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方法論記事

床板リリースされた信号の機能的特性を評価するために馴化培地離さ床板組織と生産の文化

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DOI:

10.3791/50884

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2014年2月11日

 ,  ,  , 
1CGphiMC, UMR CNRS 5534, University of Lyon 1

この記事について

サマリー

フロア·プレートは、脊髄を現像前駆細胞への拡散信号を提供し、ニューロン分化の重要な構造である。我々は、床プレート馴化培地を生成するために、新鮮な脊髄組織に適用し、そして生化学ことにより、目的のタンパク質上の影響を評価するための方法を記載している。

要約

開発中に、前駆細胞と有糸分裂後のニューロンは、彼らの運命を制御し、隣接する地域からの信号を受信する。床プレートは、腹の位置に上衣運河の内側を覆うグリア細胞のグループです。床プレートは、脊髄内の細胞系譜のパターニングに貢献キーモルフォゲンを表現しています。後期発生段階で、床版は、交連軸索1により同側軸索と制御正中線交差の交差を防止するためのバリアとして機能し、脊髄内の軸索のナビゲーションを調整する。これらの機能は、様々な指導の手がかりの分泌によって達成される。他の人が地元の指導の手がかりに軸索2,3の感度を調節するために、ガイダンス受容体と下流のシグナル伝達を制御しながら、これらの手がかりの中には、成長している軸索のための誘引と忌避剤として機能します。ここでは、DEVE様々なフロアプレート由来シグナルの性質を調査可能にする方法を説明フロアプレート調整培地（FP センチ）4-6の生産に基づいてlopmentalコンテキスト。次に、軸索ガイダンスのコンテキストでこのFP cm の使用を例示。まず、脊髄をE12.5でのマウス胚から単離され、フロアプレートを解剖し、血漿トロンビンマトリックス（ 図1）で培養される。第2日後に、交連組織は、E12.5胚から摘出粉砕し、FPのCMにさらされている。第三に、組織は、交連のマーカーのウェスタンブロット分析のために処理される。

概要

床プレートは、前駆細胞と分裂後の細胞系譜と制御軸索ナビゲーション7,8の仕様で重要な役割を果たして、開発脊髄のよく知られたパターンニングセンターです。 FP CMを作るためにここに記載の実験方法は、細胞のパターニングと生存の細胞と軸索の移行のために、研究者は発生過程の様々な文脈でのフロアプレート由来のシグナルの機能的特性を評価することができます。

このようなFP cmの使用を例示するために、交連ニューロンを含む背側脊髄組織は、解剖dilaceratedおよびFP センチメートルで刺激する。組織は、次いで、ウェスタンブロット分析のために処理することができる。これは、床版リリースされた信号により、軸索誘導機構の規制を調査できます。 dilacerated新鮮な組織の治療方法は、目の中の細胞の微小環境を保存する大きな利点を保持しているE組織。従ってFP センチによる治療または治療のいずれかのタイプの結果は、細胞及び組織培養条件におけるよりもより生理学的な方法で評価する。

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プロトコル

1日目

1。 E12.5マウス胚からの脊髄床板（FP）の解剖

注意：全体の手順は、無菌状態を使用する必要があります。これは、汚染を避けるために切開フード下で切開を行うことが好ましい。フードの表面をエタノールで洗浄する必要があります。すべての解剖器具は、滅菌シャーレに滅菌され、維持されなければならない。液体（媒体、切開媒体）を閉じたまま、氷浴中に入れなければならない。各胚は、個々の新鮮なドロップで採取します。これは組織保存のために重要である。解剖はデュモン＃5鉗子を用いて行われる。後脳に損傷せずにお料理、グリップ臍帯やヘッドとの間に胚を転送します。それが正常解剖を完了するために、脊髄を損傷しないことが重要です。調製冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、冷ハンクス平衡塩溶液（HBSS） -6.5％グルコース及び室温神経基礎培地。

1.1脊髄解剖

動物は、欧州指令次のセンター国立デラルシェルシュ科学研究の動物ケアのガイドラインに従って処理する。安楽死の方法は、首に圧力を適用し、脳から脊柱を脱臼からなる、頸椎脱臼である。この方法は、マウス動物モデルのために推奨され、迅速かつ効率的な方法で行うことができる。

  1. 妊娠（つや消し次E0.5 =初日）のE12.5の妊娠マウスを安楽死させる。マウス腹側を上にして置きます。
  2. 70％エタノールで腹部を浸す。アドソンのピンセットで腹部の皮膚をつまんで、外科はさみで皮膚と腹膜層を通ってカット。切開を行い、腹腔を露出させ、マウスの両側にカットするために使用します。
  3. 胚の文字列は、マウスの各側に存在している。 UTEの1ホーンを把握2胚および外装部品から始め、それを解剖する間の組織内RUS。氷上で冷P​​BSで100ミリメートルペトリ皿にそのまま子宮を転送します。
  4. 胚体外組織から胚を抽出します。鉗子の2ペアが（濃い赤）胎盤組織をつかみ、組織を引き裂き、子宮嚢からの胚を取り除くためにそっと引き出します。

注意：より良い保全のために、彼らの子宮嚢1つずつから胚を収集します。

  1. 次のステップは、双眼虫眼鏡や解剖フードの下で行われている。冷HBSS-6.5％グルコースの低下に1胚を置きます。
  2. 鉗子を使用して、胚を首を切る。

注：下顎と後脳の間で切断、後脳の後部には、次のステップのために重要である。

  1. 実験者が直面する前部と胚の腹面を下にして置きます。
  2. 肌をつまむ鉗子の1組とし、他のペアを持つ胚の皮膚を引き離す。

注：このステップは、皮膚が完全に胚の前部から削除されるまで繰り返されなければならない。

  1. 左に胚前側に回します。 1ピンセットで前部に胚を「突き止める」。他の鉗子で皮膚をつかみ、胚の吻側側に引きます。脊髄はそれからアクセス可能です。
  2. まだ脊髄を包む髄膜をカットする鉗子の片側を使用しています。脊髄は、今開いている。
  3. 右に胚の前方側に回します。
  4. 胚の子宮頸側から脊髄から組織を切り離す。脊髄（鉗子は、脊髄損傷を避けるために閉じ保持する必要があります）の下に鉗子をスライドさせます。鉗子は、脊髄の下に見えるようにする必要があります。脊髄の下の小さなロータリー運動は切り離すのに十分である組織および後根神経節（DRG）を囲む。

注意：このように、次のステップの間にそれを破壊する確率を高め、脊髄に重みを追加添付周囲の組織を残す。

  1. 冷HBSS-6.5％グルコースの新鮮なドロップで孤立した脊髄を置きます。
  2. 上部と前部側の髄膜離れて実験者から、平らな位置に脊髄を置きます。
  3. 1ピンセットで残りの後脳を使用して脊髄を「突き止める」、第二の鉗子は髄膜をつかむと。脊髄の吻側側から髄膜をはがす。

注：運動は脊髄のいずれかの破壊を避けるために低速で一定でなければならない。振動運動は、髄膜の剥離を容易にすることができる。

1.2 FP郭清

  1. 1ピンセットで後脳ピンチ。
  2. FPは、中央TRAです組織のnsparent一部。メスを使用すると、底板を切り出す。

注：同じ品質で両サイドをカットし、吻側側から開始して、交互に右側と底板の左側を切った。

  1. 室温でNeurobasal培地中で解剖し、FPを節約。

2。 FP文化

注：すべてのステップは、組織培養フード内で無菌条件下で実施すべきである。新鮮な培地と新たに解凍サプリメントおよび試薬を使用してください。滅菌ガラスカバースリップ、暖かい神経基礎+ B27、血漿およびHBSS-トロンビンを準備します。

2.1 FP文化

  1. 各カバースリップの中央に100ミリメートルペトリ皿ピペット20μlの血漿中でいくつかの滅菌カバースリップを配置。
  2. 二から四のFP各血漿ドロップでの転送と次のプラズマ降下に20μlのHBSS-トロンビンを加え、丁寧に混ぜ合わせます。カバースリップを保つ血漿の凝固を可能にするために、室温で10分以上である。

注意：一部の解剖例における完全な解剖以上の場合の譲渡2のFPを。ピペットチップでゆっくりと混ぜて、FP外植片との接触を避ける。

血漿クロットは、凝固の印として数μmを後退させる。凝固は、血漿血餅の分離を回避するために、途中で停止してはいけません。

  1. 24ウェルプレートの各カバースリップを転送したNeurobasal + B27の500μlを添加する。 37℃で48時間インキュベートする

3日目

3。 FP調整培地（FP センチ ）収穫

注：収穫は、組織培養フード内で無菌条件下で実施すべきである。上清を培養ペリ中に汚染されているか、床板（意味浮遊している場合、彼らは死亡している可能性がある場合OD）は、この井戸からのFP CMを収穫しないでください。

3.1のFP CM収穫

  1. 丁寧に収穫各ウェルからの培地。

注：プラズマ重合トロンビンミックスまたはFPフラグメントをピペットないでください。

  1. -80℃で100μlアリコートを保存

4日目

4。 E12.5マウス胚から脊髄交連ニューロンの解剖

注：この製剤は、無菌条件下で実施する必要はない。胚を収集するために、上記の手順に従ってください。冷PBS、冷HBSS-6.5％グルコースと冷たい神経基礎を準備します。

4.1脊髄解剖

  1. 鉗子を使用して、胚を首を切る。

注：下顎と後脳の間で切断、後脳の後部には、のために重要である次のステップ。

  1. 実験者が直面する前部と新鮮なドロップに胚腹面を下にして置きます。
  2. 1鉗子で胚の皮膚をつまんで、他の1で皮膚を引き離す。

注：このステップは、皮膚が完全に胚の前部から削除されるまで繰り返されなければならない。

  1. 左に胚前側に回します。 1ピンセットで前部に胚を「突き止める」。他の鉗子で、肌を把握し、脊髄を露出させ、胚の吻側側に引きます。
  2. まだ脊髄を包む髄膜をカットする鉗子の片側を使用しています。脊髄は、現在公開さとオープンされている。
  3. 右に胚前側に配置します。
  4. 胚の子宮頸側から脊髄から組織を切り離す。脊髄（閉じた鉗子を保つ）の下に鉗子をスライドさせます。のためにCEPSは、脊髄の下に表示する必要があります。脊髄の下の小さなロータリーの動きは、隣接する組織と後根神経節（DRG）を取り外すのに十分である。
  5. 冷HBSS-6.5％グルコースの新しいドロップで孤立した脊髄を転送します。
  6. 上部と前部側の髄膜離れて実験者から、平らな位置に脊髄を置きます。
  7. 二鉗子は髄膜をつかむと、1ピンセットで残りの後脳を使用して脊髄を「突き止める」。脊髄の吻側側から髄膜をはがす。

4.2交連ニューロン解剖

  1. 1ピンセットで後脳ピンチ。
  2. 交連ニューロンは、脊髄（背側）の最外側部​​に位置している。細かいメスで、この横方向の部分を切り出す。

注記：脊髄の背側部分は、セルdの違いによって、腹側部分から区別することができるensity、腹側の部分は、より不透明であること。

注：同じ品質で両サイドをカットし、吻側側から開始して、交互に右側のと左側の小さな長さをカット。

  1. すぐに使用氷上Neurobasal培地中で解剖した組織を節約する。

5。 FPのCMと交連組織の処置

注記：この手順では、無菌状態を必要としません。組織は、個々の1.5mlチューブに収集することができる必要があります。凍結されたFPのCMは、一度だけ使用されるべきである。複数の再凍結は避けてください。暖かいFP センチを調製し（37°C）。

交連ニューロンの5.1治療

  1. 小さなハサミで交連組織を引き裂く。

注：可能な限り小さく、組織を切断し、細胞のアクセス可能性を増強する。

  1. かなり異なる実験条件の制御処理およびFP CM処理の間の組織を配布します。
  2. 4℃で1分間、800×gで組織片を遠心分離
  3. チューブ間の再分配を確認してください。

注：断片まで再必要な再配布遠心分離機が均等に分散している場合。

  1. 上清を取り除きます。
  2. 組織に暖かいFP CMとコントロール治療を追加します。

注意：ボリュームがペレットの量に調整する必要があり、少なくとも二回ペレットの量でなければなりません。

  1. 30分間37℃でインキュベートする。

注意：ゆっくり10〜15分毎に振る

  1. 1分間800×gで遠心分離し、治療を取り外します。
  2. 溶解バッファーを追加します。

注：ボリュームがAに調整する必要がありますペレットのマウントとは、少なくとも二回ペレットの量でなければなりません。

  1. アップピペット上下ペレットを再懸濁する。

注：渦を使用することもできる。

  1. 氷上で15分間インキュベートする。
  2. 4℃で15分間14,000 xgで遠心分離
  3. 上清を保持し、ブラッドフォードアッセイ9とタンパク質の量を測定する。
  4. 6Xレムリ·バッファを追加します。
  5. タンパク質含量を変性させ、5分間95℃でインキュベートする。

注：サンプルは、直ちに使用することができ、または-80℃で保存することができる。

  1. ウエスタンブロット10による治療の効果を評価する。

注：総タンパク質の少なくとも50μgの各レーンのためにロードする必要があります。

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結果

交連組織はFP センチにより処理し、試料を、ウェスタンブロットにおける受容体レベルの分析のために処理した。 FP cm のアプリケーションは、ガイダンス受容体のレベルを増加させる（ 図2）を横切った後正中線忌避Semaphorin3Bに交連軸索の感受性を媒介するPlexinA1を示した。これは、FPが発表した信号がPlexinA1レベル4,6を制御することを明らかにした。

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図1。フロア·プレートを単離する解剖手順のスキーム。切開および培養法の異なるステップが示されている。 1）胚の頭を切り落とし、2月...

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ディスカッション

フロアプレート馴化培地の生産は床板にリリース信号の生物学的特性を評価するための効率的かつ簡単な方法を提供します。

プラズマトロンビンマトリックスは、組織の生存のための優れた条件を提供しています。それにもかかわらず、この豊かな環境は、実験の種類によっては制限がある可能性があります。このように、底板組織はまた、アガロースマトリックスで培養することができる。床板馴化培地の品質は、例えば、GDNF（ 図2）、Shhおよびネトリン11のような公知のフロアプレート放出シグナルの検出によって評価することができる。馴化培地中のそれらの存在は、ウエスタンブロットまたはドットブロットにより評価することができる。

この手順では、細胞は、その本来の微小環境で研究されています。これは、治療に反応する組織中の細胞の種類に関する詳しい情報を防ぐことができます。床板は、均一な構造、行為の濃度ではないのでなどのWntなどのIVEコンポーネントは、吻側 - 尾側軸に沿って切開した地域によって文化の異なる場合...

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開示事項

著者らは、開示することは何もない

謝辞

我々は彼らの助けをカリーヌKindbeiter、ミュリエルBozon、およびFlorieレイノーに感謝します。仕事はCNRS、ANR依田プログラムとLabex DevWeCanでサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Reagents Required
PBSInvitrogen14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+- freeInvitrogen14170-088
GlucoseSigmaG-7021
NeurobasalInvitrogen21103-049
PlasmaSigmaP-32661 mg/ml (H2O および濾液に再構成)
トロンビンSigmaT-464810 mg/ml(H2O および濾液に再構成)
B27Invitrogen17504-04450x
HEPES (260 g/mol)SigmaH-7006
EDTASigmaE-55130.5 M, pH 8
MgCl2Euromedex21891M
グリセロールVWR24388.295
IGEPALSigmaI-3021
完全プロテアーゼ阻害剤カクテル錠Roche04 693 116 001
オルトバナジン酸ナトリウム (Na3VO4)SigmaS-6508
蒸留 H2O
表 1.必要な試薬
Tools and Materials
Surgical HasorsFine Science Tools14002-12
Adson 鉗子Fine Science Tools11027-12
Dumont #5 Fine Tips FineScience Tools11254-20
MicroknivesFine Science Tools10136-14
Table 2.ツールと材料。<
td colspan="4">Laemmli Buffer
解剖とFP培養
エタノール 70%
解剖フード
解剖顕微鏡
ペトリ皿
ガラスカバースリップ18mm
ブンゼンガスバーナー
24ウェルプレート
組織培養インキュベーター(37°C;C、5% CO2、湿度管理)
遠心分離機
Recipes
FP培地
Neurobasal
B271/50eからの株式
HBSS-thrombinからの希釈
HBSS1 ml
トロンビン 10 mg/ml30 μl
Lysis Buffer pH 7,4
HEPES (260 g/mol) 25 mM
EDTA (pH 8) 5 mM
MgCl2 1 mM
グリセロール10%
IGEPAL (NP40) 0.10%
プロテアーゼ阻害剤カクテル 1x
オルトバナジン酸ナトリウム 0.2 M
H2O
Tris 0.5 M, pH 6,8 375 mM
SDS6%
グリセロール60%
DTT0.6 M
ブロモフェノールブルー
H2O

参考文献

  1. Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
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  9. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  10. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J. Vis. Exp. , (2010).
  11. Salinas, P. C. The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord. Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).
  12. Bechara, A., et al. FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse. EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).

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