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方法論記事

cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

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DOI:

10.3791/50830

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2013年10月11日

 ,  , 
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine and Dentistry, University of Rochester

この記事について

サマリー

ニューカッスル病ウイルス（NDV）は広く、とりわけ、ワクチン接種および治療のための新たなベクターを開発するために、ここ数年で研究されてきた。これらの研究は、そのような私たちがここで説明しているようなcDNAから組換えウイルスを救出するための技術、することが可能となっている。

要約

ニューカッスル病ウイルス（NDV）、 パラミクソウイルス科 1のAvulavirus属のプロトタイプのメンバーは、非分節型マイナスセンス、一本鎖、ワクチン接種のためのベクターとしての潜在的な用途でRNAウイルス（図1）エンベロープとなるヒトの疾患の治療。これらのアプリケーションの詳細な調査は、cDNAを2-5としての完全なゲノムをコードするプラスミドから組換えウイルスを救出する逆遺伝学技術の確立後に可能となった。ウイルスcDNAは、好都合には、ウイルスの遺伝子型を改変するおよび/ ​​または新たな転写単位を含むように、標準的なクローニング手順を用いて、in vitroで修飾することができる。このような遺伝的に修飾されたウイルスの救出は、感染の複数の段階に影響を与える要因を理解するための貴重なツールを提供だけでなく、抗原の発現および送達のためのベクターの開発と改善が可能に予防接種や治療のために。ここでは、組換えNDVsの救助のためのプロトコルを記述します。

概要

ニューカッスル病ウイルス（NDV）は、Avulavirus属 1に属する鳥類のパラミクソウイルスは、深刻な世界中の養鶏に影響を与える可能性があり、経済的に関係するので、広く研究さsurveilled人獣共通感染剤である。ていないヒトの病原体が、NDVも徹底的モデルパラミクソウイルスとして、その高度に興味深い、天然の腫瘍溶解特性6に両方の獣医分野を超えて研究されている。 NDVの研究は大幅に最初コンツェルマンおよびcoleagues 2によって狂犬病ウイルスについて記載された一本鎖の非セグメント化されたマイナスセンスRNAウイルスのための逆遺伝学技術の発展の恩恵を受けた。それらの野生型ゲノムの外来遺伝子又は改変を担持する遺伝的に改変されNDVsの様々な以来広く研究されている。これらの組換えウイルスとの連携がNDVのでなく、他の関連するHUMAだけでなく様々な病原性因子を特徴づけることが重要でしたN、インフルエンザウイルスなどの病原体7 -または緊急ニパウイルス8。さらに、異なる多くの研究は、主にウイルスの免疫刺激特性を増強することにより、NDV 6,9,10の生得的な抗腫瘍活性を改善するためのこれらの技術の使用を検討されている。組換えNDVs研究の他の関連する領域には、インフルエンザ5,11,12、HIV 13、麻疹14、SARSの15のような他のウイルス性疾患に対するワクチン候補の生成されたか、それは呼吸sincytialウイルス（RSV）16によって引き起こされる。 NDVが提供する様々な注目すべき利点はヒト集団における既存の免疫の欠如である中で、外来遺伝子の挿入、recombinatory活性の欠如と全体的な前述の自然免疫刺激特性17と組み合わせて、高い安全性プロファイルの安定性。また、Pにおける組換え価のワクチンの使用の可能性は注目すべきだNDVと高病原性鳥インフルエンザウイルス11,12の両方に対して防御oultry、。これは、このようにも人間に恐ろしい鳥インフルエンザの可能性間の特定のジャンプを防ぐために貢献し、家畜、野生から広がる、後者の可能性を減少させるための優れた方法があります。最後に、レポーターを発現するNDVは、先天性免疫応答の評価、ならびに複数のウイルスによってコードされるインターフェロン18-27アンタゴニストの同定のために使用されてきた。

組換えのレスキュープロセスは、非分節、マイナス鎖RNAウイルスは基本的に人為的リボ核タンパク質又はRNPとして知られている最小の感染性分子機構（図2）をコードするcDNAをトランスフェクトすることによって産生細胞におけるウイルス複製サイクルを強制的に構成されている。 RNPは、ウイルスポリメラーゼ（PおよびLタンパク質）、核タンパク質（NP）およびウイルスの完全長ゲノムRNAで構成されています。このRNAは+アンチは番目ですまた、ウイルスRNPのタンパク質の他の部分と関連する、相補的なRNA-ゲノムの生成に必要なEテンプレートは、自然のウイルスは感染時の細胞の細胞質（図2Aにリリースするのと同じ感染複雑を再現）。以降、このステップからは、ウイルスサイクルが変更されたゲノムをキャプシド、自然と組換えビリオンを進めることができ、（図2B）が生成されます。驚くべきことに、代わりにゲノムcDNAのゲノムcDNAのトランスフェクションが大幅に損なわれるか、完全にレスキュー効率2,28-30を廃止。ゲノムcDNAをトランスフェクトした場合であっても、トランスフェクトされた細胞内のRNPへの組換えRNAのキャプシド形成の効率は、おそらく非常に低い。このため、NDVのための救助プロトコルは、しばしば、許容細胞で、及び/又は、それらを共培養することにより、もともとトランスフェクトされた細胞から放出されたいくつかのウイルス粒子の増幅のための異なるステップを含む孵化鶏卵感染。

救助する前に、cDNAは、所望の改変を生成するために、標準的なクローニング手順により操作することができる。異なる遺伝子産物およびウイルスの調節配列の特異的変異が、率直にこの方法を実現することができるが、組換えNDVを含む公開された研究の多くは、NDVゲノムに新しい転写単位の添加を必要としてきた。パラミクソウイルス科の他のメンバーと同様に、NDVゲノムを差動ウイルスのライフサイクル1のための重要な減少勾配での3 '末端に、その場所を尊重に応じて発現している6転写単位に、8つの異なるタンパク質をコードしている。このため、ゲノム内の新たな転写単位の位置を慎重にウイルス複製の導入遺伝子および障害の発現との間のバランスを達成するために選択されな​​ければならない。 PとM遺伝子との間の挿入はほとんど、tは使用されているハフ他のサイトにも13,31をテストされています。

（I）NDVゲノムに含まれるべき、新たな遺伝子はウイルスRNA依存性RNAのための適切な信号の制御下にある必要があります：何であれ、挿入、NDV cDNAへのクローニングはrescuable構築物を作製するためにいくつかのルールに従う必要があるポリメラーゼ。これらの配列は、新たなオープンリーディングフレーム（ORF）の上流に添加されなければならないので、ポリメラーゼが単一のヌクレオチド配列の遺伝子間（IG）だけ離間し、前の遺伝子（GE）及び新たな導入遺伝子（GS）の先頭の端部を認識することができる。真核生物のリボソーム翻訳を改善するための有効なコザック（K）配列の付加も良く外来タンパク質発現の32をお勧めします。NDVの（II）、効率的な複製、 パラミクソウイルス科のほとんどのメンバーについては、ゲノムの長さで、複数に依存している6 33しますので、NDVに任意の挿入は、この「6のルール」に従う必要があります。必要に応じて、REQ追加のヌクレオチドは新規ORFの下流に添加することができるuired、および（iii）導入遺伝子の配列は、レスキュー効率を損なう可能性配列、導入遺伝子発現および/またはウイルスのような生存可能なGEとGSを見つけるためにチェックされるべきである。存在する場合、これらの配列は、サイレント変異誘発により除去されなければならない。上記のルールに従う組換え完全長cDNAの生成が効率的に、ここで詳述したように、遺伝子組み換えNDVを生成するための最初のステップです。

システム内のすべてのDNA構築物は、T7 RNAポリメラーゼプロモーター（ 図3）の制御下にある。この細胞質ポリメラーゼは、組換え改変ワクシニアアンカラウイルス（MVA-T7）34との同時感染によってトランスで提供されている。 図3（a）は、完全長ゲノムcDNA 5をコードしている pNDV-B1プラスミドを示す。 図3Bは PTM1プラスミドは、NPをコードを示し、 PとLのORF。 、Uをコードしているプラ​​スミドのpCITE-GFP、T7プロモーター、緑色蛍光タンパク質（GFP）、およびニワトリβアクチンプロモーター35の下で同じORFをコードするGFPのpCAGGS 18のnDer、対照として使用する。このプロトコルでは、レントジェニックNDV株のヒッチナーB1の5のcDNA（ 図4）から組換えNDVを救出する手順を示しています。

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プロトコル

1。哺乳動物細胞の作製（図4A、1日目）

スプリットのHEp-2またはA549細胞を6ウェルプレート中のトランスフェクションの前日。細胞の密度は、翌日80〜90％のコンフルエンスに到達する必要があります。通常、コンフルエント100mmの皿（ウェル当たり1×10 6個程度）8ウェルに分割することができる。各ウイルスを救出するためには、2〜4の異なるウェルが含まれなければならないだけでなく、それぞれトランスフェクションおよびMVA-T7感染効率を監視することを目的としたコントロールのpCAGGS-GFPおよびのpCITE-GFP 18用の2余分な井戸、、。

2。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ（MVA-T7）を発現する組換え改変ワクシニアアンカラウイルスに哺乳動物細胞の感染（図4A、2日目）

  1. 37℃のPBS 1x/BA/PSやメディアを温める
  2. PBS 1x/BA/PS 1mlで、二回、細胞を洗浄。
  3. 感染多重度（MVA-T7におけるウイルスの培養哺乳類細胞に感染多重度）を室温で1時間、PBS / BA / PS内の最終容量200μl中1 PFU /細胞の。
  4. 3に記載したように、ウイルス感染のインキュベーション中に、トランスフェクションミックスを調製する。

3。哺乳動物細胞のトランスフェクション（図4A、2日目）

  1. リポフェクタミンの調製は：救助の試みごとのOptiMEM250μlでLPF2000の1〜2μgのを混合し、室温で5分間インキュベートする。
  2. DNAの調製：のOptiMEM50μlの各救助のためのプラスミドのカクテルを作る。 0.4 PTM1-NPμgの、PTM1-P0.2μgの、チューブごとPTM1-L0.2μgのを追加します。各チューブに救出されるNDVの完全長cDNAクローンの1μgのを追加します。また、二つの制御性トランスフェクション、のpCITE-GFP（MVA-T7によるT7ポリメラーゼ駆動発現を確認するために）2μgののpCAGGS-GFP（トランスフェクション効率をチェックするため）の2μgの1、その他を準備します。
  3. LPF2000-OptiMEM中溶液を5分間（ステップ3.1）プレインキュベートされた後、追加250DNAチューブに溶液の液（3.2ステップ）を加え、室温で20〜30分間インキュベートする。
  4. MVA-T7とのインキュベーション後、吸引によってウイルス接種を除去し、DNA-LPF2000トランスフェクションミックス（ステップ3.3）と交換してください。
  5. 各皿に、DMEM、10％FBS / PSの1ミリリットルを追加します。
  6. 37℃、5％CO 2で6-8時間（または一晩）感染/トランスフェクションされた細胞をインキュベートした後、新鮮なDMEM、10％FBS / PSの1.5ミリリットルをトランスフェクション培地を交換してください。
  7. 24時間トランスフェクション後に、対照ウェルは、トランスフェクション効率（のpCAGGS-GFP）およびT7ポリメラーゼ活性（のpCITE-GFP）（図5A）を評価するために、蛍光顕微鏡下で観察することができる。後述のように鳥の線維芽細胞に感染/トランスフェクト細胞の共培養を進める。

4。鳥類細胞と哺乳動物細胞の共培養（図4A、3日目）

通常、ニワトリのコンフルエント100mmの組織培養皿（のCEF）ORダック（DEFS）胚線維芽細胞2にトランスフェ井戸ごとに使用されている。すべての救助の試みごとの鳥類細胞の十分な100mmの組織培養皿、事前に準備してください。ウイルスの効率的な救済のために、DMEM、10％FBS / PS媒体は尿膜腔液から30mMのMgCl 2を5％添加される。この時点で、24時間π、哺乳動物細胞は、MVA-T7感染、 図5Aのasevidentに細胞変性効果（CPE）を示す開始してもよい。

  1. 37℃になるようにPBS 1Xとメディアをウォームアップ
  2. PBS 1Xの1ミリリットルで、2倍、哺乳動物細胞を洗浄します。
  3. それらは切り離されるまで、EDTA-トリプシン0.2mlを哺乳動物細胞をトリプシン処理する。 DMEM、10％FBS / PS 1mlに細胞を再懸濁し、5％尿膜腔液を、30 mMのMgCl 2および100mmの組織培養皿に移す。同じメディアの3ミリリットルを追加します。
  4. PBS 1X 4mlで、二回、鳥類細胞を洗浄します。
  5. 1 EDTA-トリプシンmlの細胞が剥離するまで、37℃で1〜2分間インキュベートしてトリプシン処理鳥類細胞。再懸濁番目電子細胞を、DMEM、10％FBS / PS、5％尿膜腔液を8ml、30のMgCl 2を添加し8の総容積のために共培養した100mmの組織培養皿での哺乳動物細胞をトリプシン処理した細胞を4mlを加えるML（4ミリリットル哺乳類、4ミリリットル鳥類細胞）。
  6. 穏やかに均一な分布を有し、次いで3〜4日間37℃のインキュベーター内にそれらを配置するために手で100mmの皿中で共培養された細胞を振る。 3または4日間、哺乳類や鳥類細胞の共培養後に卵を感染させるための基準は、どの程度の細胞変性効果に依存します（ などの細胞丸め、死、表面から剥離、。）MVA-T7ウイルス感染で観察される。

5。鶏孵化卵の感染症（図4A、日数6-7）

  1. 哺乳動物および鳥類細胞の共培養の3〜4日後、組織培養上清を1mlを除去し、エッペンドルフチュー​​ブに入れる。
  2. ベンチ遠心分離機で12,000 rpmで1分間組織培養上清細胞破片を除去するために、トップ遠心機。
  3. 気嚢と尿膜腔との間のインタフェースを表示するには、光検卵ボックスを使用して卵をキャンドル。血管局在を回避インターフェイスの境界線上のマークを作る。無菌状態を確立するために、卵をかけて70％エタノールを噴霧。そっとマークされたその場で卵の殻に穴を作り、尿膜腔に垂直に直接針を目指して、インスリン（1ミリリットル）注射器を用いて上清500μlを接種します（図4B）。
  4. 溶けたワックスやパラフィンで卵殻にニックをシールする。
  5. 37℃で2〜3日間卵をインキュベート

6。感染した鶏の孵化卵（図4A、日8月10日）からの尿膜液の収穫

  1. ニワトリ胚を殺し、血液を凝固させるために、4℃で2〜4時間、または一晩感染した卵をインキュベートする。
  2. （無菌状態を維持するために）70％エタノールで卵をスプレーします。
  3. スプーンで、エアキャビティ上に、卵の先端部分を丁寧にをタップします。卵殻が割れていると、鉗子で断片を除去し、完全に尿膜を公開します。
  4. 血管や卵黄へのダメージを回避し、ピンセットやハサミで尿膜を切除することにより、尿膜腔を公開します。
  5. 慎重にへらで胚を押し下げて10ミリリットルピペットで上方に流れる尿膜液（卵あたり8〜12ミリリットル）を収集。卵黄膜の損傷を防ぐ。氷上で15ミリリットル遠心管に尿膜液を移す（卵ごとに1つのチューブを使用してください）​​。
  6. 1,500 rpmで5分間遠心分離することにより、尿膜液を明確にする。ペレットを乱すことなく、上清を新しいチューブに移します。
  7. 血球凝集アッセイにより、NDVの存在のためにそれらをチェックするまで、1週間まで4℃で保存サンプル、。

7。赤血球凝集（HA）アッセイ

allant中のウイルスの存在感染した卵からのオイッ流体はシチメンチョウ赤血球（RBC）を凝集する能力によって巨視的に決定することができる。 NDVの場合には、ml当たり単位（pfu）を形成する約10 6プラークをHAアッセイにおいて陽性シグナルを与えるために必要とされる。 HAアッセイはV底96ウェルプレート中で行われる。負（PBS 1X、非感染尿膜液）だけでなく、正の（任意のNDVウイルスから尿膜液）コントロールサンプルは、常にそれを検証するために任意のHAアッセイに含まれるべきである。 HAアッセイを実行するには：

  1. ピペットV底96ウェルプレート中のウェルあたりのPBS 1X50μlの。
  2. ピペットプレートの1列目のウェルに尿膜液のサンプル50μlを。プレートの残りの部分を2倍連続希釈を行い、最後の列のウェルから最後の、余分な50μLを捨てる。
  3. ウェルあたりのPBS 1Xの0.5％七面鳥赤血球50μlを分注する。優しくタップして、プレートを振る。
  4. 4℃（または氷）fでプレートをインキュベートまたは30〜45分間又はクリアペレットを陰性対照ウェルに形成されるまで。

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結果

NDVのレスキューは、日常的に、ウイルスの完全なcDNAへのアクセス権を持っている研究室で行われ、十分に確立された手順です。しかし、この方法の固有の確率論的な性質は、それが困難な100％の救済効率を達成することができる。プロセスの初期段階、特別にトランスフェクション効率およびMVA-T7の感染を監視し、潜在的な問題を特定するのに役立ちます。 図5（a）は成功したNDVの救助のために十分である標準的なトランスフェクションおよびトランスフェクション/感染効率を示しています。鳥類、哺乳類の共培養および孵化卵中での増幅のラウンド後、レスキューされたウイルスの存在は、HAアッセイにおいて陽性ウェルによって検出される。 NDVは赤血球をリンクすることで赤血球凝集を誘導するため、V字型の井戸の底で自分の沈降を防止します。したがって、HA活性の欠如は、簡単に、RBCの赤、ラウンドペレット（図5B）を形成することによって区別することができる。陰性の結果HAアッセイに起因する尿膜液中のウイルスの力価が不十分になることができます。約10 6 PFU / mlの最小の力...

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ディスカッション

いくつかの要因がNDVを救済しつつ、良好な結果を達成するために考慮されるべきである。最初に、使用する完全長cDNA構築物は、NDVゲノムへの新たな導入遺伝子/修飾の機能的組み込みを可能にするように設計される必要がある。上述したように、これは、手段、必要な場合は、（i）適切な遺伝子終結（GE）は、遺伝子間（IG）および遺伝子開始（GS）配列が追加されると、（ii）は、推定上のGEまたはGS配列が外国に存在しない遺伝子、及び（iii）完全な組換えゲノムは「6のルール」の説明。

レスキュープロセス、プラスミド調製物の品質に関しては、MVA-T7株だけでなく、細胞の適切な維持管理が重要である。導入遺伝子の大きさや性質に起因することが困難クローニングおよび救助プロセスは、塩化セシウム密度勾配遠心分離によりDNAを精製することによって改善することができるが、ほとんどの場合では、プラスミドDNAの標準マキシプレップ精製は、十分である。李を使用してトランスフェクション効率例えば、ヌクレオフェクションのような他の方法も用いることができるがpofectamineは、成功した救助用に通常十分である。いず...

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開示事項

アドルフォ·ガルシア·サストレはシナイ医学部アイカーン学校が所有している組換えニューカッスル病ウイルスに関する特許の発明者である。

謝辞

著者は、博士の研究室で過去と現在のメンバーに感謝したいと思います。 NDVの開発のためのピーターPaleseとアドルフォ·ガルシア·サストレは遺伝学技術を逆にし、技術支援のために。 AG-Sの実験室でのニューカッスル病ウイルスの研究は、部分的に学位授与機構によって資金を供給されるR01AI088770を付与し、新興·人獣共通動物の疾患（CEEZAD、受賞番号2010-ST-061-AG001）のための優秀省国土安全保障省科学技術センターの。 LM-Sの実験室での研究は、NIHの助成金RO1 AI077719、R21NS075611-01、R03AI099681-01A1、インフルエンザ研究サーベイランス（HHSN266200700008C）、および生物兵器防衛免疫モデリングロチェスター大学センター（HHSN272201000055C）のための優秀NIAIDセンターによって資金を供給される。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEMCORNING Cellgro10-013-CV任意のサプライヤー
OptiMEMGIBCO31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)Invitrogen11668-019
35% ウシアルブミン (BA)Sigma232-936-2任意のサプライヤー
Trypsin-EDTACORNING Cellgro25-052-CI任意のサプライヤー
ペニシリン/ストレプトマイシン (PS) 100xCORNING Cellgro30-002-CI任意のサプライヤー
ウシ胎児血清 (FBS)HycloneSH30070.03任意のサプライヤー

Cell lines
A549 細胞 (カタログ番号 CRL-185)、HEp-2 細胞 (カタログ番号 CRL-185)、ニワトリ胚線維芽細胞 (カタログ番号 CRL-12203)、アヒル胚線維芽細胞 (カタログ番号 CCL-141) は、次のとおりです。American Type Culture Collection(ATCC、10801 University Boulevard、Manassas、VA. 20110-2209 USA)から入手できます。すべての細胞株は37°Cに維持されます。DMEM中の5%CO2を含むCインキュベーター 10% FBS、1% PS.
Embryonated chicken eggs
胚入り鶏の卵は、Charles River Laboratories、Specific Pathogen Fee Avian Supply(SPAFAS)Avian Products and Services(Franklin Commons、106 Route 32、)から入手できます。 North Franklin, CT 06254, USA)で維持され、37°Cに維持されています。卵子は生後8〜10日に達すると感染します。尿膜液の感染と採取は、どちらも無菌条件下で行われます。すべての卵はオートクレーブ滅菌され、標準的な実験室のバイオセーフティプロトコルに従って廃棄されます.
トルコ赤血球(RBC)
トルコRBCは、Truslow Farms(201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)から購入でき、4°Cで保管できます。HAアッセイ用のRBCを調製するには、市販のストック5 mLを45 mLのPBS 1xとともに50 mLのコニカルチューブで洗浄します。1,000rpmで5分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。ペレット化したRBC 1:1,000をPBS 1xで希釈し、最終的な0.5〜1.0%の濃度にします。洗浄されたRBCは4°Cで保存することができます。
Plasmids
プラスミド製剤は、メーカー'に続く市販のmaxiprepキットで入手できます。ddH20で希釈して最終濃度1 μg/μDNAの濃度と純度は、260nmと280nmの分光光度法によって評価されます。260/280の比率が1.8を超える製剤は、レスキューに許容できる品質と見なされます。プラスミドDNAの品質は、アガロースゲルクロマトグラフィーによっても定期的にダブルチェックされます.
Viruses
lentogeniNDV株Hitchner B1のレスキューのための記載されたプロトコルは、バイオセーフティレベル(BSL)2条件下で実行できます。T7 RNAポリメラーゼ(MVA-T7)を発現する改変Vaccinia Ankaraは、Bernard Moss博士から34に記載され、入手されました。このウイルスは、ニワトリ胚線維芽細胞のコンフルエント単層で増殖し、哺乳類(A549またはHEp-2)細胞で滴定されます。NDVストックは、胚化したニワトリの卵で増殖させ、精製されたビリオンに対して産生されたポリクローナル血清を使用してIFAによって滴定されます。すべての汚染された材料は、標準的なバイオセーフティ手順に従って安全に滅菌および廃棄する必要があります.
Tissue培養培地および溶液:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco'修正されたイーグル'10%ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)を補充したMedium(DMEM):445 mlのDMEM、50 mlの熱不活化FBS、5 mlの100x市販P / S溶液。4°C.
10xリン酸緩衝生理食塩水(PBS):NaCl80 g、KCl2 g、Na2HPO4.7H2O)で保存します。 KH2PO4 2g。ddH2Oを1Lまで添加し、pHを7.3に調整します。オートクレーブで滅菌します。室温で保存します.
1x PBS: 10x PBS 1:10をddH2Oで希釈します。オートクレーブで滅菌し、室温で保存してください。
100x Ca/Mg: 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O を加え、ddH2O を最大 100 ml まで加えます。オートクレーブして室温で保存します.
1x PBS/BA/PS: 50 ml の 10x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を 437 ml ddH2O に入れます。オートクレーブを作成し、室温まで冷却したら、5 ml の 100x ペニシリン/ストレプトマイシン 3 ml 35% ウシと 5 ml の 100x Ca/mg を加えます。4 °C.

参考文献

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