ゼブラフィッシュにおける視力の定量的尺度としての視運動性応答

サマリー

ゼブラフィッシュは、多くの研究分野のための貴重なツールとなっている。ここでは、視覚的な応答を誘発し、大人のゼブラフィッシュにおける機能視力を計算する方法を示しています。

要約

ゼブラフィッシュの視覚研究のための実証済みのモデルである、初期の方法のしかし多くは、一般的に仔魚に焦点を当てたり、簡単な応答を示した。さらに最近では、ゼブラフィッシュの成人視覚的な動作は、対象となっていますが、具体的な応答を測定するための方法は、新たな来ている。このギャップに対処するために、我々は繰り返しと正確に成人のゼブラフィッシュにおける視力を測定するために、視運動反応（OKR）を利用する方法論を開発するために着手した。ここでは、成体ゼブラフィッシュの視力は、両眼と単眼acuitiesの両方を含む、測定することができることを示している。魚が手順の間に損なわれていないため、視力は、短期間又は長期間に亘って測定し、比較することができる。ここで説明する視力測定はまた、ハイスループットのために、必要に応じて追加の視覚的な手順を可能にする迅速に行うことができる。このタイプの分析は、薬物介入研究または疾患の進行の調査を助長している。

概要

ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） のために他の脊椎動物、彼らの短いライフサイクル、および遺伝的に改変した変異株^の1,2の可用性への網膜の類似性を視覚的生理学を研究するための優れたモデルである。視運動フレックス/レスポンス/眼振（OKR）スムーズな追求と迅速なサッカード眼球運動の組み合わせです。 60年以上の臨床医はOKR客観患者の視力を測定するために使用し、幼児の視覚能力の^3-5を決定するために特に有用であることができることを実証した。動物でのOKRの最初に記録された使用は、1950年代⁶でハトを使用していた。さらに最近では、OKRは幼虫のゼブラフィッシュの視覚機能を評価するための貴重なツールとなっていると、多くの場合、視覚障害^1,2を持っている遺伝的変異株をスクリーニングするために使用されている。 OKR広く幼生ゼブラフィッシュにおける視覚機能を決定するために使用されてきたが、ごく最近、成体ゼブラにおいて実証されている魚^7月10日 。 Tappeiner らによる最近の論文では。大人のゼブラフィッシュの視力はかなり一定のまま、度当たり〜0.59サイクル（CPD）、でも、様々な角速度全体の⁷ことを実証するために、OptoMotry、伝統的にマウスに使用する市販の微細運動システムを使用しています。

OKRは幼虫のゼブラフィッシュの研究において非常に有用であることが証明されているが、視覚的な動作のための他の方法は、様々な程度の成功でゼブラフィッシュ成人で使用されてきた。エスケープ応答アッセイは、両方の色素沈着突然変異体は、明るい光の条件^11,12のビジュアル応答が低下していると、そのアルビノとRubyゼブラフィッシュを示した。これと同じエスケープ応答アッセイにも成功¹³歳の2年間ではあるが、 夜盲症Dの変異体を特定しました。しかし、エスケープ応答アッセイは、欠陥がないわけではない。それは、正確な視覚機能に帰することは困難であり、唯一の総approximatioです視覚的変化のn - で変更が識別される前に大きな変化がかかり意味する。

視覚障害を持つ成体ゼブラフィッシュを同定するために開発された別の方法は、視運動応答^（OMR）11である。このアッセイでは、魚が中央に不透明な列に円形の槽内に配置される。黒と白のストライプのタンクの周りを回転し、魚がストライプ運動方向に泳いで使命を帯びている。逃避反応と同様に、OMRから大人のゼブラフィッシュの視覚運動能力に焦点を当てています。しかしながら、このような変異体lrp2/bugeye ¹⁴のような視覚障害で魚を同定するために首尾よく使用されている。 lrp2/bugeyeゼブラフィッシュ展示先天性緑内障、高眼圧が、OMRを減少させ、かつ進行性の網膜変性^14,15。

多くの研究は、多くの場合、主観的であり、定量的にはできません大人のゼブラフィッシュにおける視覚運動能力を、使用しているitatively分析した。 OKRを使用することにより、より客観的成魚の視力を研究することができる。我々は、最初は幼虫の研究¹に用いたものをモデルにした当社独自のOKRデバイスを構築しています。本研究では、OKRが単眼及びゼブラフィッシュにおける両眼視力の両方を計算するために使用できることを実証している。

プロトコル

すべての畜産や実験が承認され、それぞれの機関またはその他の法的要求事項の制度的動物実験委員会によって定められたガイドラインに従って実施されるべきである。

1。ゼブラフィッシュケア

1. 10時間暗-14の時間の明サイクル¹⁶で28.5℃、標準的な条件下でのゼブラフィッシュを維持する。
2. 約3魚/ Lのタンク密度で大人のゼブラフィッシュを保つ

2。視運動反応（OKR）

1. ドラムを回転さ14.5センチメートル径、調整可能な光強度設定（300-8,000ルクス）と実体顕微鏡とコンピュータ（ 図1A）を使用してカスタムOKR記録装置を構築する。
   1. 隣接するモニタ上で移動できるライブフィードを提供し、画像キャプチャと記録を可能にする顕微鏡にカメラを取り付けます。
   2. accommoするコンピュータにリンクされたマイクロコントローラを使用して回転ドラムを制御日付、様々な速度と方向の選択。
2. 2〜3分間0.016％のトリカインで魚を麻酔した後、エッジの上に吊り下げ、目と鰓小さなプラットフォーム上で魚を置きます。
3. 魚の体の上に薄いスポンジ/タオルを置き、それが固定化された保つために、魚の上に、魚を収容するように形作ら泡の2-3枚を、ピン。魚の尾の動きを制限する魚への損傷を引き起こすことなく、固定化のための重要な側面であることが判明し、最良の発泡体の平坦な片を用いて達成された。 （ 図1b）
4. OKR記録装置の回転ドラムの内側に収まるよう、円筒形の水で満たされたタンク内の魚を置きます。ドラムの端から約7.3センチメートル目で、直立魚を配置するためのプラットフォーム上の磁石を使用してください。魚は数分以内に麻酔から回復させる必要があります - 正常な呼吸が再開され、ランダム目の動きを観察する必要があります。
5. BASを配置回転ドラム内に度当たり0.07サイクル（CPD）のEの格子と回転とビデオキャプチャを開始します（12 rpmの速度がこの論文のために使用されたが、8月16日回転の速度は、同様の結果を与える必要があります）コンピュータのコントロールを行っています。
6. 初期OKRは格子ベースによって誘発されると、簡単に回転を一時停止して、より小さな格子（高空間周波数）で格子を交換してください。
7. OKRはもはや誘発することができなくなるまで、このプロセスを繰り返します。 OKRの損失を検証する応答を引き出すことができなかった格子を使用して繰り返し、その後修正された階段のアプローチ次OKRを引き起こし、最小の格子を再テストします。このプロセスは、最終的な回折格子は、第絶滅イベントに対して変更された場合に検出可能な最小の格子に真の応答を確認するために繰り返すことができる。
8. 反対の目に隣接するストライプの上に黒いプラスチック閉塞器を配置することにより、単眼視力測定値を得る。 （2.6から2.7ステップ）上記の手順を繰り返します。
9. 閉塞器の位置を変えて、もう一度手順2.6から2.7を繰り返して、反対側の目の視力を得る。
10. それぞれの目は、正確な視力を測定し、次の手順で算出することができるように、水槽の下に基準測定ストリップを使用して、試験手順の間に縞のある距離に注意してください。

3。視力を計算する

1. CPDを計算することにより視力を得る。 ここで、aは格子、レンズの中心からの距離であり、hは OKRが（ 図1c）観察された最小の格子の1周期の長さである。
2. 合わせた視力測定のために、左と右眼の両方からの平均値が用いられる。

結果

OKRのデバイスの機能

としてOKRデバイスは、最小限のメンテナンスして説明し、 図1の機能に示す。ステップ2.3で述べたように、尾を固定すると、記録中に拘束魚を保つために重要である。十分に固定化された、魚は、長期間OKR装置内に保持することができる。以上のデータは、個々の魚のために収集することができる結果、ケアは、初期の固定化工程中に注意すべきである。

視力測定

両眼OKRは容易に通常の成魚に誘発されている。 1上記の手順に従うことによって、多くの年齢層（ 図2）のゼブラフィッシュのための視力を見つけることができます。我々は記録された最高の両眼の空間視力は0.74 CPDた。 図2で述べたように、両眼視力は、一般的に年齢とともに増加（N = 46;のSPSS V14を使用して、P = 0.002、ANOVA）が、オフレベル生後約12ヶ月後。野生型、我々は年齢をマッチさせたlrp2/bugeyeの魚に5ヶ月の野生型の魚で測定された視力を比較したとき、我々はlrp2/bugeyeの魚はかなり視力（P <0.001減少していたことがわかった：0.49±0.05 CPDを表し、n = 8; lrp2/bugeye：0.35±0.06であり、n = 10; Excelを使用して、スチューデントのt検定）。

右眼を閉塞することにより、左眼用視力その逆に決定することができる。両眼視力と比較した場合、両眼総和は、人間の視覚^17（ 図3）と同様に観察される。両眼視力は、一般的に独立して測定された（OS）acuities（OD）は、右または左のどちらか5-10％向上した。多少の個体魚の違いは、25％の改善となりました。

図1。 OKR RECOrding。A）OKRデバイスは、調整可能な光強度の設定（300-8,000ルクス）でドラム、顕微鏡を回転さ14.5センチメートル直径で構成されています。カメラは、隣接するモニターにライブフィードを提供しています。回転ドラムは、時計方向および反時計方向の両方における種々の速度設定を有し、必要に応じて交換可能な空間周波数格子が挿入され、除去される。B）魚回転ドラムの中心に固定され、配置されている。度あたりC）サイクル（CPD）を算出するCPDを使用して= 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2。視力は年齢とともに変化します 。グラフは、5を測定した独立した視力を示しています -時代の15ヶ月。視力は、一般的に、開発の最初の一年を通じて増加した後、生後15ヶ月（P = SPSSのV14を使用して0.002 ANOVA）で少し裾を引く。各点は、1またはいくつかの魚を表すことができる。視力は、サイクル/度（CPD）で測定される。 （N =合計46; 5ヶ月で8; 4 6ヶ月で、7〜8ヶ月で、9ヵ月後の6; 10ヶ月で11; 2 11ヵ月の時点で、2 12ヵ月の時点で、6〜15ヵ月の時点で） こちらをクリック拡大画像を表示します 。

図3。両眼の視力の和効果 。両眼（OU）視力は右（OD）または左（OS）の目のacuitiesに比べて一般的に高い。この特定のグループ内のOS acuitiesは有意に低かった。た（* p = 0.006、N = 8）jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

ディスカッション

機会に魚が水槽に逃げることがあります。それが尾を固定化することが重要です。さらに、魚の体の上に薄いスポンジ/タオルの使用も長時間中断魚を維持する非常に貴重であることが判明した。私たちは、魚を傷つけることなく、この手順を使用して30以上の分の固定化の魚を維持することができました。この時間は、両眼、両単眼acuitiesを行うのに十分ではありません。

格子のプレゼンテーションのいずれか、ここで、他の場所に記載のように物理的に回転ドラムを用いて行うか、デジタルディスプレイ^18〜22を提示することにより得ることができる。両方のタイプは、特定の利点及び欠点を有する。我々は両方のコスト上の理由および技術仕様書などの物理的な回転を使用することにしました。コンピュータと画像機器を除くと、ここで説明するOKRデバイスは、約$ 150のために構築することができます。

OKRはVISを決定する客観的な手段である大人のゼブラフィッシュにおけるUAL視力。ビジョンのためのいくつかの他の視覚運動アッセイは、これまでの実験で使用されていると、それが頻繁に利用されていないものの場合でも電図が正常に、大人のゼブラフィッシュの目で行われてきたが、大人のゼブラフィッシュOKRは、多くの新しい実験条件²²への扉を開きます。この研究は、眼疾患モデルにおいて、および単眼視力を決定する際に視力差を同定する、経時的に視力の変化を測定するOKRの有用性を実証した。

興味深いことに、成体ゼブラフィッシュのビジョンは、人間の視覚（20/20）と比較した場合、約20/1、000（0.60 CPDは-0.3のlogMARに変換されるとき）である。これが悪いように見えるかもしれないが、ゼブラフィッシュの目は非常によく、その環境に適しています。 6.5水のCM、ポリカーボネートの数ミリ、空気の別のセンチを通して見るの視作業にもかかわらず、魚は非常にうまく機能！私たちは、大人のゼブラフィッシュの視力がABOであることがわかっその感光体の間隔が指定されて予測されるものの70％UT。予測10分の20の約80％であり、成体ゼブラフィッシュにおける視覚能力を測定するためのOKR技術は^、24印象的で最適なヒト性能約20/12、でその²³コントラスト^、25。

独立した眼視力を測定する技術は、一方の眼を治療することができ、他方は対照として使用した研究を可能にするであろう。さらに、このような白内障を開発lrp2/bugeyeや魚などの非対称眼の発生との魚は、より正確にモニターすることができた。これは、ケアを正確にストライプ状の目からの距離を測定すること、視力の完全な視野を塞ぐように注意する必要があることに留意すべきである。この手法は、ゼブラフィッシュの視覚機能のより正確で具体的な対策への扉を開く必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
スーパーローライト ブラックホワイト ビデオセキュリティカメラ	スーパーサーキット	PC164CEX-2	どんな低照度カメラでも使用可能
Arduino Duemilanove マイクロコントローラー	Adafruit Industries		Arduino Unoは、速度制御ソフトウェアとも互換性があります。
トリカインメタンスルホン酸	VWR	101107-950