cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

サマリー

ニューカッスル病ウイルス（NDV）は広く、とりわけ、ワクチン接種および治療のための新たなベクターを開発するために、ここ数年で研究されてきた。これらの研究は、そのような私たちがここで説明しているようなcDNAから組換えウイルスを救出するための技術、することが可能となっている。

要約

ニューカッスル病ウイルス（NDV）、 パラミクソウイルス科 ¹のAvulavirus属のプロトタイプのメンバーは、非分節型マイナスセンス、一本鎖、ワクチン接種のためのベクターとしての潜在的な用途でRNAウイルス（図1）エンベロープとなるヒトの疾患の治療。これらのアプリケーションの詳細な調査は、cDNAを^2-5としての完全なゲノムをコードするプラスミドから組換えウイルスを救出する逆遺伝学技術の確立後に可能となった。ウイルスcDNAは、好都合には、ウイルスの遺伝子型を改変するおよび/ ​​または新たな転写単位を含むように、標準的なクローニング手順を用いて、in vitroで修飾することができる。このような遺伝的に修飾されたウイルスの救出は、感染の複数の段階に影響を与える要因を理解するための貴重なツールを提供だけでなく、抗原の発現および送達のためのベクターの開発と改善が可能に予防接種や治療のために。ここでは、組換えNDVsの救助のためのプロトコルを記述します。

概要

ニューカッスル病ウイルス（NDV）は、Avulavirus属 ¹に属する鳥類のパラミクソウイルスは、深刻な世界中の養鶏に影響を与える可能性があり、経済的に関係するので、広く研究さsurveilled人獣共通感染剤である。ていないヒトの病原体が、NDVも徹底的モデルパラミクソウイルスとして、その高度に興味深い、天然の腫瘍溶解特性⁶に両方の獣医分野を超えて研究されている。 NDVの研究は大幅に最初コンツェルマンおよびcoleagues ²によって狂犬病ウイルスについて記載された一本鎖の非セグメント化されたマイナスセンスRNAウイルスのための逆遺伝学技術の発展の恩恵を受けた。それらの野生型ゲノムの外来遺伝子又は改変を担持する遺伝的に改変されNDVsの様々な以来広く研究されている。これらの組換えウイルスとの連携がNDVのでなく、他の関連するHUMAだけでなく様々な病原性因子を特徴づけることが重要でしたN、インフルエンザウイルスなどの病原体⁷ -または緊急ニパウイルス^8。さらに、異なる多くの研究は、主にウイルスの免疫刺激特性を増強することにより、NDV ^6,9,10の生得的な抗腫瘍活性を改善するためのこれらの技術の使用を検討されている。組換えNDVs研究の他の関連する領域には、インフルエンザ^{5,11,12、HIV 13、}麻疹^14、SARSの^....

プロトコル

1。哺乳動物細胞の作製（図4A、1日目）

スプリットのHEp-2またはA549細胞を6ウェルプレート中のトランスフェクションの前日。細胞の密度は、翌日80〜90％のコンフルエンスに到達する必要があります。通常、コンフルエント100mmの皿（ウェル当たり1×10 ^6個程度）8ウェルに分割することができる。各ウイルスを救出するためには、2〜4の異なるウェルが含まれなければならないだけでなく、それぞれトランスフェクションおよびMVA-T7感染効率を監視することを目的としたコントロールのpCAGGS-GFPおよびのpCITE-GFP ¹⁸用の2余分な井戸、、。

2。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ（MVA-T7）を発現する組換え改変ワクシニアアンカラウイルスに哺乳動物細胞の感染（図4A、2日目）

1. 37℃のPBS 1x/BA/PSやメディアを温める
2. PBS 1x/BA/PS 1mlで、二回、細胞を洗浄。
3. 感染多重度（MVA-T7におけるウイルスの培養哺乳類細胞に感染多重度）を室温で1時間、PBS / BA / PS内の最終容量200μl中1 PFU /細胞の。
4. 3に記載したように、ウイルス感染のインキュベーション中に、トランスフェクションミックスを調製する。

結果

NDVのレスキューは、日常的に、ウイルスの完全なcDNAへのアクセス権を持っている研究室で行われ、十分に確立された手順です。しかし、この方法の固有の確率論的な性質は、それが困難な100％の救済効率を達成することができる。プロセスの初期段階、特別にトランスフェクション効率およびMVA-T7の感染を監視し、潜在的な問題を特定するのに役立ちます。 図5（a）は成功したNDVの救助のために十分である標準的なトランスフェクションおよびトランスフェクション/感染効率を示しています。鳥類、哺乳類の共培養および孵化卵中での増幅のラウンド後、レスキューされたウイルスの存在は、HAアッセイにおいて陽性ウェルによって検出される。 NDVは赤血球をリンクすることで赤血球凝集を誘導するため、V字型の井戸の底で自分の沈降を防止します。したがって、HA活性の欠如は、簡単に、RBCの赤、ラウンドペレット（図5B）を形成することによって区別することができる。陰性の結果HAアッセイに起因する尿膜液中のウイルスの力価が不十分になることができます。約10 ⁶ PFU / mlの最小の力.......

ディスカッション

いくつかの要因がNDVを救済しつつ、良好な結果を達成するために考慮されるべきである。最初に、使用する完全長cDNA構築物は、NDVゲノムへの新たな導入遺伝子/修飾の機能的組み込みを可能にするように設計される必要がある。上述したように、これは、手段、必要な場合は、（i）適切な遺伝子終結（GE）は、遺伝子間（IG）および遺伝子開始（GS）配列が追加されると、（ii）は、推定上のGEまたはGS配列が外国に存在しない遺伝子、及び（iii）完全な組換えゲノムは「6のルール」の説明。

レスキュープロセス、プラスミド調製物の品質に関しては、MVA-T7株だけでなく、細胞の適切な維持管理が重要である。導入遺伝子の大きさや性質に起因することが困難クローニングおよび救助プロセスは、塩化セシウム密度勾配遠心分離によりDNAを精製することによって改善することができるが、ほとんどの場合では、プラスミドDNAの標準マキシプレップ精製は、十分である。李を使用してトランスフェクション効率例えば、ヌクレオフェクションのような他の方法も用いることができるがpofectamineは、成功した救助用に通常十分である。いず.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	任意のサプライヤー
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% ウシアルブミン (BA)	Sigma	232-936-2	任意のサプライヤー
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	任意のサプライヤー
ペニシリン/ストレプトマイシン (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	任意のサプライヤー
ウシ胎児血清 (FBS)	Hyclone	SH30070.03	任意のサプライヤー
Cell lines A549 細胞 (カタログ番号 CRL-185)、HEp-2 細胞 (カタログ番号 CRL-185)、ニワトリ胚線維芽細胞 (カタログ番号 CRL-12203)、アヒル胚線維芽細胞 (カタログ番号 CCL-141) は、次のとおりです。American Type Culture Collection(ATCC、10801 University Boulevard、Manassas、VA. 20110-2209 USA)から入手できます。すべての細胞株は37°Cに維持されます。DMEM中の5%CO2を含むCインキュベーター 10% FBS、1% PS. Embryonated chicken eggs 胚入り鶏の卵は、Charles River Laboratories、Specific Pathogen Fee Avian Supply(SPAFAS)Avian Products and Services(Franklin Commons、106 Route 32、)から入手できます。 North Franklin, CT 06254, USA)で維持され、37°Cに維持されています。卵子は生後8〜10日に達すると感染します。尿膜液の感染と採取は、どちらも無菌条件下で行われます。すべての卵はオートクレーブ滅菌され、標準的な実験室のバイオセーフティプロトコルに従って廃棄されます. トルコ赤血球(RBC) トルコRBCは、Truslow Farms(201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)から購入でき、4°Cで保管できます。HAアッセイ用のRBCを調製するには、市販のストック5 mLを45 mLのPBS 1xとともに50 mLのコニカルチューブで洗浄します。1,000rpmで5分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。ペレット化したRBC 1:1,000をPBS 1xで希釈し、最終的な0.5〜1.0%の濃度にします。洗浄されたRBCは4°Cで保存することができます。 Plasmids プラスミド製剤は、メーカー'に続く市販のmaxiprepキットで入手できます。ddH20で希釈して最終濃度1 μg/μDNAの濃度と純度は、260nmと280nmの分光光度法によって評価されます。260/280の比率が1.8を超える製剤は、レスキューに許容できる品質と見なされます。プラスミドDNAの品質は、アガロースゲルクロマトグラフィーによっても定期的にダブルチェックされます. Viruses lentogeniNDV株Hitchner B1のレスキューのための記載されたプロトコルは、バイオセーフティレベル(BSL)2条件下で実行できます。T7 RNAポリメラーゼ(MVA-T7)を発現する改変Vaccinia Ankaraは、Bernard Moss博士から34に記載され、入手されました。このウイルスは、ニワトリ胚線維芽細胞のコンフルエント単層で増殖し、哺乳類(A549またはHEp-2)細胞で滴定されます。NDVストックは、胚化したニワトリの卵で増殖させ、精製されたビリオンに対して産生されたポリクローナル血清を使用してIFAによって滴定されます。すべての汚染された材料は、標準的なバイオセーフティ手順に従って安全に滅菌および廃棄する必要があります. Tissue培養培地および溶液: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco'修正されたイーグル'10%ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)を補充したMedium(DMEM):445 mlのDMEM、50 mlの熱不活化FBS、5 mlの100x市販P / S溶液。4°C. 10xリン酸緩衝生理食塩水(PBS):NaCl80 g、KCl2 g、Na2HPO4.7H2O)で保存します。 KH2PO4 2g。ddH2Oを1Lまで添加し、pHを7.3に調整します。オートクレーブで滅菌します。室温で保存します. 1x PBS: 10x PBS 1:10をddH2Oで希釈します。オートクレーブで滅菌し、室温で保存してください。 100x Ca/Mg: 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O を加え、ddH2O を最大 100 ml まで加えます。オートクレーブして室温で保存します. 1x PBS/BA/PS: 50 ml の 10x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を 437 ml ddH2O に入れます。オートクレーブを作成し、室温まで冷却したら、5 ml の 100x ペニシリン/ストレプトマイシン 3 ml 35% ウシと 5 ml の 100x Ca/mg を加えます。4 °C.