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方法論記事

ヒトおよびサル毛髪から抽出およびコルチゾールの分析

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DOI:

10.3791/50882

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2014年1月24日

 ,  ,  , 
1Department of Psychology, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst

この記事について

サマリー

コルチゾール（CORT）は、ヒトとヒト以外の霊長類の成長毛幹に蓄積する。我々は、高精度と感度で髪のCORTを抽出して分析するための方法が記載されている。毛髪CORTの測定は、数週間から数ヶ月の期間にわたって慢性ストレスを評価するために特に適している。

要約

ストレスホルモンのコルチゾール（CORT）をゆっくりヒト、非ヒト霊長類、および他の哺乳動物の毛髪成長軸に組み込まれる。私たちは、開発および検証アカゲザル髪からCORT抽出および分析のための方法を、その後、人間の頭髪で使用するためにこの方法を適応。血漿または唾液から得CORT「サンプル点」、毛髪CORTは、視床下部 - 下垂体 - 副腎皮質の統合された尺度を提供する（HPA）系活性、およびホルモンの取り込み期間中にこのようにして生理的ストレスとは対照的である。人間の頭髪が1cm /月の平均速度で成長しているので、長さが数センチ髪のセグメントから得CORTレベルは、潜在的に数ヶ月もかけて経験したストレスのバイオマーカーとして機能することができます。

本手法では、それぞれの毛髪サンプルは、第汗や皮脂から堆積された毛幹の外側から任意CORTを除去し、イソプロパノールで2回洗浄する。乾燥させた後、試料は、毛髪のタンパク質基質を破壊し、抽出のための表面積を増加させるために微細な粉末に粉砕される。毛幹の内部からCORTをメタノール中に抽出し、メタノールを蒸発させ、抽出物をアッセイ緩​​衝液中で再構成されている。抽出CORT、標準および品質管理と共に、次いで高感度かつ特異的な市販の酵素イムノアッセイ（EIA）キットを用いて分析される。 EIAからの読み出しはmgの粉末状毛髪重量当たりの視聴のCORTに変換される。この方法は、ヒトでマカクザル、マーモセット、イヌ、およびホッキョクグマのいくつかの種を髪のCORTを分析するために我々の研究室で使用されてきた。私たちの研究室から他の研究グループからの両方の多くの研究では、自然の中で慢性的ストレス曝露を評価するだけでなく、実験室の設定のためのヘアCORTの幅広い適用性を実証している。

概要

血漿、唾液、または時々尿や糞中におけるCORTの測定は、ストレス1におけるHPA系の役割のセリエの発見以来、生理的ストレスの指標として用いられてきた。多くの論文が、急性ストレスの多い状況にHPA活性を関連する公開されているが、フィールドは、慢性生理的ストレスの簡単で信頼性の高い指標の欠如によって妨げられてきた。この問題は、日内変動を受けやすく、環境障害により混乱することができ、HPA活動の血漿および唾液降伏両方「点」の見積りために生じる。尿と糞便サンプルは、場合によっては一日までの時間数をまたがるCORTおよび/または代謝物の排泄を測定した結果を得ることができます。これらの行列のいずれかを使用して、複数のサンプルの収集経時CORTレベルの大まかな複合インデックスを提供することができるが、これらのアプローチのいずれも、HPA活性の真の長期的なインデックスと、このSYの応答性を提供しない慢性的なストレス要因に由来する。

髪にCORTを測定することは、ストレスの文献でこの重要なニーズを満たすために始めている。いくつかの研究室による初期の研究では、ヒトの毛髪CORTの存在を示したが、毛CORTレベルはストレス2の関数として変更されたかどうか調査していませんでした。私たちの研究室では、様々な社会的、行動要因3でアカゲザルHPA系の調節に何年も前から興味があったように、我々は、アカゲザルの毛4の抽出と分析のための方法を確立し、検証するために設定してください。血液媒介CORTをゆっくりと連続的に成長する毛に組み込まれていることを前提とし、この新たな方法の目的は、数週間から数ヶ月の期間にわたってHPA活性の指標として統合された毛髪由来CORTのレベルを使用することであった。

いくつかの方法論的な課題を、本プロトコールを開発する際に遭遇した。まず、これまでの研究では、その少量Oを示していたF汗や皮脂中に排泄されるCORT循環ので、コートの毛軸2の外側を可能性があります。この潜在的な交絡を排除するために、我々は成長している毛幹内に存在CORTにはほとんど影響を持ちながら、外部CORTを取り除くように見える穏やかな洗浄手順を開発しました。このように、この手順（イソプロパノールすなわち 2つの3分間の洗浄）を行うサルの毛は、総毛CORTコンテンツの約7から8パーセントを失い、3回目の洗浄は、サンプル4から1％未満、よりステロイドを削除しました。同じ手順で（未発表K.ローゼンバーグとJ.マイヤー、）サンプルから27％、総CORTコンテンツの平均を削除するので、ヒトの毛髪の外部CORTがあるように見える。サルの毛と同様に、しかしながら、付加的な洗浄が最初の2回の洗浄よりもはるかに少ないCORT（約7％）を含有した。そのため、サルと人間の髪の毛の両方から得られた結果は、主要なFRACを維持しながら、ほとんどの（すべ​​てではない）外部のCORTを取り外すことができるという主張を支持内部毛母内CORTのTiONから。第二に、我々の予備的研究はまた、前に有意に抽出し、髪を研削すると、おそらく毛幹の複雑なタンパク質性マトリックスをこじ開け、ならびに溶媒の浸透のために利用可能な表面積を増加させることにより、試料からCORT回復を増加することを示した。二つの異なる研削方法は、利点と欠点とをそれぞれ開発された。ボールミルを用いる方法1は、最高の粉末を生成するという利点を有する。しかしながら、ボールミル、比較的高価な装備アイテムであり、標準的な研削ジャー及びボールを使用する場合には、一度に二つの試料を粉砕することができる。少量の試料は、標準粉砕ジャーとをボールミルを用いて処理することは困難である。ビードビーターを用いる方法2は、その研削能力があまり効果的である。その結果、平均CORTの回復はボールミル（未発表データ）と比較してこの方法を使用して約10％低い。一方、ビードビーター試料16〜24は、モデルに応じて、一度に粉砕することができ、この方法は少量の試料に適している、ボールミルよりもかなり安価である。そのため、上記の差動回復するのではなく、特定の研究内のすべてのサンプルで同じ粉砕方法を使用することをお勧めします。

毛髪サンプルが処理されると、それらはもともと唾液CORTを測定するように設計され高感度で特異的な商業的EIAキットにより分析される抽出物中のメタノールおよびCORTで抽出する。抽出と分析手順は、猿の毛のサンプルからの抽出物の段階希釈が密接に本物のCORT標準から得た測定値を並列EIAの測定値が得られていることを実証することによって部分的に検証された。次に、（血漿および唾液CORTに加えて）ヘアCORTは新設住宅四半期4,5にサルの管理上義務付けられた移転の主要な生活ストレスに敏感であることを示した。 PRESENTペーパーは、ヒトとサルの毛髪試料を処理するために、そのようなサンプルからCORTを抽出し、分析するために、我々の研究室で日常的に使用される方法の詳細な説明を提供しています。

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プロトコル

1。サンプル収集と保管

  1. 人間の髪の毛
    1. 輪ゴムやクリップ（直径鉛筆幅まで）サンプリングする、髪の全体の長さを確保。できるだけ頭皮に近いカット髪きれいなハサミで（しないニック肌に注意しながら）。注：標準のサンプリング領域は、頭蓋骨の後部頂点である。
    2. 一部の研究者は、しかし参照Manenschijn ら 8（水やシャンプー7への反復暴露からウォッシュアウトが原因である可能性があり、頭皮6からの距離で人間の髪の毛のCORTレベルの低下を報告し、逆の結果を得るためにThomson ら 9を持っている全く分節下落がこの潜在的な「ウォッシュアウト効果」の影響を最小限に抑えるために）見られなかった、我々は、1cm /月10の平均成長率を想定した3センチメートル（、より大きくない長さの頭皮に近位ヘアセグメントを収集することをお勧め3センチメートルセグメントは、Cが含まれていますおよそ過去3ヶ月の間に堆積されているORT）。これを達成するために、最初のカットから3センチメートルを測定し、3センチメートルサンプルを得るために再びカットする定規を使用しています。注：毛髪の長さに切断された後の研究は、前のサンプリング期間にわたってCORT沈着の遡及カレンダーを確立するために別個の1cmの長さのセグメントに試料を切断することを含むない限り、配向ストランドを保持する必要がなくなりまし6。
    3. アルミ箔、きれいな紙封筒、またはサンプル洗浄に使用されるタイプの15ミリリットルスクリューキャップポリプロピレン遠心管で作られたポーチに毛髪試料を配置します。 CORTは、毛髪2で非常に安定であるように、必要に応じて、サンプルを周囲温度で一晩出荷され、-20℃で無期限に保存することができる。
    4. 毛採取手順は、ボランティアで実施されるべきであると実践サンプルは完全な調査に着手する前に検討しなければならない。注：SMAなどの毛髪サンプルをそれは最低のCORT以下EIA規格の読みを得る可能性を最小限にするために、> 10 mgのサンプルを収集することが望ましいが、5〜10mgのは、ここに記載される方法を用いて分析することができるようにllの。
  2. 猿の毛
    1. 標準的な動物クリッパーを使用して、首のうなじから毛（100から250 mg）を剃る。 、できるだけ肌に近い剃る肌ではないニックに注意しながら、血液CORTレベルは、髪に見られるものと比較して極めて高いため出血を引き起こす。注意：一般的に髪の良い情報源であり、容易に前にリサンプリングに毛の再生のために観察することができるため、首の領域は、日常的サンプリングのために選択した。
    2. アルミホイルまたは15ミリリットルスクリューキャップポリプロピレン遠心管で作られたポーチに毛髪試料を配置します。猿の毛のサンプルが保存され、人間の髪の毛のサンプルに対して上記と同様に出荷されるべきである。
    3. 猿の毛は、人間の頭髪とは異なり、ST、その後、一定の長さに成長し、ので、11を成長させるのopは、CORT堆積のためのカレンダーとして皮膚から距離を使用するには、この場合には一般に不可能である。動物（例えば、周期的なルーチン健康診断時）を複数回サンプリングすることができる場合は、それがベースライン時点を設定し、時間が経過した所望の時間後に同じ領域をreshaveするための初期シェービングを行うことが望ましい。第二の試料中のCORTは、その区間5以上、HPA活性に対するサンプルのCORTの内容の正確な帰属が可能に剃る-reshave間隔の間に堆積した。

2。サンプル洗浄と乾燥

  1. 洗濯
    1. 15ミリリットルのスクリューキャップポリプロピレン製遠心管に各毛髪試料を配置します。
    2. ローテーターを用いて3分間繰り返し反転続い各チューブに高速液体クロマトグラフィー（HPLC）グレードのイソプロパノールを5ml加える。
    3. cとしながら、廃棄物容器にイソプロパノールをデカントサンプルのいずれかを失うことはありません。
    4. 繰り返します2.1.2および2.1.3をもう一度繰り返します。
  2. 乾燥
    1. 完全イソプロパノール蒸発を確実にするために、少なくとも2〜3日間髪を乾かす。

3。サンプル研削、CORTの抽出 - 大型サンプル用のメソッドの1

  1. サンプルの粉砕
    1. ステンレス鋼は、単一の12ミリメートルのステンレス鋼の研削ボールと一緒に瓶を粉砕する10ミリリットルに乾燥した毛髪の250ミリグラムまで入れます。
    2. ボールミルを用いて25ヘルツの速度で6分間、試料を挽く。
    3. 化学天秤で粉末状の毛の50ミリグラムまで秤量し、その後のCORTの抽出のためのクリーン2.0ミリリットルポリプロピレン製マイクロ遠心チューブに移す。
  2. CORT抽出
    1. 粉末試料を含有するマイクロチューブをHPLCグレードのメタノール1.0ミリリットルを追加します。
    2. チューブに蓋をして、COを用いて、室温で18〜24時間、サンプルをインキュベート回転子を使用してnstant反転。
    3. 粉末状毛髪をペレット化し、室温で1分間、14,000 rpmで管を遠心分離する。
    4. 粉末状の毛のペレットを乱さないように注意しながら、新しい1.5 mlのマイクロチューブに上清の0.6ミリリットルを転送します。

4。サンプル研削とCORT抽出 - 少量のサンプルのための方法2

  1. サンプルの粉砕
    1. ビーズビーティングの鉄筋予め秤量した2ミリリットルの微量遠心チューブに毛の60ミリグラムまで入れます。
    2. 試料重量を得るために、バイアルを再び秤量。
    3. 各バイアルを3 3.2ミリメートルクロム鋼ビーズを追加し、ビーズビーター中で少なくとも2分間、試料を研削。目視検査は、サンプルが十分に粉砕されていることが明らかになった場合には、0.5または1分間の追加の研削を行う。注意：CORT抽出を研削と同じバイアル中で実行されるので、地毛権移転は、この場合必要ありません。
  2. CORT抽出
    1. 粉末試料を含有するマイクロチューブをHPLCグレードのメタノール1.5ミリリットルを追加します。
    2. チューブに蓋をし、回転子を用いて一定反転しながら室温で18〜24時間、サンプルをインキュベートする。
    3. 粉末状毛髪をペレット化し、室温で5分間、10,000 rpmで管を遠心分離する。注：クロム鋼ビーズ法1と比較してより低い遠心分離速度を占める、抽出と遠心分離のステップの間に髪をチューブ内に残っている。
    4. 粉末状の毛のペレットを乱さないように注意しながら、新しい1.5 mlのマイクロチューブに上清の1.0ミリリットルを転送します。

5。溶媒の蒸発とサンプルの再構成

  1. 真空蒸着装置が利用できない場合、真空蒸発又は窒素ガス流のいずれかを用いてメタノールをドライダウン。真空蒸着装置を使用する場合、メタノール蒸気を用いて捕捉することができるコー​​ルドトラップや活性炭カートリッジを搭載した化学トラップの。
  2. メタノールを除去した後、EIAアッセイ緩​​衝液（アッセイ希釈剤）適切な容量のCORT抽出物を再構成する。比較的高いCORT値が予想される場合には、0.4ミリリットル以上のバッファ量を使用しています。比較的低い値が予想される場合には、ボリュームは感度を高める0.2 ml以下にすることができる。注：0.2mlの試料の再実行が必要な場合に、少なくとも二回重複した試料のアリコートを実行するのに十分な量である。
  3. どちらかは、すぐに再構成されたサンプルを分析するか、後の分析のために-20℃で、それを凍結する。注：再構成した試料を凍結している場合、最終的な計算が実行されるときに試料体積の変化が偽CORT値につながるので、凍結期間中に昇華を回避することが重要である。

6。 CORTアッセイおよびデータ変換

  1. 毛髪抽出物をアッセイする高感度酵素イムノアッセイ（EIA）キットを用いてCORT。注：商業唾液CORT EIAキットを使用する場合は、試験サンプルが重複し、各再構成されたヘアエッセンスの分量の代わりに、唾液サンプルであることを除いて、キット文書に記載されているメーカーの推奨に従ってください。
  2. すべてのアッセイで使用するための品質管理（QC）のヘアエッセンスを準備します。
    1. 余分な毛のサンプル数を収集し、いずれかのステップ4.1および4.2のように個々に処理したり、ステップ3.1と3.2との大きなサンプル処理のためにそれらをプールする。
    2. 溶剤を蒸発させて、ステップ5.1および5.2のように、抽出物を再構成し、いくつかの個々のまたはプールされたサンプルから再構成された抽出液をプールする。
    3. 個々のマイクロ遠心チューブにプールし再構成した抽出液（ 例えば 0.10ミリリットル）の適切な量を分取し、後で使用するために凍結する。
    4. REFEを提供するために、各免疫測定マイクロプレート上で重複して1 QCアリコートを解凍し、実行します各実行の品質をチェックするためCORT値をrence。
    5. アッセイ内変動係数（CV、サンプル値の組の平均値で割った標準偏差として定義される）は、アッセイ間CVを算出することができるのに対し、同じランで10-12 QCウェルを分析することによって計算することができる。ランのグループ全体QC値を用いて。自分のマイクロプレートリーダーソフトウェアは、各ヘアエッセンスを表す連のウェルのためのCVを算出する場合には、アッセイ内CVを決定するための別の方法は、プレート全体を横切るそれらの個々のCV値の平均を計算することである。
    6. 任意のサンプル抽出物はEIAの最高CORT標準よりも大きい読み出しをもたらす場合には、抽出物の別のアリコートを、アッセイ緩​​衝液の適切な量で希釈され、その後のEIAの読み取りを希釈係数について補正される。連のウェルのためのCVは、> 10％であればサンプルも日常再分析している。
    7. CORT EIAキットはCORT VAを測定するように設計されているので梅毒、唾液または血漿のような液体試料中の、マイクロプレートリーダーソフトウェアの出力は、粉末状毛髪の単位重量当たりのCORT量に変換しなければならない。次の式はmgの毛ごとのPG CORTにμgの/ DLにおけるアッセイ出力を変換します。
      （A / B）*（C / D）* E * F =万
      ここで、Aアッセイ出力から=μgの/ DL;抽出し、髪のB =重量（mg単位）、C =巻。メタノール（中には）、粉末、髪に追加D =巻。抽出液から回収し、その後を乾燥し、メタノール（ML）であり、E =巻。乾燥した抽出物を再構成するために使用されるアッセイ用緩衝液（ML）で、PG / mgのヘアCORT濃度のFを=最終値。

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結果

図1に、方法2の粉砕·抽出を使用して処理人間の髪の毛のサンプル（成人男性と女性被験者）の代表的なセットからのプリントアウトを示しています。コンピュータソフトウェアは、データ出力を生成し、CORT規格（ 図2）を4 -パラメーターシグモイド曲線に適合させるために使用した。このプレートからの間のウェルCVは1.34％、平均アッセイ内CVの0.01から5.73パーセントの範囲であった。アッセイ間CVは、9個の最近のヒトの毛髪QCアッセイからの値を用いて決定さ4.41パーセントであった。 （;平均±SD = 36.0±110 PG / mgの中央値= 10.2 PG / mg）をこのプレート上で解析37サンプルは3.1-650 PG /ミリグラムから毛CORT値の範囲が得られた。

方法1は、非ヒト霊長類および他の大型動物からの毛髪試料を処理するために我々の研究室で使用される。 （ほとんどが雌から）大人のアカゲザルの髪の代表的なアッセイは50.1-102 PG / MG（中央値= 75.0からCORT値の範囲が得られ、平均...

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ディスカッション

上述の毛髪CORT手順、実行が簡単であり、比較的安価であり、容易に入手可能な化学物質、試薬および消耗品を利用して、1つの例外を除いて、典型的な分析実験室に存在する可能性が高い、装置を必要とする。例外は、例えばボールミルまたはミニビードビーターのような研削装置である。我々はいくつかの研究グループは、長さ12内のおよそ1ミリメートルの小さな断片に毛髪サンプルをミンチが、我々の観察に基づいて、我々は、研削の代わりに、すべての可能であればミンチ実行を推奨していることに注意してください。文献における方法論的変動の別の領域は、前CORT抽出13に髪を洗うために、もしそうなら、どのような洗浄条件を使用するかどうかが含まれます。洗浄を行わない場合には、一方がメタノール抽出のみではないCORTは、発毛の数週間または数ヶ月かけて徐々に組み込まれず、汗及び/又は皮脂由来CORTは最近に堆積含有する可能性リスク髪の表面。おそらく、主に表面汚染を示し、完全な毛を簡単にイソプロパノール洗浄によって除去緩く結合画分との広範なメタノール抽出によりアクセスすることがより緊密に結合画分：ホッキョクグマサンプルに関する研究は髪に2...

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開示事項

著者らは、宣言する特別の利害関係はありません。

謝辞

我々は、この研究で分析し、人間の毛髪試料を提供するためのKymberleeオブライエン、セリア·ムーア、エドワードTronick（心理学科、マサチューセッツ州、ボストン大学）に感謝し、スティーブン·スオミとアマンダDettmer（比較動物行動学、NICHDの研究室）のためのアカゲザルの毛のサンプルを提供。この方法の最初の開発と継続的な使用は、人類にNIH RR11122によってサポートされています

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
HPLCグレードのイソプロパノールフィッシャーA451
HPLCグレードのメタノールフィッシャーA452
唾液コルチゾールアッセイキットSalimetrics1-3002アッセイの感度と特異性に関する情報については、メーカーのキットインサートを参照してください
15 ml ポリプロピレン製スクリューキャップ遠心分離管マックスサイエンティフィック10-9151
1.5 mlSafe-Lockマイクロ遠心チューブFisher05-402-25
2.0 ml Safe-Lockマイクロ遠心チューブFisher05-402-7
2.0 ml XXTuff強化マイクロバイアルBioSpec330TXミニビーズビーターと併用
3.2 mmクロムスチールビーズBioSpec11079132cミニビーズビーズと併用
10mlステンレス製研削ジャーRetsch02.462.0061ミル
12mmステンレス鋼研削ボールRetsch05.368.0037ミキサーミルと使用
Savant活性炭カートリッジフィッシャーDTK120RSavantケミカルトラップと使用
15ml遠心チューブ用ローテーターフィッシャーS02135
遠心チューブ用ローテーターフィッシャーNC9854190
微量遠心チューブ用卓上遠心分離機Fisher13-100-675
MM 200 ミキサーミルRetsch20.746.0001
Mini-Beadbeater 16 BioSpec607
Savant DNA SpeedvacFisherDNA120-115
Savant冷蔵ベイパートラップFisherRVT400-115
SavantケミカルトラップFisherSCT120冷蔵ベイパートラップの代替品
マイクロプレートリーダー
マイクロプレートウォッシャー
マイクロプレートミキサー
マルチチャンネルピペッター
分析天びん
ミキサーマイクロ

参考文献

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