グルコース感知を勉強する成体マウス由来の膜視床下部腹内側部のニューロンの電位色素イメージング

サマリー

成人老化マウスからの単一ニューロンの活性は、特定の脳領域のニューロンを解離し、蛍光膜電位色素イメージングを用いて研究することができる。グルコースの変化に対する応答を試験することによって、この手法は、成体腹内側視床下部ニューロンのグルコース感受性を研究するために使用することができる。

要約

神経活動の研究はしばしば増加結合組織に関連する技術的な問題へのげっ歯類歳未満2ヶ月から神経細胞を使用して実行し、年齢とともに起こる神経細胞の生存率を減少している。ここでは、成人老齢マウスから健康的な視床下部ニューロンの解離のための方法論を説明します。成人老齢マウスからニューロンを研究する能力は、後の年齢で現れる疾患モデルを使用することができ、より正確な発生的に、特定の研究のためかもしれません。単一ニューロンを研究するために電気を使用するのではなく、解離したニューロンの蛍光撮像は、ニューロンの集団の活性を研究するために使用することができる。希望の神経細胞のタイプは、視床下部グルコース感知ニューロンの希である異種のニューロン集団を研究するときに特に便利です。私たちは、茶への回答を研究する大人の腹内側視床下部ニューロンの膜電位色素イメージングを利用細胞外のグルコースのnges。グルコース感知ニューロンは、エネルギーバランスの調節において中心的な役割を果たしていると考えられている。大人のげっ歯類でグルコース感知を研究する能力は機能不全のエネルギーバランスに関連する疾患の優位ので、特に有用である（ 例えば 。肥満）年齢とともに増加。

概要

脳は神経内分泌および自律神経系を通じてエネルギー恒常性を調節する。視床下部腹内側部（VMH）は、腹内側核（VMN）と弓状核（ARC）で構成され、エネルギー恒常性の中央制御に重要である。専門的なグルコース感知ニューロンは、VMH内で、神経活動と周辺グルコース恒常^1をリンクします。励起されたグルコース（GE）グルコース（GI）ニューロンは、細胞外グルコースが増加するにつれて、それらの活性を低下させる阻害したニューロンが増加;ニューロンを感知するグルコースの2種類がある。 VMHのグルコース感知ニューロンは、一般的に電気生理学またはカルシウム/膜電位感受性色素イメージングを用いて研究している。

電気生理学的パッチクランプ法は、ex vivoで神経活動の研究にゴールドスタンダードであると考えられている。この技術では、ガラスマイクロピペット電極は、高抵抗を介して細胞膜に結合している（GΩ）シール。パッチクランプ電極は、活動電位の周波数（電流クランプ）をリアルタイムで記録またはイオンコンダクタンス（電圧クランプ）は、単一のニューロン内での変更を可能にする。パッチクランプ法は、特定のイオンチャネルコンダクタンスの変化に関する詳細な情報を提供するが、主な欠点は、1つのニューロンが同時に観察され得ることである。それも、具体的な実験的治療を開始する前に、グルコース感知ニューロンからその1が記録されていることを確認するために記録の約30〜45分かかります。ま....

プロトコル

1。動物

1. すべての手順は、ニュージャージー州の医科歯科大学の機関動物実験委員会によって承認された。
2. 12時間のlight/12の時間暗スケジュールでグループの家のオスのC57BL / 6マウスと水と食料を自由摂取のアクセスを許可します。 4-5ヶ月で生け贄に捧げる。マウスの安楽死は麻酔の外科的平面と安楽死の二次形式（横隔膜経由で胸腔内すなわち貫通切開）を用いて行った。これは安楽死にAVMAガイドラインと一致している。

2。灌流液、カバーガラス、ガラスピペット、およびメディアの準備

1. 2.5のKClからなる1L灌流溶液を作製、7のMgCl _2、1.25 mMののNaH ₂ PO _4、28 mMの_炭酸水素ナトリウム、0.5のCaCl _2、7 mMグルコース、1mMのアスコルビン酸、および蒸留のdH ₂ Oに3 mMのピルビン酸〜30への浸透圧を調節する約80グラム/ Lスクロースを使用して0ミリオスモル。 95％O _{2/5％CO 2}でバブリングし、pHを7.4に調整することによって酸素化物。各実験は、灌流溶液約200ミリリットルが必要になります。アリコートは、最大2ヶ月間-20℃で保存することができる。
2. ....

結果

離れて他の視床下部のエリアからVMHの正確な解剖は一貫性のある結果を得ることが重要である。他のエリアを含めることは、計算された脱分極ニューロンの％を変え、VMHニューロン集団が希薄化する可能性があり。さらに、神経細胞を検出するグルコースは、VMHのグルコース感知ニューロンから機能的にも機構的に異なる可能性が外側視床下部などの他の視床下部の地域で確認されている。 図1は、適切な解剖の正しい解剖学的位置を示している。上記のプロトコルに従って、正しいVMH領域を含有する脳組織を解離させることができる。できない場合があり、各部分集団の全体を維持しながら、さらなる切開は、正確に、VMN及びARCを分離する。 図2は、健康な一例は、VMHニューロンを解離示す。免疫細胞を使用して、我々は我々の準備が> 90％の神経細胞であることを確認した。唯一の健康なニューロンは、データ析のために使用されるべきであるあまりにも多くの不健康なニューロンとSISと料理が廃棄されるべきである。不健康であるニューロンは、多くの場合、大きな程度で、MPDを取る、非常に暗いエッジを有し、かつ不規則な形状を.......

ディスカッション

成体マウスの神経細胞の活動を研究することができることへの鍵は、健康的な神経細胞を解離させる能力である。成体マウスの視床下部ニューロンの解離は幼若マウス由来のニューロンと比較して、プロトコルのいくつかの重要なステップでより困難である。我々は、多くの方法でこの問題を克服している。厚手の500ミクロンの脳スライスを作ることは、若いマウスからの脳組織のために使用される通常250〜350程度のスライスに比べて神経細胞への機械的な損傷を最小限に抑えることができます。しかし、厚いスライスが心臓灌流し、脳組織のパパイン消化に大きな注意を払う必要があります。血液が脳組織で見ている場合は、右心房に切断し、左心室に配置された針の精度および配置を評価する。灌流液の流量及び量も調整することができる。血液が神経細胞に毒性があり、健康的なニューロンの低収量の原因となりますので徹底した灌流が不可欠です。パパイン消化はできるほど効率的である必要があります優しいチュレーションおよび脳組織からの単一細胞の容易な放出のために。より大きな組織片が二チュレーション中に存在する場合にVMH組織は消化の最後に素早く沈み、いつ非効率的なパパイン消化が疑われる。良好な消化を、組織片は、か.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Neurobasal-A Medium (Custom)	Invitrogen	0050128DJ	custom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom)	BrainBits		custom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)	Invitrogen	15140	other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm)	ミリポア		他のベンダーは許容範囲
25 mm ガラスカバースリップ	Warner	#1 25mm 丸
型 18 mm ガラスカバースリップ	Warner	#1 18mm 丸
型 GlutaMAX	Invitrogen	35050
B27 マイナスインスリン (50x)	Invitrogen	0050129SA
カミソリ刃	VWR	55411
ビブラトーム&冷却チャンバー	ビブラトーム	シリーズ1000セクショニングシステム
ビブラトームブレード	Polysciences	22370	インジェクターまたはダブルエッジブレード 他のベンダーから 許容される
パパイン、懸濁液	ワーシントン	LS003124
BSA、細胞培養に適した	シグマ		他のベンダー
許容されるDNAse、細胞培養用	Invitrogen		その他のベンダーが許容
するクローニング シリンダー、6 mm x 8 mm	Bellco Glass	2090-00608
膜電位色素 (青)	Molecular Devices	R8042
インライン ヒーター	Warner	SF-28
シリンジ ポンプ	WPI	sp100i	その他のベンダー
許容されるチャンバー	Warner	RC-43C
ポリエチレン チューブ	ワーナー	PE-90
メタモル	フ分子デバイス		代替画像解析ソフトウェア 許容可能
顕微鏡	オリンパス	BX61 WI	10X	測光	クールスナップHQ
ナロー Cy3フィルターセット	Chroma	41007a
照明システム	サッター装置	ラムダ DG-4