周囲条件下での光分解性のPEGスターポリマーのブラシ、最初の合成：箱なしの粒子

サマリー

ポリ（エチレングリコール）（PEG）、ブラシアーム星型ポリマーは、狭い質量分布及び調整可能なナノスケールのサイズを有する（BASPs）が得られたリビングの部分の転送に続いてPEG-ノルボルネンマクロモノマーの開環メタセシス重合（ROMP）を介して合成されるリジッド、光切断可能なビス - ノルボルネン架橋剤の種々の量を含むバイアルにブラシイニシエータ。

要約

多様官能化ナノ粒子の急速な、平行合成のための便利な方法は、薬物送達、生物学的イメージング、およびサポートされている触媒反応のための新規な製剤の発見が可能になります。本稿では、「ブラシ最初の "法によるブラシアームスターポリマー（BASP）ナノ粒子の平行合成を実証する。この方法では、ノルボルネン - 末端ポリ（エチレングリコール）（PEG）マクロモノマー（PEG-MM）は、第一の生体ブラシマクロ開始剤を生成するために、開環メタセシス重合（ROMP）により重合される。この開始剤ストック溶液のアリコートを、光分解性ビス - ノルボルネン架橋剤の種々の量を含有するバイアルに添加する。架橋剤への曝露は、最終的には、PEGで構成される架橋剤とコロナで構成されるコアを持つBASPsをもたらし、動力学的に制御されたブラシ+ブラシとスター+スターカップリング反応のシリーズを開始します。最終的なBASPサイズが追加された架橋剤の量に依存します。私たちは、SYNを実施空気や水分を除去するには特別な措置とベンチトップ上の3 BASPsの論文。サンプルは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（GPC）によって特徴付けられる。結果は、不活性（グローブボックス）の条件を利用して我々の以前の報告と密接に合意した。主要な実用的な機能、利点、およびブラシ第1の方法の潜在的な欠点が議論されている。

概要

ポリマーナノ粒子が広く薬物送達のためのプラットフォームとしてのそれらの潜在的使用のために研究されてきた、触媒作用、生物学的イメージング、自己集合^1-3サポートされている。最近のアプリケーションは、ナノ粒子の合成は、容易な再現性、化学官能と互換性があり、多様化^4,5に従順であることを必要とする。歪みオレフィンの開環メタセシス重合（ROMP）が制御されたサイズおよび狭い質量分布^1,6-8有する官能性ポリマーナノ構造体の合成のための強力な方法論である。例えば、ノルボルネン官能化ポリ（エチレングリコール）（PEG）マクロモノマー（MMS）は、効率的に水溶性のボトルブラシポリマーを生成するために、ROMPにより重合することができる。このアプローチを使用して、複数の解放可能な薬物分子、フルオロフォア、スピン造影剤を担持するナノ構造体を迅速かつ平行^6、9、10で調製することができる。

ROMPはまた、スターポリマーの "アームファースト」合成に使用されている。アーム第一の方法では、線状ポリマーは、ポリマーアームを有する球状のナノ構造を与えるために多官能性架橋剤で架橋されている。シュロックらはノルボルネン、dicarbomethoxynorbornadiene、および官能性ノルボルネン系架橋剤とトリメチルシリル保護さdicarboxynorborneneリニアポリマーの架橋を経由してスターポリマーの第一アーム初ROMP合成を報告した^。11、12 Buchmeiserが持つ材料を合成するためのこの方法を拡張しましたサポートされる触媒作用、組織工学、およびクロマトグラフィーの^{13から17を}含むアプリケーションの範囲。大谷らは、関連する「インアウト」重合戦略^18、19を介して機能面でスターポリマーナノ粒子を作った。

ほとんどのアーム第重合はモノマー複合体の相互作用、ポリマー、スターカップリング反応を含む。目典型的には、広い分子量（MW）分布に導く段階成長機構を介して電子後者進む。関連腕一原子移動ラジカル重合反応においてこの制限を克服するため、Matyjaszewskiらは、非常に狭い分子量分布²⁰とスターポリマーを提供するために、予備成形ポリマーのMMSアーム最初の架橋を行った。この場合、MMSの立体容積、およびサイトを開始にスターアームの増加率は、コントロール不良のスター+スターカップリング過程を阻害し、そして生きている、鎖成長機構につながった。

我々はノルボルネン末端PEG-MMおよびビス - ノルボルネン架橋剤とROMPのコンテキストで同じ戦略をしようとしたとき、非常に広い、マルチモーダル分子量分布を持つ星型ポリマーが得られた。この結果は、本システムでは、MMが一人でスター+スターカップリングを抑制するために十分にかさばらないことを示唆した。スターアームの立体的な大きさを増加させ、潜在的にこのuncontroを制限するにはカップリングをlled、我々は最初の架橋剤の非存在下でボトルブラシポリマーを形成した後、架橋剤を添加することMMを重合することを試みた。私たちは、特定の条件下で、この「ブラシ最初の "法は、狭い分子量分布および調整可能なコアとコロナの機能で「ブラシアーム星型ポリマー」（BASPs）への簡単なアクセスを提供することを知って喜んでいた。

我々は最近、グラブス第3 ^世代触媒A（図^{1）21 を}使用したPEG BASPsのブラシ最初のROMP合成を報告した。本研究では、触媒Aに対するPEG-MM Bの露出が定義されたバックボーンの長さのあるリビングブラシマクロ開始（B1、図1）を生成した。 BASPを開始した架橋剤Cの異なる量を含有するバイアルB 1のアリコートの転写形成。 MwおよびBASPs、したがって大きさは、C量を幾何学的に増加した。我々は、この幾何学的な成長プロセスのための機構的な仮説を提供し、機能性、ニトロキシドコアとコロナ標識BASPs容易に重合後の修正工程又は逐次モノマー添加を必要とせずに製造することができることを実証した。しかし、報告された例のすべてにおいて、我々は、触媒の不活性化を懸念し、私たちは、グローブボックスの中に、N ₂雰囲気下ですべての反応を行った。

我々の最初の報告以来、我々はブラシ最初の方法は、ノルボルネン末端のMMおよび官能性架橋剤の広い範囲からBASPsの形成に非常に有効であることを見出した。また、この方法は、空気や水分を除去するために特別な予防措置で、ベンチトップ上で実行することができることを発見した。

ここで、異なるのMWの3 BASPs一連のSYされます周囲条件下でブラシファースト法によりnthesized。簡単に言えば、Bの10当量、10の平均重合度（DP）でBIを得るために15分間、触媒A（図1a）の1.0当量に曝される。 BIのこのバッチの3つのアリコートは、10、15を含有する別々のバイアルに移し、そして20当量（N、 図1b）のC説明する。 4時間後、重合は、エチルビニルエーテルの添加によってクエンチする。スターポリマーのMWとMW分布は、多角度レーザー光散乱検出器（GPC-MALLS）を備えたゲル浸透クロマトグラフィー装置を使用して特徴づけられるであろう。

プロトコル

我々は最初の3 kDaのO-（2 -アミノエチル）ポリエチレングリコール（PEG-NH _2）とノルボルネン-N-ヒドロキシスクシンイミジル（NHS）エステルからPEG-MM Bの合成および精製を記載する。前者の化合物は、シグマアルドリッチ社から購入、又は文献の手順に従って^22,23アニオン重合を介して調製することができる。後者の化合物は、公開された手順²¹に従って2工程で調製することができる。次に、市販のGrubbs第2 ^世代触媒から、触媒Aの合成を記載している。次に、ブラシ一BASP合成のため、この複合体の使用を示す。この実験は、N = 10、15、および= 10、DPでのBIからの20でBASPsを作るための手順を詳しく説明します。全ての反応は、標準的なシンチレーションバイアルを用いて換気フード中で行った。

注意：必ず手袋、実験室のコート、およびラボを着用メガネ、有害化学薬品を取り扱う際の一般的な実験室の安全対策に従ってください。任意の有機溶媒を換気フード内で処理されなければならない。固形物をヒュームフード外側天秤で秤量することができる。化学物質は皮膚、目、口に接触しないようにしてください。ことを強くあらゆる溶剤および開始する前に、この手順で使用する固体のMSDSを読むことをお勧めします。

1。 PEG-MM Bの調製

1. 撹拌棒を備えた40mLのシンチレーションバイアルにPEG-NH _2（300mgの、0.0001モル、1.0当量）を加える。
2. 無水N、N-ジメチルホルムアミド（DMF）のPEG-NH ₂ 3溶液に溶解する。
3. ノルボルネン-NHSエステル（0.000105モル、1.05当量）の²¹の36ミリグラムを追加します。
4. バイアルに蓋をして室温で一晩反応混合物を攪拌する。
5. 攪拌棒を取り外し、PEG-MM Bを沈殿させるために反応溶液にジエチルエーテルを加える。
6. 白いインフルエンザをフィルタリングFFY沈殿物、ジエチルエーテルで広範囲に洗浄してください。代替的に、50メートル遠心チューブに室温で5分間4,000 rpmで遠心分離した懸濁液を転送し、その後、上清をデカントする。新しいジエチルエーテル、遠心分離機を追加し、再度デカントします。私たちは、5倍の合計に対して、この手順を3回繰り返すことをお勧めします。
7. 残留ジエチルエーテルを除去するために24時間、真空下で沈殿物を乾燥させる。

2。 PEG-MMの精製

我々の以前の報告では、PEG-MM Bは、市販のPEG-NH ₂から調製した（ステップ1.7の後、 すなわち、乾燥）した後、さらに精製せずにBASP合成に使用した。本研究では、（自家製に対して商用）PEG-NH ₂のソースを変更すると、我々はより厳格な分取高速液体クロマトグラフィー（分取HPLC）のMM精製前と後のBASP形成結果を比較。この研究の残り、DRのステップ1.7の後に得られたIEDのMMは、次のように、B1と呼ばれている。分取HPLCは、B2を得B1を精製した。類似の分取HPLCは、B3と呼ばれるのMMは、アニオン重合を介して我々の研究室で合成し精製した。分取HPLCは、1 mlのサンプルループし、室温でアジレントゾルバックス300SB-C18 PrepHTエンド逆相カラムをベックマンコールターHPLC（溶媒127Pと166Pモジュール検出器モジュール）を用いて行った。

1. 1％の酢酸を含む脱イオン水（ミリポア浄化システム、18.2Ω）、溶媒B：溶媒AとHPLCを設定するアセトニトリル。
2. 素数ポンプおよび95％Aおよび5％Bでカラムを平衡化
3. アセトニトリル又はメタノール（150 mg / ml）を中にPEG-MMを溶解する。
4. 13ミリメートル0.45μmのナイロンシリンジフィルターでろ過する。
5. セットHPLC法：
   - 流速：20ml /分
   - 0-1分：10％Bと90％Aへの直線勾配
   - 1月10日分：リネア90％Bおよび10％Aへrの勾配
   - 10月13日分：初期条件（5％Bおよび95％）に切り替えて、再平衡化列
   - 256 nmの吸光度を検出するためのセットUV検出器
6. サンプルループにサンプルを0.8ミリリットルをロードします。
7. サンプルを注入する。
8. 主要な吸収ピークを収集（指定された条件の下で、製品が5-7分の間で溶出する）。
9. 必要に応じて繰り返します。丸底フラスコ内で一緒に純粋な画分を組み合わせています。
10. 回転蒸発により、すべての溶媒を除去。
11. ジクロロメタンに、製品を再溶解し、硫酸ナトリウムを追加します。優しく≅1時間のために定期的にフラスコを振ったり撹拌する。
12. フリットガラスフィルターを用いて混合物を濾過する。
13. 回転蒸発によって濃縮する。一晩真空下で乾燥した。
14. PEG-MMは、CD ₂ Cl ₂で（15から20 mg/0.7 mLのCD ₂ Cl _2中 、500 MHz以上が128以上のスキャンと緩和遅延を推奨します、D1に¹ H-NMRで特徴づけることができるMALDIマトリックスとして（4 - ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸 - 陽イオン化モード及び図2を用いて= 2.0秒）、およびMALDI-TOF。
15. PEG-MMは、4℃で、シンチレーションバイアル中ヶ月間保存することができる

3。触媒Aの調製

1. 攪拌棒を備えた20ミリリットルバイアルにグラブス第2 ^世代触媒（500ミリグラム、0.589ミリモル）を追加します。
2. バイアルにピリジン（約0.474ミリリットル、5.89ミリモル、10当量）を追加します。溶液の色がすぐに赤から緑に変わります。赤い色がすべて消えてしまったし、溶液が（15〜30分）、粘性になるまで反応が撹拌する。
3. 複合体Aを沈殿させるために冷たいペンタンで反応バイアルを埋める。
4. 緑色の沈殿物（触媒A）を収集する懸濁液をろ過する。冷ペンタン15mLで洗浄4X。
5. 真空下で一晩緑色の固体を乾燥させます。
6. 複雑Aが可能活性の有意な損失なし卓上デシケーター中、室温で数ヶ月保存した。余分な予防策のために、我々は通常、グローブボックス内部の-20℃の冷凍庫にコンプレックスを格納します。 4ミリリットルのシンチレーションバイアルに直ちに（ステップ3.5）乾燥後の便宜のために、我々は事前に計量既知量。次に、グローブボックスの冷凍庫にこれらのバイアルを保存する。ときはROMP反応を実行する準備ができ、我々は、単にグローブボックスの外に1バイアルを取り出して（ステップ4.4）、下記のように使用します。

4。 = 10、DPとの生活ブラシポリマー（BI）のストック溶液の調製

1. 図3において溶解、攪拌棒を備えた気密ねじキャップでバイアルMM B物65mg（0.020ミリモル、10当量）を秤量。この量はBASPsの3種類のサイズのそれぞれについて、MMの20ミリグラム、およびBIのGPC分析用5mgの食べ残しに対応しています。バイアルの底に直接、MMを追加するには、へらを使用してください。 TRこのシナリオのよう​​に、バイアルの側面に付着する物質を防ぐために、yは最終BASP製品で、MM汚染につながる可能性があります。
2. THFを158μlに、MM のBを溶かす。すぐに溶媒の蒸発を避けるために、THFを追加した後、バイアルにキャップを。注意：重​​合中MMの最終濃度が0.05 M. THFの158μlを、ここでは追加された場合、触媒溶液の243μlの、4.4ステップであるべきである、[MMに対応するTHFの合計の401μLを、与えるために添加され】=このステップ中0.05 M.溶媒の使用量であれば、ステップ4.4の間の溶媒の量はまた、[MM] 0.05を与えるように変化させるように、変化させることができる。我々は、[MM] <0.05を用いて行う重合は時々、変換を完了するために進行しないことを見出した。
3. MMの全てが溶解するまで溶液を撹拌しましょう​​。必要に応じて軽く加熱する。側面上に粘性溶液またはバイアルのキャップを飛び散ることは避けてください。
4. 次に、既知量（2.8を追加3ミリリットルバイアル（または事前に計量した触媒Aとのバイアルを得る）に触媒Aのこの例の）を得た。 6 mg / mlの触媒溶液を得た無水THF（この例では、466μl）を添加する。直ちにバイアルにキャップ。触媒を完全に溶解させる;。必要に応じて静かにバイアルを振ってこの触媒溶液を、ROMPのためにすぐに使用する必要があります 。注1：触媒溶液はフォレストグリーン色にする必要があります。それが黒、または緑がかった茶色であれば、それはおそらく分解しており、それはおそらく満足ROMP結果が得られません。分解が発生した場合、我々は、（上記のセクション3に記載の）新たな触媒を調製する、または新たに蒸留したTHFを用いて示唆している。注2：THFの量をAに添加し、最終[MM]は〜0.05であることを保証するように選択される。この量は、限り補償調整は、ステップ4.2においてMM溶液に加えられるように、調整することができる。
5. Bに1当量、243μL（1.46ミリグラムを追加）を素早く（滴下せず）攪拌溶液にMM。バイアルに追加するときだけmM溶液の上に針の先端を維持しようとします。飛沫が最終BASPの残留MMとBI不純物につながることができように、側面およびバイアルのキャップの上に、反応混合物をはねないようにしてください。
6. 直ちにバイアルにキャップをし、ブラシマクロ開始（BI）を形成するために15分間、反応混合物を攪拌してみましょう。

5。 BASPsの形成

1. 5.5±0.1、（工程5.2に転送されるべきBIの量を6.18モル、10当量）を3.6±0.1 mgの追加物（9.28μmol、5.2ステップで転送されるべきBIの量に15当量）、および7.3± 0.1ミリグラム（12.4μmol、ステップ5.2で、転送する、BIの量に20当量）の攪拌棒を装備した3つの別々の3ミリリットルバイアルに架橋剤Cの。バイアルの側面に付着する物質を防ぐために、バイアルの底に直接架橋剤を比較検討してみてください。注：架橋剤Cは 、THFへの溶解性が高いではありません。このため、固形物をこの工程で直接使用する。架橋剤が可溶性である場合において、架橋剤のその後濃縮ストック溶液を作製することができるし、この溶液を種々の量をバイアルに移すことができる。この場合も、最終的な重合の濃度は> 0.05 Mであるべきです。溶媒を架橋剤に追加された場合、その後の溶媒の代償削減は別の場所で行ってください。
2. Cを含む3バイアルのそれぞれにBIソリューションを123μL（0.618マイクロモル）を追加します。バイアルに追加するときだけ固体架橋剤の上に針の先端を維持しようとします。一度に全部ではなく一滴よりもBIソリューションを追加します。
3. バイアルに蓋をしてまで、室温での反応をかき混ぜる完了。 BASPの成長に識別可能な影響を与えません、最大24時間撹拌し続け、この特定のMMと架橋剤の組み合わせで、反応が〜4時間で完了する。 BIの完全な変換を確実にするためにGPCによって監視する。
4. 残りのBI溶液およびN = 10、15、20 BASP反応混合物のそれぞれにエチルビニルエーテルの一滴を添加することにより反応をクエンチした。完全なクエンチングを確実にするために10分間撹拌する。

6。 GPCサンプル調製

GPC-MALLSのShodex GPCの結果は、KD-806Mカラム、ワイアットドーンHeleos-II MALLS検出器、そして室温でワイアットOptilab T-REX屈折率検出器を備えたAgilent 1260 LCシステムで得た。 1.0ミリリットルの流速で0.025 MのLiBrとDMF /分を溶離剤として使用した。結果は、ワイアットによって提供アストラ6ソフトウェアを用いて分析した。

1. 各反応バイアル用の新しいガラスピペットを用い、反応の少量のサンプルを策定するために反応溶液にピペットチップを浸し。およそ3ミリグラム/ mlの最終濃度を得、DMF中の0.025 MのLiBr250μlのピペットの内側を下に洗ってください。
2. GPCバイアルに試料を堆積させる前に、0.45ミクロンのポリテトラフルオロエチレンフィルターにより希釈されたサンプルをフィルタリングする。
3. GPC-MALLSの実行を設定し、実行が完了すると、結果を分析します。

略語のリスト

：グラブス第3 ^世代ビス-ピリジン触媒

B：ポリ（エチレングリコール）（PEG）マクロモノマー（MM）

B1：PEG MMは、PEG-NH _{2（Aldrich）}を商業的に入手可能用いて調製し、HPLC精製することなく使用した。

B2：MM PEGは、市販（Aldrich）からPEG-NHを用いて調製 _{2、HPLC精製の ​​後に使用。}

B3：PEG MMは、新たにPEG-NH ₂を合成し、HPLC精製後に使用を使用して製造。

BASP：ブラシアームスターポリマー

BI：リビングブラシイニシエータ

C：光分解性架橋剤

D：モル質量分散度指数

DMF：N、N-ジメチルホルムアミド

DP：数平均重合度

GPC：ゲル浸透クロマトグラフィー

分取HPLC：分取高速液体クロマトグラフィー

MALLS：多角度レーザー光散乱

MM：マクロモノマー

MW：分子量

Mw _は重量平均MOLARマス

N：架橋剤の当量数（AとCの比）

NHS：N-ヒドロキシ

PEG：ポリエチレングリコール

PEG-MM：ノルボルネン-PEGマクロモノマー（また、化合物Bと呼ぶ）

ROMP：開環メタセシス重合

THF：テトラヒドロフラン

結果

図2は、GPCはB1、B2、およびB3から調製BASPsさまざまなトレースを示しています。全ての場合において、データは、架橋剤（N）の当量を増加させるBASPの大きさの増加をもたらすことを示している。我々の以前の報告で認められたように、架橋剤の10当量を均一BASPsを達成するのに十分ではない。N = 10サンプル（特に未精製MM B1の場合には、残余のブラシポリマーの大量明らかにマルチモーダルGPCトレースを示す図2a）。架橋剤のより多くの量が非常に少ない残留ブラシとMMとの均一な分子量分布が生じる。 20 -重量平均分子量（M _w）は 、約Nから= 15に行くに倍になります。 B3の場合には、残留MM及び1％未満の残留BIは、N = 15のために残っていないと Nは2...

ディスカッション

ブラシ最初BASP合成の主な利点は、急速に特殊な装置を必要とせずに並行して、多様なサイズおよび組成のナノ構造を合成する独自の機能です。本研究では、ノルボルネン官能化PEGマクロモノマー（B、図1）およびビス-ノルボルネンニトロベンジルエステル架橋剤（C、図1）を用いてブラシ第1の合成方法を示す。 BからのPEG鎖は、最終BASP構造体に水溶性を付与する。ニトロベースの架橋剤は光分解性である。

この一般的な手順は、他のエキソノルボルネン系のMMと架橋剤のために変更することができます。我々は両方のいくつかの組み合わせからBASPsを用意しました。例えば、我々は異なる抗がん剤、ニトロキシド、及び磁気共鳴イメージング造影剤^27を担持ノルボルネン-PEGベースのMMを使用している。我々はまた、PEG以外のポリマーからなるMMSは使用しています。我々の経験では、ブラシ第一の方法は、ほぼすべての機能

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
グラブス セカンドジェネレーション カタリスト	マテリア (またはシグマ アルドリッチ)	C848 (シグマ アルドリッチ: 569747)	メーカーから購入したものを使用。. ※プレゼントとしてご提供いたします。
ピリジン	Sigma Aldrich	270970	メーカーから購入
O-(2-アミノエチル)ポリエチレングリコール 3000	Sigma Aldrich	07969	メーカーから購入
PEG-MM	N/A	N/A 報告	された手順(Ref.21、プロトコル1)
ノルボルネン-N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)エステル	N/A	N/A	報告された手順に従って合成 (参照 21)
Bis-norb-NBOC 架橋剤	N/	A N/	A 報告された手順に従って合成 (参照 21)
Pentane	Sigma Aldrich	158941	メーカーから購入したとおりに使用
テトラヒドロフラン (HPLC グレード)	Sigma Aldrich	34865	溶媒精製カラム
で乾燥および精製ジクロロメタン	VWR	BDH1113-4LG	購入
アセトニトリル(HPLCグレード)	Sigma Aldrich	34998	メーカーから購入
酢酸	Sigma	Aldrich A6283	メーカーから購入
硫酸ナトリウム	Sigma Aldrich	239313	メーカー
から購入 ジエチルエーテル	シグマ・アルドリッチ	673811	ジ
メチルホルムアミド(HPLCグレード)	シグマ・アルドリッチ	270547	臭
化リチウム	シグマ・アルドリッチ	213225
Q バイオセル A10	ミリポア
ベックマン・コールター HPLC(127p溶媒モジュール、166p検出器)	から購入ベックマン・コールター
Zorbax 300SB-C18 PrepHT 逆相カラム	Agilent
1260 Infinity 液体クロマトグラフィー	Agilent
GPC KD-806M カラム	Shodex
Dawn Heleos II Light Scatterer	Wyatt
Optilab T-rEX 屈折率検出器	Wyatt
ガラスシンチレーションバイアル - 40 ml	ケムグラス	CG-4909-05
ガラスシンチレーションバイアル - 4 ml	ケムグラス	CG-4904-06
ガラスシンチレーションバイアル (PTFEライニングキャップ) - 2 ml	アジレント	5183-4518
スターバー	VWR	5894x	さまざまなサイズ
13 mm 0.45 & マイクロ;m ナイロン シリンジ フィルター	PerkinElmer	02542903
13 mm 0.45 & マイクロ;mポリテトラフルオロエチレンシリンジ	フィルターPerkinElmer	02542909
1ml使い捨てシリンジ	VWR	53548-001
スイングバケット遠心分離機または類似品			約4,000rpmに達することができるはずです
丸底フラスコ
フリットガラスフィルターアセンブリ
ロータリーエバポレーター
秤