灌流:このレポートに記載されている流量と時間は、細胞の付着、気道の液体換気、血管灌流には十分でしたが、これらの値はユーザーが経験的に決定する必要があります。培養時間は、点眼した細胞の増殖速度に基づいて調整することもできます。

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結果

以下に示す結果は、既報16-18に従って単離および特性評価を行った、アカゲザルの骨髄由来間葉系幹細胞またはアカゲザル肺由来微小血管内皮細胞を、それぞれ気道コンパートメントまたは血管コンパートメントに播種して実施した個別の実験の結果である。

脱細胞化プロセスの進行に伴い、マカク猿の肺は徐々に白くなり、最終的に半透明の外観となりました。しかし、肺の肉眼的な解剖学的特徴は維持されており、液体による充填後には大部分の弾力性が保持され、自然な反跳能を示しました（図 3A および 3B）。顕微鏡レベルでは、脱細胞化後も組織学的超微構造は維持されていました。すなわち、低倍率顕微鏡により、細気管支、呼吸細気管支、肺胞嚢、血管、および毛細血管を依然として明確に識別することができました（図 3C および 3D）。一方で、組織学的微小解剖学的評価では、脱細胞化によって肺の肉眼的な解剖学的構造および超微構造に軽微な乱れが見られたものの、組織内には完全...

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ディスカッション

組織は、物理的、化学的、および酵素的薬剤を使用する多くの方法によって効率的かつ効果的に脱細胞化することができる12,20。大きな臓器から3D生体マトリックスを作製する際の課題には、大量の脱細胞化溶液、高価な商用機器(バイオリアクターなど)、最終的な組織由来生成物を得るために必要な目まぐるしい量の方法論的摂動などがあります。私たちの方法は、物理的な操作、試薬の量、コストを最小限に抑える簡単なアプローチを提供します。アカゲザルの肺の完全な脱細胞化と滅菌にはわずか3日しかかかりません。さらに、当社の脱細胞化組織は、汚染や足場の劣化の兆候なしに、4°Cで数週間保存できます。私たちは最近、脱細胞化されたマカクの肺足場の詳細な特性評価を報告し、Triton X-100/デオキシコール酸法(Price et al.4)肺マトリックスへの影響を最小限に抑えながら、細胞を効率的に除去しました4,19。

当社の社内バイオリアクターは、生物学的研究所で日常的に見られる部品で構成されています。バイオリアク...

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開示事項

開示するものは何もありません。

謝辞

著者は、このレポートで以前の出版物からの画像を使用することを許可してくれたTissue Engineeringの編集者に感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ナトリウムnitroprussideシグマAldrich71778-25G
ヘパリンナトリウム塩フィッシャーBP2425
トリトンX-100ッシャーBP151-100
デオキシコール酸ナトリウムフィッシャーBP349-100
塩化ナトリウムッシャー7647-14-5
ウシ膵臓DNaseシグマアルドリッチDN25ストックを調製し、分注し、凍結
硫酸マグネシウムFisher10034-99-8
塩化カルシウムFisherC614-500
PBS (Ca/Mg なし)Gibco, Life Technologies10010-031
Antibiotic-AntimycoticGibco Life Technologies15240062
Cell Culture Media
アルファ MEMギブコ ライフ テクノロジー12561-072
ミディアム 199ギブコ ライフ テクノロジーズ 11150067
プレミアム ウシ胎児血清アトランタ バイオロジカルズS11150
L-グルタミン 100xギブコ ライフ テクノロジー25030-081
内皮細胞増殖サプリメント (ECGS)ScienCell1052
抗生物質-抗真菌剤Gibco Life Technologies15240062
細胞播種およびバイオリアクター培養
チェックバルブコールパーマーEW-98553-20
Y コネクタコールパーマーED-30614-08
3 ウェイ ストップコックハーバード装置721664
MasterFlex L/S 14 チューブコールパーマー96420-14
MasterFlex L / S 16チューブコールパーマー96420-16
パーマーEW-45505-04オスロックルアー1/8
マーSI-45502-04メスルアー1/8パーマーSI-45502-04
オスルアーロックプラグコールパーマーEW-45505-56
インジェクションポートメディドーズEPS IV2004
ラテックスチューブセントルイスメディカルサッピーHN10910
ホースクランプコールパーマーEW-06832-02
2 L 広口ジャーフィッシャー05-719-276
60 ml シリンジフィッシャーNC9035364
フィフィする ズ ズ コールのコールパーのコール

参考文献

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