Stentor coeruleusにおける単一細胞創傷治癒中の細胞質の流れの可視化

サマリー

巨大繊毛虫Stentor coeruleusは、単一細胞の再生と創傷治癒を研究するための古典的なシステムです。Stentor細胞を低倍率と高倍率で同時にイメージングすることにより、創傷前、創傷中、および創傷後の細胞質の流れを測定することができます。

要約

創傷治癒はしばしば組織全体のレベルで扱われますが、多くの場合、個々の細胞は自身の中の傷を治癒することができ、細胞内容物が漏れる前に壊れた細胞膜を修復することができます。巨大な単細胞生物Stentor coeruleusは、細胞のサイズが1ミリメートルを超えることがあり、単一細胞の創傷治癒を研究するための古典的なモデル生物です。Stentor細胞は生存率を損なうことなく半分に切断でき、切断して移植することもできます。しかし、この切断に対する高い耐性は、なぜ細胞質が切断のサイズから単純に流出しないのかという疑問を提起します。ここでは、Stentor細胞を切断すると同時に、切断近傍の細胞質の動きを高い空間的および時間的分解能でイメージングする方法を紹介します。私たちの方法の鍵は、高NAレンズの倒立顕微鏡を使用して、高NAレンズを備えた倒立顕微鏡を使用して、高解像度で下から見えるチャンバーに焦点を当てた解剖顕微鏡の下で手術を行う「ダブルデッカー」顕微鏡構成を使用することです。このセットアップにより、外科的処置を高度に制御しながら、細胞質の高解像度追跡が可能になります。

概要

再生と創傷治癒は重要な生物学的プロセスであり、そのメカニズムは依然として活発な研究領域です。実際、傷を癒し、損傷した部分を再生する能力は、生物が無生物と異なる特徴の1つです。通常、再生は、損傷または切断された動物の部分を再構築するために必要な幹細胞をさまざまな細胞タイプに分化させることによって媒介されると考えられていますが、創傷治癒は、新しい細胞が傷口に侵入して無傷の上皮を再構築するという観点から見なされます。したがって、両方のプロセスは個々の細胞の集合体によって媒介されているように見え、したがって、典型的な多細胞プロセスであるように見えます。したがって、個々の細胞が、場合によっては、傷を修復し、失われた成分を再生できることは、潜在的に驚くべきことである¹。単一細胞内の創傷治癒には、アクチン-ミオシン、創傷周囲の財布ひもの収縮、エキソサイトーシス小胞の急速な融合による膜パッチングなど、複数の経路が含まれます^1-3。多くの細胞型がある程度の創傷治癒能力を持っています^が、おそらく最も劇的な例は、図1に示す巨大な繊毛虫のStentor coeruelus⁷です。個々のStentor細胞の長さは1 mmで、繊毛の列で覆われています。ステンター細胞は円錐形で、一方の端に数千本の繊毛、もう一方の端に狭いホールドファスト構造からなる口腔装置があります。Stentorは、細胞の一部が切断された場合、再生できる^{7という再生}を研究するための古典的なモデル生物でした。例えば、古典的な一連の実験において、トーマス・ハント・モーガン⁸は、ステンター細胞を半分に切断し、各半分が数時間で通常の比例細胞を再生することを示^した8。Stentorの再生に関与する分子経路は、まだ完全に不明のままです。

Stentor細胞が再生モデルシステムとして機能する能力は、これらの細胞が切断された後に自己治癒するという驚くべき能力に依存しています。Stentor細胞を切断しても細胞質が漏れないのはなぜですか?創傷治癒は、細胞皮質の即時の収縮によるものではなく、なぜなら、2つのStentor細胞を取り、それらを切断し、次いで、2つの切断された細胞を様々な構成で一緒に結合することが可能だから^である7。このような移植実験では、2つの細胞の細胞質は、細胞が一緒に押し込まれたときに融合するため、露出したままにする必要があります。どういうわけか、細胞質は移植を可能にするために周囲の培地に十分に露出していますが、それでも細胞から流出することはありません。Stentorの細胞質は、原形質膜に大きな穴が開いても流出しないほど弾力性があるのでしょうか?細胞は、細胞質が流出するのを防ぐために、創傷の周りの局所的な細胞質の粘度を増加させますか?細胞質は非常に複雑な活物質^9-11であり、Stentor創傷治癒応答は、単一細胞創傷治癒中の細胞質の流れと力学を研究するユニークな機会を表しています。しかし、Stentorに傷を誘発するための外科的方法の使用は、技術的な課題を提起します。ガラス針を用いて1mmの長尺の細胞を切断するためには、従来の外科的パラダイムである、低倍率で長い作動距離で手術を行う必要がある。このようなイメージング条件下では、細胞質の流れを追跡することはできず、細胞質が細胞内に残っているかどうかを判断できるだけです。私たちが問いたい本当の問題は、切断と治癒の間に細胞質の動きと粘度がどのように変化するかということです。これには高解像度のイメージングが必要です。ここでは、TartarのStentor⁷の切断プロトコルを適応させて、低倍率の光学系で切断を行い、細胞全体を観察すると同時に細胞質の流れを高解像度で観察することができるため、このシステムをシングルセル創傷治癒のメカニズムを探求するためのプラットフォームとして使用できます。

プロトコル

1. 細胞の培養と収集

1. Stentor coeruleus細胞は、Tartar⁷に記載されている天然の池から、または商業供給業者から入手します(試薬を参照)。
2. 0.75 mM Na₂CO₃、0.15 mM KHCO₃、0.15 mM NaNO 3、0.15 mM NaNO₃、0.15 mM KH₂PO₄、0.15 mM MgSO₄、0.5 mM CaCl₂、 および1.47 mM NaCl。
3. MSM培地に生きた獲物を追加することで、MSM培地に炭素源を補給します。標準的な培養方法を使用してChlamydomonas reinhardtii TAP培地の培養物を育てます¹³。給餌前に、MSMでChlamydomonas細胞を洗浄します。300 mlのStentor培養物を~3 x 10⁷個のChlamydomonas細胞を週に2〜3回供給します。
4. ピペットを使用して手術用のStentor細胞を採取します。ステンターは培養皿の底部と側面に固定する傾向があるため、細胞を採取するために、細胞が分離して自由に泳ぎ始めるまで、ピペットの先端から空気を泡立てて培養物を攪拌します。
5. 細胞のせん断を避けるために、ワイドボアチップを備えたピペットを使用して遊泳細胞を捕捉します。
6. 採取した細胞を新鮮なMSMで洗浄します。

2. マイクロサージェリー用ツールの準備

1. 両端が溶け始めるまで、2本のガラス攪拌ロッドをブンゼンバーナーまたは他の炎にかざします。
2. 2本のロッドの端を一緒に触れて、溶融ガラスが融合するようにします。
3. 2本のロッドの間に溶融ガラスの小さな液滴を作成した後、炎から取り出し、1〜2秒間冷ましてから、それらを引き離してきれいに割れます。理想的には、ガラスが細い糸に引き出され、ガラスが冷えると滑らかに壊れ、長さが約1〜2 cmの針になり、端に細い先端があります(図2)。
4. 得られた針が最適でない場合、先端はガラスくずに砕かれ、ロッドは再利用される可能性があります。

3. マイクロサージェリーおよび観察のための細胞のマウント(正常手術)

1. ワセリンでコーティングされ、ガラスカバースリップに押し付けられた正方形のゴムスタンプを使用して、正方形のワセリン壁チャンバーを準備します。
2. 2%メチルセルロースを含むMSMをワセリンスクエアに加えます。
3. カバーガラスをプラスチックアダプターに入れると、標準のスライドホルダーを使用してカバーガラスを顕微鏡に取り付けることができます(図3)。
4. ステップ1.6で洗浄した細胞をMSMとメチルセルロースに加えて、Stentor細胞の運動性を阻害し、手術中に細胞が所定の位置に留まるようにします。
5. メチルセルロース内の細胞を、イメージング中に焦点が合うように、細胞が等間隔に配置され、カバーガラスの表面に十分に近づくように配置します。

4. 生体ステントの創傷治癒の高解像度イメージング

Stentor細胞を高解像度で同時にイメージングすると同時に、低倍率で外科的に切断するには、倒立スコープの接眼レンズヘッドに解剖スコープを取り付けた「ダブルデッカー」顕微鏡を構築し、倒立スコープがスライドの下から焦点を合わせている間、スライドの上部に焦点を合わせます。

1. 倒立スコープにスライドを置きます(Zeiss Axiovert 200MまたはOlympus IX80のいずれかを使用します)。
2. 解剖顕微鏡本体をスタンドから取り外し、解剖スコープを配置するための倒立顕微鏡接眼レンズの上のおおよその位置を決定して、スライドを低倍率で視覚化できるようにします。
3. 段ボール箱を倒立スコープ接眼レンズヘッドと解剖スコープの間の希望の間隔と同じ厚さに変更し、実験が完了したら簡単に取り外すことができるラボテープを使用して逆スコープにテープで固定します。倒立顕微鏡の接眼レンズヘッドの正確な構成と解剖顕微鏡のサイズに応じてボックスの厚さを調整し、サンプルを取り付けた後に解剖スコープを動かさなくてもサンプルが視野に入るようにします。
4. 解剖スコープを箱に当てて、スライドに焦点が合うまで動かし、次にラボテープを使用して再び箱にテープで貼り付けます。最終的な構成を図 4 に示します。
5. DIC光学系と20倍対物レンズを使用した倒立スコープで細胞を画像化。長いワーキングディスタンスのDICコンデンサーを使用して、上からマイクロサージェリーを行うのに十分なスペースを確保します。
6. 512 x 512 CCDカメラを使用して、2画像/秒のフレームレートで画像を取得します。
7. 細胞の切断を開始する前に取得を開始し、初期の細胞質の流れパターンを捕捉し、創傷および創傷治癒プロセスのすべての段階を観察します。
8. 細胞が正常な外観および/または活動的な運動性を再開したときに取得を終了し、再生プロセス全体の細胞質の動きを視覚化および測定します。

5. 創傷治癒中の細胞質の流れの解析

粒子画像速度測定(PIV)を使用して細胞質の流れを測定します。この手法は、流体力学の研究では日常的に行われており、流体中に個別に追跡可能な粒子がない場合でも流れ場を生成できます。PIVは、透過光顕微鏡¹⁴によって細胞質に見える細胞内小胞および細胞質に見える他の特徴のイメージングに基づいて、細胞質の流れを測定するために使用されてきた。

1. PIV 用の MATLAB パッケージである PIVLab を Web サイト http://pivlab.blogspot.com/ からダウンロードします。
2. 各ビデオ シーケンスの tiff イメージ スタックを MATLAB 内の PIV プログラムに読み込みます。
3. 各画像スタックのマスクを手動で生成して、Stentorの本体の外側の生データの領域をマスクします。
4. PIVLab を高速フーリエ変換設定と 64 x 64 ピクセルのビン サイズを使用するように設定します。これにより、各フレームのピクセルがより大きな正方形ピクセルにビンされます。
5. PIVLab を実行して、各フレームのピクセルと次のフレームの近くのピクセルとの間の相互相関を計算し、ビン化された各ピクセルを中心とする時間依存のフロー ベクトルを生成します。これは、生データと同じ時間解像度を持ちます。
6. 結果として得られるベクトル場出力の時間平均を計算して、切断前と創傷治癒中にStentorで取得したデータを比較するための流線を生成し、流速のヒストグラムを計算します(流れの強度を調べるため)と特定のピクセルでの速度の経時的な変化(流れの変動を研究するため)。
7. Stentor が半分に切断され、細胞質が周囲のバッファーに目に見えて漏れている画像配列の場合、平均流速に細胞質の細胞外バブルの基部の断面積を掛けて、細胞質の細胞体に戻る細胞質の全フラックスを適切に計算します。

結果

上述のプロトコルを用いた結果、Stentorの細胞質は、切断前後のいずれにおいても非常にダイナミックであることが判明した。Video 1では、切断していない細胞に見られる広範な細胞質の流れが示されている。Stentorが切断後も生存できる能力には細胞質の硬化やゲル化が関与しているという当初の予想に反し、実際には、細胞質が細胞外に引き出されるほどの激しさでStentor細胞を切断した場合でも、細胞質は高いダイナミズムを維持し、高度に方向性を持って細胞内へと流れ戻ることが確認された(Video 2)。

このアッセイにおける高解像度イメージングは、創傷治癒過程でこれまで予想されていなかったレベルの細胞質運動があることを実証するだけでなく、粒子画像流速測定法（PIV）を用いて流速を定量化するためにも利用できます。このような測定が可能になることで、化学的阻害剤の効果を厳密に検証することが可能になります。

図1. 生きたStentor細胞の形態。 手順1.3に記載通りにChlamydomonasを餌として与えた生きたStentor細胞の暗視野像。餌胞内の緑色の物質として観察される。細胞が摂食を行う口器は、画像上部の繊毛の縁として確認できる。 ここをクリックして拡大画像を表示。

図 2. 手術用ガラス針の作製。 (A) 固体ガラス棒の端から針を引き出す。 (B) 針先の高倍率像。手術に必要な長さと鋭利さを示している。 ここをクリックして拡大画像を表示。

図3. マイクロサージェリー用カスタムカバーガラスホルダー。 手術のためのオープンアクセスを確保しつつ、最適なイメージング条件を得るため、細胞は厚いガラススライドではなくカバーガラス上に固定します。カバーガラスを顕微鏡ステージに適合させるため、3Dプリンターを用いてプラスチック製ホルダーを作製できます。ホルダーの寸法は標準的な顕微鏡スライドと同じであり、中央のくぼみはカバーガラスの寸法に適合しています。隅にある穴により、カバーガラスをホルダーから簡単に取り出すことができます。 こちらをクリックして拡大画像を表示。

図4. 2段重ね顕微鏡の構成。倒立顕微鏡の接眼レンズヘッドの上に実体顕微鏡ヘッドが取り付けられている。ラボ用テープを使用することで、実験完了時に装置を迅速に組み立ておよび分解することが可能である。 こちらをクリックして拡大画像を表示。

ビデオ 1. 生きたStentor細胞で観察された細胞質流の例。 暗視野光学系と10倍対物レンズを用いて、1秒あたり2フレームの速度で撮影した細胞像。

ビデオ 2。私は〜のイメージング ステントール ガラス針で切断・破壊される細胞。 切断後、かなりの量の細胞質が主細胞体から引き出されるが、それは速やかに細胞内へと逆流する。

ディスカッション

この方法の最も重要な用途は、 Stentor の創傷治癒中に細胞質の流れを調節する分子経路を決定するために使用することです。モータータンパク質や細胞骨格の成分を標的とする幅広い化学阻害剤が利用可能です。カルシウムシグナル伝達の阻害剤も候補となる可能性があります。また、ストレス下で細胞からの放出が引き起こされる青色色素ステントリンを含む色素顆粒(エクストラソーム)を除去または減少させ、ステントリンのエキソサイトーシス放出が近くの細胞質の流れにどのように影響するかを尋ねることも興味深いでしょう。顔料は、切断の直前に行うことができる簡単な漂白処理¹⁵ を使用して枯渇させることができる。細胞を一度に 1 つずつ切断して画像化する必要があるため、創傷治癒アッセイを並行して実行する簡単な方法はないようです。したがって、1台の顕微鏡を使用すると、0.5時間あたり約1つの速度で細胞を操作および測定できるため、1日の作業中に、1つの化合物がプロセスに統計的に有意な影響を与えるかどうかを判断するのに十分なデータポイントを取得できるはずです。したがって、この方法は決して高いスループットではありませんが、慎重に選択されたいくつかの標的経路に特異的な選択された候補化合物のセットを通してスクリーニングすることは絶対に実現可能です。

現在のアプローチの主な制限は、2階建て顕微鏡を組み立てるための比較的粗雑な方法です。イメージングに使用する倒立顕微鏡が、他の作業者が他の目的で使用する必要がある一般的な使用機器であると仮定すると、重要な考慮事項は、装置の分解と再組み立ての容易さです。ラボテープを使用する現在の方法は確かに迅速かつ簡単に分解できますが、毎回組み立てる際にユーザーが慎重に位置合わせする必要があります。したがって、重要な変更は、逆スコープの接眼レンズヘッドと解剖スコープの本体用のスロットを備えたカスタマイズされた取り外し可能なホルダーを構築することです。これは、最新の 3D プリンター技術を使用して簡単に製造できるはずです。

このアプローチの2番目の制限は、流れのマーカーとして細胞内細胞小器官のDICイメージングに依存していることです。顕微鏡で観察されたこれらの細胞小器官の正体は現在知られていないため、それらのサイズや他の細胞成分との潜在的な相互作用を知ることはできません。したがって、蛍光ビーズなどの外因性トレーサーを注入し、それらを使用して流れを追跡することが有利である可能性があります。ただし、これには実験を行う前に追加のステップ(マイクロインジェクション)が必要になるため、アッセイがさらに遅くなります。

最後の重要な制限は、データ収集に単一の画像平面に依存することです。このアッセイの最も重要な点は、単に傷が治癒するかどうかを尋ねるだけでなく、フローパターンの詳細な分析が得られることです。この点で、イメージングを3次元イメージングに拡張することが非常に重要です。現在の方法は単一の焦点面を画像化するため、PIV分析を実行すると、結果は完全な3次元流れ場をスライスします。これは有益ですが、不完全です。各タイムステップで3D画像を取得することで、完全な3次元の流れ場を得ることができるはずです。これは、創傷部位のすぐ近くで細胞質がどのように動くかを正確に観察するために特に重要です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Stentor coeruleus 生きた培養	カロライナ生物	131598
メチルセルロース、1,500 cP	シグマ	M0387
EQUIPMENT:
>Material Name	会社	カタログ番号
軟質ガラス攪拌ロッド 5 長い	Fisher Scientific	11-380A
カルチャーディッシュ4.5 in 250 ml ガラス	カロライナ バイオロジカル	741004
IX81 倒立顕微鏡	オリンパス
Axiovert 200M 倒立顕微鏡	ツァイス
ステミ 2000 実体顕微鏡	ツァイス
エボルブ 512 x 512 EMCCD カメラ	測光
プラン Apo 20X 対物	レンズ オリンパス	UPLSAPO