ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

サマリー

マイクロインジェクションは、卵、胚、および種々の種の細胞にDNA構築物、mRNAは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他の治療法を送達するために使用される一般的な技術である。

要約

細胞および胚へのマイクロインジェクションは、広範囲の生物学的プロセスを研究するために使用される一般的な技術である。この方法では、処理溶液の少量は、物理的に個々の固定化細胞または胚を注入するために使用されているマイクロインジェクション針の中に装填される。ハイスループット配信のためにこの手順を実行するには、最初のトレーニングの必要性にもかかわらず、マイクロインジェクションは、細胞、卵や胚に最大の効率と（サンプルの複雑な混合物を含む）処理溶液の多種多様な再生可能な配信を提供しています。微量注入への応用DNAの送達は、mRNAが、組換えタンパク質、機能の獲得、および機能試薬の損失を構築挙げられる。蛍光または比色染料がインスタント効率的な配信の可視化だけでなく、送達される溶液の量を確実に正常化するためのツールを有効にするために注入された溶液に添加される。記載されている方法は、100〜400ウニzのマイクロインジェクションを可能にします10〜15分内ygotes。

概要

効率的で再現性のある治療照射は、研究者のための主要な方法論的課題の一つである。いくつかの方法が一過卵、胚、および細胞への治療ソリューションを提供するために設立されました。これらの方法には^、1,2、リポフェクション（膜を用いた治療を含むリポソームの融合による配送^）1、微粒子衝撃^1（DNAはミクロンに析出（短い電気パルスを用いて、膜内の生成過渡毛穴に基づく）エレクトロポレーションサイズの金属次いで高速で細胞に浸透するのに使用される粒子）、および形質導入（ウイルス導入遺伝子の送達ビヒクルとして使用される）。現時点では、マイクロインジェクション、最小限の試薬を用いた100％の効率で任意のソリューションを提供する利点を保持している唯一の方法である。また、単回注射液は処理の複雑な混合物から構成することができる。この技術は、成功するために使用されているLYなウニ^3,4、ゼブラフィッシュ^5、マウス^6、カエル^7、牛⁸だけでなく、組織培養⁹の単一細胞などの多数の種から卵や胚をマイクロインジェクション。後で発達段階での単一割球の注射はまた^{10月12日に}実施されている。

マイクロインジェクションの現在の方法は、最初に平本¹⁰によって記載された加圧注入法に基づいているが、大きな進歩は、このプロセスの最適化に向けて行われている。優れたマイクロインジェクション技術は、他の場所で^11を記載されており、ここで我々は現在、ウニ（Strongylocentrotus purpuratus）新たに受精卵をマイクロインジェクションするために使用され、特定のいずれかの方法を説明します。一世紀以上の場合は、ウニ、貴重な実験モデル^15,16となっている。ウニ​​は、進化的に密接に（私たちも含む）脊索動物との分析に関連しているそれらのゲノムは、彼らが人間の¹⁷のように、すべての主要な遺伝子ファミリーが含まれていることを明らかにした。それらは、同期を容易に操作することができる透明な胚を現像多数を生成する。モデル生物としてウニを使用して、ウニのコミュニティが受精過程^18〜21の我々の理解に貢献してきました、細胞生物学的プロセス^22〜24、および遺伝子調節ネットワーク^{（GRNs）25〜28。}

ウニ​​の受精卵へのマイクロインジェクションには、いくつかのステップが必要です。まず、卵は、従来の注射（後述）に固定化される必要がある。マイクロインジェクション皿を負に帯電した卵が^3を接着することができ、正に荷電した表面を作成し、硫酸プロタミン（PS）でコーティングされている。卵は、自然海水又は人工海水（pH8.0）中で2回洗浄した酸性海水に10分間液（pH 5.15）中でインキュベートしdejelliedされる。 dejellied卵を慎重に一直線に漕いている受精²⁹の結果、卵の皮質の顆粒から分泌されるovoperoxidaseの活性を阻害するのに必要とされる1 mMの3 -アミノトリアゾール（3-AT）の存在下でのPSでコーティングされた皿の中央にある。このステップは、受精エンベロープの硬化を防止し、マイクロインジェクション針進入を容易にすることが重要である。 1mMの3-ATの代替として、10mMのパラアミノ安息香酸（PABA）を用いることができる。注射液は、特殊なマイクロローディングピペットチップを用いてマイクロインジェクション針にロードされ、マイクロマニピュレータ及び圧力装置（ 図1）に取り付けられたホルダに取り付けられている。各針は、別々の日に複数の実験における個々の接合体のマイクロインジェクションするために使用することができる。接合体が硬化するまで、マイクロインジェクションは、10〜15分間行うことができる。接合体は、その後、15℃の海水培養で洗浄する胚は胞胚段階に孵化に到達すると、それらはFERのコンポーネントを消化孵化酵素をリリースtilizationエンベロープ³⁰と、それらが自然に、PSでコーティングされた皿から切り離すことができます。必要ならば、胚は、胚に穏やかに穏やかに海水を吹き付け口ピペットまたはパスツールピペットを用いてディッシュから剥離することができる。記載された方法は、下流の分析のためのハイスループット法を提供する、単一皿上100-400新たに受精した卵の効率的かつ信頼性の高いマイクロインジェクションを可能にする。

プロトコル

1。硫酸プロタミンの製造（PS）コートディッシュ

1. 50mlコニカルチューブ中の脱イオン蒸留水（のddH ₂ O）50mlに0.5gのPSを添加して硫酸プロタミン（PS）の1％溶液を調製する。 PSの完全な溶解を確実にするために1〜2時間室温でベンチシェーカー上で高速によく振る。この溶液を^3（完全に、使用前にゲル状の沈殿物を溶解することを確認する）少なくとも3ヶ月間、4℃で保存することができる。
2. 60ミリメートル×15ミリメートルのポリスチレンペトリ皿のスリーブを取り、ベンチに蓋と底の両方をレイアウト。
3. 少なくとも2分間残して、表面を覆うのにちょうど十分な各皿中の1％PS溶液（両方の底部及び蓋を使用することができる）注ぐ。 4℃で保存したときに残ったPS溶液を3ヶ月以内に何回も再利用することができる
4. 蒸留水（DH ₂ O）を満たしたビーカー内の場所、PS-処理皿を。少なくともためのdH ₂ Oを実行しているの下にビーカーを残す10分。
5. PSでコーティングされた皿を記憶するために直ちに又は空気乾燥を使用することができる。埃の蓄積を防ぐためにそれらをカバーしています。それらは、1ヶ月³を室温で保存することができる。

2。ウニ​​配偶子を取得し、マイクロインジェクション用のPSコートディッシュ上で卵を固定する

1. 配偶子^3（ 図2）を解放するために平滑筋の収縮を誘発するために振盪または0.5％のKClまでの1ミリリットルの体腔内注射によるスポーンウニ。
2. 動物は雄である場合、白色精子によって示されるように、1.5mlチューブに動物の表面から精子を採取、乾燥。乾燥した精子は、生物学的機能の著しい損失なし週間4℃で保存することができる。
3. 動物が雌である場合、卵黄含量に起因する黄色で示すように、海水の完全gonoporesビーカーに浸漬することにより、その配偶子を集める。卵はgonoporesから解放され、重力によって落ち着くことになります。
4. このような80ミクロンのナイロンフィルターメッシュを用いた動物の棘などの破片から卵をフィルタリングします。卵を産卵後5-7時間以内に使用された場合、最良の結果が達成される。
5. 卵をDejelly：
   1. 卵の約1ミリリットルのための酸性海水100ミリリットルを用意します。 5.1-5.2のpH 8.0から海水のpHを調整するために0.5 Mクエン酸を使用する。 pHが低すぎる受精を減少し、pHが高すぎる、卵がPSでコーティングしたプレートに付着することはできません。
   2. 酸性海水に卵（1ミリリットルを超えない）を追加し、卵を10分間氷上で落ち着くことができます。あるいは、ゼリーコートの除去が治療中に卵を穏やかに旋回することによって容易にすることができる。一つは、効果的にdejelly Sを 3〜4分でこのように卵をpurpuratusすることができます。
   3. 慎重に、酸性の海の水を注ぐ新鮮な海の水を追加して、卵が再び氷上に落ち着くましょう。 Dejellied卵が受精の問題なしに最大6時間氷上で保存することができる

3。卵を行

1. のddH ₂ Oで10mlに3-AT 0.84gを溶解することによって、3 -アミノトリアゾール（3-AT、MW = 84.08）の1 Mのストック溶液を調製この溶液を6ヶ月まで4℃で保存することができる。
2. 予冷海水50mlに1Mストック溶液50μlを添加することにより、3-ATの1 mMのワーキング溶液を調製する。氷の上で解決策を維持する。
3. 卵の穏やかな取扱いのための口のピペット（ 図3）を準備します。
   1. ピペットチップは、手動でガラスのマイクロピペット（100×外径1.09ミリメートル）から引き出されている。直火の上に両手でマイクロピペットを保持する。ガラスは反対方向に、ピペットの端部を引っ張る注意深く、溶融し始めるように
   2. 1は、パラフィルムで密封シール、プラスチックチューブ（ID 1.14ミリメートル）にピペットを引っ張って接続します。チューブの長さは約50〜70センチメートルにする必要があります。
   3. ガラスチューブに、チューブの反対側の端部に無菌濾過P20またはP200先端を挿入するマウスピースとして使用する。
   4. 先端の直径を調整するためにはさみでガラスマイクロピペットの先端をクリップ。最適な直径は、わずかに卵（80ミクロン）の直径を超えています。
4. 各PSコートディッシュ（底部または蓋）に1 mMの3-ATの海水の4ミリリットルを注ぐ。
5. 口のピペットを取り、口の中でP20/P200チップを入れて、歯で固定します。卵を吸引するために、第一の海水少量の水を吸引する。前の卵をロードする液体の列を持つことにより、1口の分注技術に対して最大の制御を持つことになります。
6. 卵の近くにマイクロピペットチップを置き、静かにピペットで卵の数百に吸引除去する。ガラスマイクロピペット内の卵を閉じ込める。
7. 行は、直線的に先端を移動させながら、ゆっくりと口のピペットからそれらを吹き付けて皿の上に一直線に卵をdejellied。受精の問題が原因で、Pに発生する可能性があるため、右の注射の前に卵を行3-ATの海水³への露出をrolonged。また、PSのような陽イオン性接着剤は、卵への毒性があることができ、受精の封筒が削除されている場合は特に、長時間これらの試薬に胚を公開することはお勧めできません。
8. ガラスピペットを使用して漕い卵の線近傍の皿に傷を作る。この傷は、必要に応じて溶液の流れを調整するために注射針を破壊することが重要である。代わりに、傷が皿に3-ATの海水を注ぐ前に行うことができます。

4。ウニ​​受精卵のマイクロインジェクション

1. マイクロインジェクション·ステーションの電源をオンにします。ここでは、FemtoJet噴射システムの使用を記載している。
2. ニードルプラーを用いて射出毛細血管を引き出します。良好な針の例が図4に示されている。注：RNAの注入は、注入キャピラリーRNAアーゼ³¹の汚染^を避けるために前処理されるべきである。
   1. を50mlの円錐内に噴射毛管を配置するチューブと濾過し、メタノール/塩酸（9:1）の50ミリリットルを追加します。よく振って、もはや10時間以上のために一晩放置しない。
   2. メタノール/塩酸を捨て、毛細血管が同じチューブ内で濾過し、メタノールで2回すすいでください。
   3. できるだけメタノールを排出し、メタノールの完全な除去を確実にするために、一晩キャピラリーを凍結乾燥。
3. 慎重に針装填ホルダーに針毛細血管をマウントし、microloaderチップを使用して試料溶液の<0.5μlでそれを読み込む。試料溶液は、通常、注入された材料³に応じて、20％グリセロールを含有する。
4. 顕微鏡ステージ上で漕い卵の皿を置きます（接眼レンズを通して見たときの卵が垂直配向する必要があります）と卵に焦点を当てています。
5. 慎重に針に微量ホルダーにロード針をマウントして、フィールドの真ん中に完全に集中先端を持つように針の位置を調整します。
6. 最大圧力FOを適用するには、ボタンを押すR針の清掃。解決策は、針から出てくるはずです。必要に応じて圧力を調整し、射出圧力は、少なくとも約1/3の噴射圧補正圧で、90から360ヘクトパスカルの範囲であるべきである。
7. 未受精卵に注入することによって、溶液の流れを調整します。ジョイスティックマイクロマニピュレーターを用いて、未受精卵に注射針の先端を演出します。針落ちを促進するために、このようなねじ回しなどの硬い物体とのステージの穏やかなタッピングによって若干の震えを作る。卵の中に射出成形ボーラス（ 図5）見られるべきである。
8. 注入ボーラスが表示されない場合は、少し、卵上記の針の先端を高めるディッシュの傷を見つけて、フィールドの中央に配置されるように調整します。優しく、注射針の先端を破るためにスクラッチマークに針の先端をタップします。注入ボーラスがTの1/5を超えないことを確実にするために、注射や補償の圧力を調整卵（1-2 PM）の彼は、直径。
9. 注入ボーラスを校正した後、希釈した精子（1:1,000）または精子の1〜2μLを追加することで卵を受精。卵の行を外れることを防ぐために慎重によく混ぜる。
10. 受精エンベロープは（ 図5）目に見えるようになる直後に注射を開始します。ステージコントローラを使用して漕い卵の線に沿って移動し、ジョイスティックマイクロマニピュレーターによって制御針でそれらを突っついによって、できるだけ多くの受精卵を注入する。
11. 10〜15分後に、新たに受精した卵は硬くなり、もはや注入することができません。段階からお皿を取り外し、慎重にプラスチック製パスツールピペットを用いて3-AT海水中に精子を吸引除去する。
12. 接合体が乾燥しないようにしてください。すぐにお皿をカバーするために、新鮮な予冷海の水を加える。 15℃で胚を培養する

結果

GFPとmCherryレポーター構築物は、in vitroで転写され、新たに受精卵に微量注入していた。胚（胞胚期まで）24時間15℃でインキュベートし、ツァイスオブザーバーZ1顕微鏡を用いて画像化した。レポーター構築物の注入は任意の発達障害（ 図6）には至らなかった。蛍光シグナルの定量化のため、画像取得を最大限蛍光画素（ 図6D〜F）を捕捉するために低倍率（100X）で行った。蛍光シグナルはAxioVisionの4.8.2.0を用いて定量した。 100-200胞胚の集団内の蛍光シグナルの強度のための標準誤差（データは示さず）、1.5％を超えなかった。

図1。マイクロインジェクションのセットアップ。（A）、PS

ディスカッション

マイクロインジェクションは、DNA、mRNAを、組換えタンパク質、卵、胚、および様々な生物^1-7の細胞への機能と関数試薬、染料およびそれらの組み合わせの利得の損失などの様々な治療を提供するための強力な手法です。マイクロインジェクション実験を設計する場合ただし、いくつかの考慮事項が心に留めておくべきである。

これは、送達処置および注入量の溶解性を考慮することが非常に重要である。顕微注入溶液はわずかな沈殿物を形成する傾向がある場合には、微量注入針を目詰まりされるであろう。一般的には、任意の沈殿物を溶液³から削除されていることを確認するために針の中にロードする前に、15分以上のためのソリューションを遠心分離することをお勧めします。他のアプローチは、ミリポアスピンカラムに溶液を通過させることである。それは目詰まりを回避することができない場合、それは、再度チップを壊すことによって穏やかに針詰まりを取ることも可能である先端が広すぎると、それは溶液の流れを制御することが困難となる。注入した溶液に多量の胚に有毒であることができる。また、幅広の先端は、個々...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ガラスパスツールピペットVWR		14673-043
倒立顕微鏡 軸方向 40 °C	ツァイス	4109431007990000	インジェクション顕微鏡
マイクロローダーチップ	エッペンドルフ	5242 956.003	ロードインジェクションソリューション
ナイロンフィルターメッシュ 80 μm	Amazon.com	03-80-37	卵をろ過して破片を取り除く
P20またはP200 エアロゾルバリアピペットのヒント	フィッシャーサイエンティフィ	02707432または02707430	口ピペットの一部
パラフィルム フィ	ッシャーサイエンティフィック	13 374 12	口ピペットの一部
ポリエチレンチューブ	イントラメディック	PE-160	口ピペットの一部
硫酸プロタミン	MPBiomedicals, LLC	194729	注射皿にデゼリー状の卵を取り付ける
ウニ S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
海水	、ペットショップ、	インスタントオーシャン
滅菌済み 60 mm x 15 mm ポリスチレン ペトリ皿	フィッシャー・サイエンティフィック	0875713A	注射皿
3軸粗位置決め マイクロマニピュレーター MMN-1	成重	9124	注射針の操作
3軸ジョイスティックタイプ 油圧式 微小マイクロマニピュレーター MMO-202ND	成重	9212	注射針の操作
トランスファーピペット	フィッシャー・サイエンティフィック	13-711-9AM&	nbsp;
縦型  ニードルプラー	ナリシゲ	PC-10	プルインジェクションニードル

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