このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

バイオメディカル応用のためのシルクシルクプロテイン合金材料設計

17.9K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/50891

⸱

2014年8月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, Rowan University, 2Department of Biomedical and Translational Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Sciences, Cooper Medical School of Rowan University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Rowan University

この記事について

サマリー

ブレンドは、プロパティと組み合わせた幅広い機能を持つ生体材料を生成するための効率的なアプローチである。異なる天然絹タンパク質との間の分子相互作用を予測することによって、調整可能な機械的弾力性、電気的応答、光学的透明性、化学的加工性、生分解性、または熱安定性を有する新規の絹の絹タンパク質合金プラットフォームを設計することができる。

要約

繊維状タンパク質は、バイオセンサー、ナノ医療、組織再生、および薬物送達のような生物医学分野でのさまざまな用途に使用されている別の配列および構造を示す。これらのタンパク質間の分子スケールの相互作用に基づいて材料を設計する調整可能な特性を有する新規多機能タンパク質合金の生体材料を生成するのに役立ちます。このような合金材料系はまた、体内の物質の生分解性、生体適合性、および維持可能性を従来の合成ポリマーと比較して利点を提供する。この記事では、タンパク質合金を生産する方法、計算方法によって、タンパク質-タンパク質相互作用を予測する方法など、これらのトピックについての有用なプロトコルを提供するための一例として、野生のタッサーシルク（ 柞蚕 ）と国内桑絹（ カイコ ）のタンパク質ブレンドを使用ソリューションは、どのように熱分析の合金系を検証する方法、および可変合金材料を製造するために回折格子を有する光学材料、回路コーティングを有する電気材料、及び薬物放出および送達のための医薬材料を含む。これらの方法は、異なるタンパク質合金に基づく次世代の多機能生体材料を設計するための重要な情報を提供することができる。

概要

自然は構造タンパク質の限られた数を使用して調整可能な多機能生物学的マトリックスを生成するための戦略を作成しました。例えば、エラスチン及びコラーゲンは、常に特定の組織1,2に必要な調整可能な強さと機能を提供するためにインビボで一緒に使用される。この戦略の鍵は、ブレンドです。混合は特定の比率で混合するタンパク質を含み、調整可能な多様性質3-5とシンプルな材料系を生成するための技術的なアプローチである。また、材料の均一性及び操作8-16の容易さのために材料を処理する能力を向上させることができるブレンド、合成操作戦略6,7と比較した。従って、多機能性、生体適合性タンパク質合金材料を設計する医学研究の新たな分野である。この技術はまた、VITの両方で 、細胞および組織の機能上の天然タンパク質マトリックスの影響を体系的知識を提供するROおよびin vivo 10,17 中 。異なるタンパク質間の分子のインターフェースを最適化することによって、タンパク質ベースの合金材料は、異なる温度で角膜組織再生3多様な組織、変数器官における電気的感度、及び光学的特性をサポートするための弾性を、熱安定性などの物理的な機能の範囲を包含することができる18-27。これらの研究の成果は、調整可能な組織の修復および疾患の治療およびその新たな治療および診断機能は3を想定することができる生分解性のインプラント装置をさらにリードに直接関係して生物医学科学の分野での新たなタンパク質材料のプラットフォームを提供します。

多くの天然構造タンパク質は、生体材料マトリクスの候補として活用することができる重要な物理的および生物活性特性を有する。別のワームの種からのシルク、異なる組織から毛やウール、エラスチンとコラーゲンからケラチン、およびさまざまな植物タンパク質（ 図1）18-27可変タンパク質ベースの材料を設計するために使用される最も一般的な構造タンパク質の一部である。一般に、これらのタンパク質は、それらの固有の反復的な一次アミノ酸配列に3,28-35の異なる分子の二次構造（ 例えば 、ベータシルク用シート、またはケラチンためのコイルドコイル）を形成することができる。これらの機能は、生体高分子材料の秘蔵資源としての有用性を促す生物学的界面でのユニークな機能を備えた自己組織化巨視的構造の形成を促進する。ここでは、構造タンパク質の二種類は、さまざまなタンパク質合金生体材料を製造する一般的なプロトコルを示すために（一例として家畜化クワ絹からの野生柞蚕絹およびタンパク質B由来のタンパク質A）を用いた。タンパク質相互作用の予測やシミュレーション、パート2：プロテイン合金ソリューションの生産、及びその3：タンパク質合金の製造実証プロトコルは、パート1を含むシステムや、光学的、電気的、および医薬用途のために。

figure-introduction-1
図は、一般に、タンパク質ベースの材料設計異なるワーム種からの絹を含むために研究室で使用される各種の構造タンパク質の1原材料、毛およびウール、異なる組織からエラスチン、および各種植物タンパク質からケラチン。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

タンパク質相互作用の1。予測

  1. タンパク質分子のバイオインフォマティックス解析
    1. バイオテクノロジー情報のウェブサイトのための国立センター（www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）へ、そして合金研究のために使用されるタンパク質名を検索します。注：この例では、二つのタンパク質を使用した：野生柞蚕絹フィブロインであるプロテインA、および国内の桑シルクフィブロインであるタンパク質Bを、。プロテインAは、アミノ酸配列が記載されています"[柞蚕] GenBankのフィブロイン：AAC32606.1」（ 柞蚕は （オーク）柞蚕蛾中国人である）。と「フィブロイン軽鎖前駆体[カイコ]のNCBI参照配列：NP_001037488.1「一緒に（ カイコ ：タンパク質B、アミノ酸配列」NP_001106733.1フィブロイン重鎖前駆体[カイコ] NCBI参照配列」に記載されています森 ） は桑の木の家蚕です。
    2. 選択し、SAデータベースからのタンパク質Aおよびタンパク質Bのアミノ酸配列VEの。
    3. ExPASyウェブサイト（SIBバイオインフォマティクスリソースポータル）へ（www.expasy.org）またはを含むがこれらに限定されますが、ではないそれらの配列に基づいてタンパク質の基本的なバイオインフォマティクスデータを算出するために、他の商用ソフトウェアを使用して、分子当たり全電荷の疎水性指数この情報分子を、異なるpH値での分子の滴定曲線は、タンパク質相互作用の計算機シミュレーションのための基本要素として使用され、これらの2つのタンパク質が強力な相互作用を有するかどうかを理解するのに役立ちます。 [注：このステップは、正確に小ペプチドまたは機能性タンパク質科学において使用されるもののようなタンパク質相互作用のすべての詳細を予測するためのものではありません。このセクションの目的は「合金」材料と呼ぶことができない明らかなマクロ相分離したタンパク質混合物を生産避けることだけである。そのため、見積もりは概算しかし番目の可能性電子タンパク質合金系は、正確な熱分析]を用いて、ステップ3.1に記載した実験方法によって確認することができる。
  2. プロテイン合金系の数値シミュレーション
    以下のタンパク質合金系をシミュレートする手順について説明する。シミュレーションプログラムは、単一またはマルチプロセッサコンピュータシステム上で使用することができるCプログラミング言語で書かれている。格子ばね質量（LSM）モデルは合金タンパク質36-39をシミュレートするために使用した。春に取り付けられており、一つは各質量のための運動を理解する力方程式を解くことができたときに、LSMモデルがマス上の正味の力の簡単な説明が表示されます。次のようにLSMモデルを使用してこのタンパク質合金系をモデル化するための単純なプログラムアルゴリズムが与えられる。
    1. Mの質量を有する粗粒の粒子として単一のタンパク質を表す。
    2. ボンド38,39を表現するためにHookeanまたはネオHookean春を使用してください。スプリングを有する粒子の有限数を鎖交することにより、ある缶メートル合金タンパク質の安定なビルディングブロックを表し、サブ合金ドメインAKE。イントラ連動して債券の異なるタイプを表すために、異なるばね定数/剛性を使用しています。
    3. 鈍い架橋サブ合金から成る原料としてタンパク質合金系をモデル化する。ここでも異なる剛性は、サブ合金の間の結合の間に異なる結合を表すために使用された。
    4. 弱い結合を再形成することが許可されるときに通過するベルモデル40,41によって結合破壊と改質プロセスをモデル化するが、それらが壊れている、一度強い結合が再形成することはできません。システムが十分に（イントラsuballoyとインターsuballoy国債の両方）を強調すると、結合が壊れて改質することができます。
    5. 彼らが強調しているとき合金タンパク質上の変形の影響を研究するために、システムに外力を加える。力方程式（ニュートンの法則）を解くときに、各粒子に均等にこれらの力を配布します。
    6. 相互作用をモデル化する（例えば、水分子など）の溶液とタンパク質との間で、それぞれの粒子に対するさらなる抵抗力または摩擦力を加える。
    7. 各力（結合、外力、摩擦力のばね力）のアクションを持つ各粒子のための力の方程式を解く。
    8. 時間の関数としてタンパク質粒子の位置を計算し、抽出する。
    9. 粒子の位置から合金タンパク質を特徴づける物理量を計算します。
    10. 異なるタンパク質間の相互作用を理解するために、プログラムで結合剛性を変更します。 （平均結合剛性はタンパク質材料のヤング率から計算される。異なる繊維状タンパク質材料のヤング率は、ユニバーサル引張試験18によって、または直接以前の文献2-4,18のいずれかから得ることができる）。

プロテイン合金ソリューション2。生産

野生柞蚕シルク（プロテインA）と国内桑絹（タンパク質B）は、タンパク質の合金系の一例として、ここで選択される。このプロトコルは、最初に野生のタッサーシルク（プロテインA）ソリューションを取得する方法を提示します。

  1. 生の野生のタッサーシルクの繭又は繊維は3グラムの重さでカット。
  2. ナトリウムジカーボネートまたは炭酸ナトリウム3gを測定する（注：炭酸ナトリウムを使用して、タンパク質鎖の分子量が沸騰プロセス42の間に減少する場合）。
  3. 蒸留水（H 2 O）を2Lのガラスビーカーを埋める。その後、沸騰にアルミニウム箔および熱でそれをカバー、ホ​​ットステージ上でガラスビーカーを置く。
  4. アルミ箔のカバーを取り外し、沸騰したお湯にゆっくりと測定されたナトリウムカルボネートを追加し、それが完全に溶解することができます。 （注：ナトリウムカルボネートの役割は、野生の絹繊維の表面に付着した水溶性のセリシンタンパク質および他の不純物をきれいにする「石鹸」ですOTHを使用している場合。えー自然タンパク質繊維、）は文献に基づいて対応する化学物質を選択してください。
  5. 沸騰したお湯に生のタンパク質繊維（野生絹繊維）を追加し、注意してください（2〜3時間沸騰することができます：。沸騰時間は、タンパク質鎖26,43の分子量に重大な影響を与えている一つは応じて適切な時間を選択する必要があります文献にまたは対照実験26,43を実行することによって。沸騰温度もタンパク質鎖26,43,44）の分子量に影響を与えるように調整することができる。
  6. 煮沸後、慎重に溶液からスパチュラでタンパク質繊維を除去し、過剰の水を除去するためにそれらを絞る。 （注意：繊維が高温になっています！）
  7. 次に、冷蒸留水で2リットルのビーカー中の繊維を浸漬し、完全に繊維表面から不純な残留物を除去するために30分間、それぞれ2回繊維を洗浄する。少なくとも12時間、ヒュームフード内の繊維を乾燥させる。
  8. カルシウムNITの45.784グラムを溶かし野生絹タンパク質繊維を溶解するために65°Cで液体を形成するためのレート（のCa（NO 3）2）ガラスビーカー中。 （注：他の天然タンパク質繊維を使用している場合は、タンパク質を溶解するために、対応する溶媒を選択ここでは、また、9.3 M LiSCNまたはLiBrの溶液、または別の絹繊維を溶解するための85％のリン酸水溶液を使用することができます。）
  9. 溶剤10ミリリットル中に1グラム繊維の割合で繊維や溶剤を組み合わせる。繊維は5から12時間、95℃で溶解させる。 （注：溶解時間は、タンパク質26,43-45の分子量に依存します）
  10. 注射器を使用して、（カットオフサイズとして最大100万kW）12ミリリットル透析カセットにワイルドシルク液や密封された透析チューブ（カットオフサイズとして最大100万kW）を注入し、蒸留水2Lに対して透析。 （注：35°Cで溶液を維持した場合、注射は、より効率的であり、そうでなければ、タンパク質溶液の粘度は劇的に室温で増加する）。 （NO 3）溶液中の2溶媒（3日間30分後、2時間、6時間、その後、12時間ごとに。合計で約8水換えがあるでしょう）のCaを除去するために頻繁に蒸留水を変更します。
  11. 3日後、透析カセットまたは管からのタンパク質溶液を収集し、13000 rpmで、定格のチューブに配置します。
  12. 堆積物を除去する4℃の3倍で3,500 rpmで1時間のためのソリューションを遠心します。各遠心分離の実行後は、すぐに新しいチューブに上清を引っ張る。 4℃の冷蔵庫で、最終的な解決策を保管してください。
  13. （これは通常は12時間以上かかる）ポリジメチルシロキサン（PDMS）基板などの平らな疎水性基材上にタンパク質溶液5mlを注ぎ、それが完全に乾燥させます。残った固体タンパク質フィルムを計量し、（溶液に）重量（容量％/ w）の割合=（mg単位）測定された重量÷10÷5によって最終溶液濃度を算出。
  14. このCASに（別の選択された天然タンパク質繊維を収集電子、飼いならさクワ絹）をタンパク質Bとして使用し、測定された濃度を有する最終的なタンパク質水溶液が得られるまで、適切な「石鹸」と溶剤溶解で上記プロセスを繰り返す。 [注：タンパク質材料が粉末形態である場合、「ソーピング」プロセス中にサンプルを保持するために適切な多孔性のチューブまたは膜を使用する。タンパク質は、既に精製されている場合には、直接粉末を溶解するために2.8に進む。タンパク質は、既に精製され、水溶性であるれている場合は、最初に、次にブレンドタンパク質溶液を作るために、次の2.15に進み、所望の濃度との水溶液を作る。]
  15. ゆっくりと1.0重量％タンパク質水溶液を形成するために4℃の蒸留水にプロテインA溶液（ここでは野生シルク溶液）を希釈する。タンパク質B（ここでは家畜化絹）のために同じプロセスを実行します。
  16. ゆっくりと4でプロテインB溶液と1重量％のタンパク質溶液を混合 °Cは、pを避けるために、ピペットを用いて混合中に凝集をrotein。 （注1：一部のタンパク質（ 例えば 、絹）は、振動46,47の間にヒドロゲルを形成するので、タンパク質を混合するためにボルテックス機器を使用しないでください注2：可能な場合は、混合速度および混合サイズ意思を制御するために追加のデバイスを使用する凝集を避けるために、可能な限り遅くに混合するようにしてください。すぐに、混合の間に溶液をピペッティングしないでください）​​。
  17. 最終ブレンドのソリューションは、指定された質量比またはプロテインAとのモル比を有するべきである：タンパク質B.典型的には、取得し、90:10の質量比が、75:25、50:50、25:75と10:90それらをミックス合金溶液の広域スペクトル。コントロールとして、純粋なタンパク質Aおよびタンパク質Bのソリューションを使用してください。プロテインB = R：（100-R）プロテインAのモル比を有する混合溶液である。ボリュームA：ボリュームB = R·（AのMW）：（100-R）·（BのMW）によって（同じ1重量％溶液に基づく）の混合体積比を計算する。
  18. 直ちにフィルムまたは他の指​​名打者を形成するためにPDMS基板に最終溶液を上にキャストgned材料。 （注：長時間にわたって高濃度のタンパク質合金ソリューションを保管しないでくださいさらに凝集体は水中でのタンパク質 - タンパク質相互作用に後で形成していてもよい。）。必要に応じて、イオンを含まない蒸留水でブレンド溶液を希釈し、溶液中での付加的なタンパク質凝集を回避するために、4℃の冷蔵庫に保管してください。

可変タンパク質合金材料の3。製作

  1. 熱分析による合金の予測を確認3,9,31-35
    1. PDMS基板を準備し、蒸留水に浸漬することによって、それらをきれいに。
    2. PDMS基板上に異なる混合比のタンパク質ブレンド溶液をキャストします。
    3. 膜が形成されるまで空気の流れとの化学フード内で少なくとも12時間ソリューションを乾燥（注：フィルムの厚さは、固定することができるように、異なる解決策を同じ体積を使用）。
    4. PDMS基板からのタンパク質合金膜を取り外し、きれいな皿に置きます。
    5. DSC研究のための多くの示差走査熱量測定（DSC）アルミニウムパンと蓋を秤量する。 （蓋のパンを加えた重量の重量が一定重量に等しい）に等しい総重量を持っている鍋と蓋のペアを一致させます。例えば、ここで蓋の全重量及び22.50 mgのパンを使用し、この総重量を有する蓋とパンの組み合わせの8セットを調製した。
    6. アルミニウムDSCパンには6mgの乾燥タンパク質混合物の各タイプをカプセル化し、プロセス3.1.5での一致したふたでそれらを封印。それ自体は、熱分析の際に記録されるサンプルの唯一の熱容量ように注意してください（参考として、サンプルで使用する空パンと蓋のペアをシール：DSCは、その対の基準パン+蓋の熱容量を比較するサンプル+パン+蓋。等重量のためにと、パンと蓋から背景熱容量は、パン中のサンプルの唯一の熱容量）を残し会計処理される。
    7. で、DSC装置に密封された参考文献およびサンプル皿を置く50ml /分の乾燥窒素ガス流をパージし、冷蔵冷却システムを装備した。サンプル測定の前に、DSC装置は、まず、それぞれの熱流量と温度、サファイアおよびインジウムで較正する必要があります。
    8. 150°Cに2 K /分の加熱速度でDSCを予め実行し、サンプル（全重量の典型的には約3〜10％）の残りの水分子を除去するために15分間この温度で​​保持する。すぐに25℃まで（10K /分）をクールダウン。
    9. 300 2 K /分の加熱速度で再びDSCを実行する °C、またはタンパク質ブレンドの分解ピークが34を表示されるまで。このプロセスの間に、異なる温度でのタンパク質試料の熱容量を記録します。 DSCをクールダウンし、異なる混合比の新しいサンプルを古いサンプルに変更します。
    10. DSCソフトウェア31〜35を用いて、各タンパク質ブレンド試料の温度曲線対の熱容量を計算し、プロットする。
    11. mは裁判官以下の方法によるタンパク質混合物のiscibility（熱および図5図4参照）と二つのタンパク質が完全に混和性である場合、それらは「タンパク質合金」と呼ばれることもある。それ以外の場合は「タンパク質複合体は、「ポリマー記述的理論48,49）に応じて適切な名前を次のようになります。
      1. 個別のタンパク質A及びBは、個別の単一のガラス転移温度、T gの（A）およびT gの（B）（ 図5の緑及び青の曲線を参照）3,48を有しているべきである;
      2. この単一のガラス転移温度は、二つの個別のタンパク質成分、T gの（A）およびT gを （B）との間の通常の中間体である3,48（ 図5参照）。
      3. 不混和性相分離がT gの（A）およびT gの（B）の両方が元の位置（ 図5）に現れ、それぞれのT gのステップであれば得られたブレンド物に比例して高さは、2つのタンパク質は3,48完全に非混和性である。
      4. （T gを （A）およびT gの（B）、1つの非常に広範なガラス転移を有し、または依然として2つのガラス転移を有することができるが、それぞれの純粋なタンパク質成分に対して互いに接近移動した半混和性複合ブレンドタイプ図5）を参照してください。この場合、2つのタンパク質成分の間に形成されたミクロ不均一相構造が存在する可能性があり、組成物が場所によって変化してもよい。
    12. （3.1.11.1）DSCに示す場合であり、それはタンパク質ABは、合金系であることが確認できれば、タンパク質合金材料を製造するために移動する。
  2. プロテイン合金による光学材料の作製
    1. （製造ラボで）プロデュースやキャスト用に設計された地形面を購入してください。この特定の例では、4つの回折パターンを有するガラスを使用した（ 図4オプティカル）。
    2. 皿に回折パターンを有するガラスを置き、パターン化された面を上に向けていることを確認します。
    3. ガラス表面上に均一にPDMS溶液を広げ、完全に（PDMS溶液を9にポッティングし、触媒溶液により行われるユーザ指示23,44に従って混合比1）表面パターンを覆う。
    4. 平らな面に、少なくとも2時間のしばらくの間、65℃のオーブンに鋳造皿を置きます。 PDMS溶液は、このプロセスの間に、固体基板に乾燥する必要があります。
    5. ガラスからPDMS基板を取り外します。回折パターンは、現在のPDMS表面に転写されるべきである。
    6. 適切なパンチを用いた回折パターンとPDMSモールドをパンチアウト。
    7. 回折パターンを有するPDMS表面上のタンパク質合金溶液をドロップし、回折パターンを有するフィルムを得るために、少なくとも12時間乾かし。
    8. 不溶性タンパク質合金材料を得るためには、ドクターのセット全体を置くチャンバーの底の水皿で60℃の真空オーブン（25キロパスカル）に、PDMS鋳型を含むyのフィルム。オーブン内の空気を汲み出し、そして少なくとも2時間、水蒸気アニールサンプルう。 （このプロセスは、温度制御された水蒸気アニール45と呼ばれている。広く使用されているメタノール法と比較すると、シルク素材45における類似のβシート含量を生成することができる）。真空を解除し、鉗子を用いてPDMS基板から水不溶性フィルムをはがす。この例では、野生シルク家畜化シルク合金が使用されている。
    9. ガラス上の原稿のパターンと比較することにより、フィルム上の回折パターンの品質をテスト（;一般的なパターン品質をレーザー回折パターンを収集し、例えば 、マイクロスケールの詳細については、SEM画像を収集する）。
  3. プロテイン合金材料に関する電気回路の作製
    1. ガラス基板上に電気回路パターンを作製するために、最初のクレアいくつかの脱脂を使用してNAのガラススライドは、メタノール中で5分間、続いてアセトン中で5分間、続いて5分間の超音波洗浄器、内Alconoxなどの溶媒。それはよりゆっくりとアセトンを、基板ではなく、乾燥および残す残留物を吹き飛ばすことができるよりも蒸発するので、メタノールは、最後に使用されます。
    2. 180 L液体窒素デュワーからボイルオフによって生成された乾燥窒素ガスを用いてガラススライドの乾燥を吹く。
    3. 堆積チャンバ内に基板材料を導入する。チャンバは、ロードロックを用いて設計されている場合（これらのガイドラインは、スパッタリングシステムのためであるが、他の堆積技術を使用することができる。）、蒸着チャンバー内の真空度が著しく影響を受けない。 30ミリトールの圧力にロードロックから立ち退く。
    4. ロードロックとメイン堆積室との間のゲートバルブを開き、チャンバー内に基板を導入する。
    5. Arガスと圧力調整器の電源を入れ、希望depositioに圧力を制御n個の圧力。より高い圧力はより低い圧力がより速い堆積フィルムを接着収率ながら低いエネルギーは、金属原子、より均一な膜をスパッタさ与える。圧力の範囲は、20トルがうまく働いて、3ミリトール〜60ミリトールの間である。
    6. 金属は、その後、同調回路は、金属ターゲットにRF電力を導くために必要とされる100 WのRF電力を用いてコーティングから基板を保護するシャッターに投影される。 DC電力は、金属ターゲットの代わりにRFを使用することができる。ターゲットから酸化物層および汚染物質を除去するために、数分間プレスパッタ。
    7. シャッターを開けて、基板上に金属をスパッタリング。上記構成のための堆積速度は、毎分約10nmである。この速度は、マグネトロンカソードの作動距離、圧力、磁石の強さ、目標厚さとスパッタされた金属に依存するであろう。所望の厚さを達成するために、堆積時間を調整する。
    8. からコーティングされたガラススライドを削除するチャンバー。
    9. スピンナーを用いて、フィルムの表面にフォトレジストをスピンコート。多くのレジストを使用することができる。このケースでは、ポジ​​型フォトレジストを使用した。
    10. レジストを乾燥させるために5分間90℃で膜、ソフトベーク上にスピンコートした後、レジスト。
    11. レジストのにぴったりとそろえ装置の画像をコンタクトマスクを配置します。 UV光源は、フォトレジストを露光するために使用される。露出は10秒ですが、光源の強さに応じて変化し、使用されるレジスト。
    12. 投影された画像が表示されるまで、フォトレジスト現像液にフィルムを配置します。現像液を洗い流すことは、ポリマー結合の破壊を引き起こすUV光に露光したレジスト画像が表示された直後に、未露光のフォトレジストで作業から開発者を停止するためにDI水にフィルムを浸す。
    13. 乾燥窒素ガスを用いたドライフィルムブロー。
    14. 写真「ハードベーク」を15分間120℃のオーブンにフィルムを置き抵抗する。
    15. フィルムを冷却した後、フォトレジストで保護されていない金属がリフトオフするまで、エッチング溶液に配置します。水中でのディップは、エッチングを停止します。
    16. 硬化したフォトレジストを除去するためにアセトンですすいでください。
    17. メタノールですすぎ、乾燥窒素でブロー乾燥。
    18. コー​​ティングされたガラスは、準備ができたら、ガラス表面上に異なるタンパク質合金溶液を落とし、眼鏡上のタンパク質合金膜を得るために、少なくとも12時間乾かし。 （これは、最初の厚さのタンパク質合金膜を得るために5重量％の合金溶液を濃縮することが示唆されている。）
    19. による疎水性-親水性相互作用、金属薄膜が付着したタンパク質合金膜をガラス表面から転送される51面 。鉗子を用いてガラス基板から薄い金属パターンを有するタンパク質合金膜をはがし。
    20. 不溶性タンパク質合金材料を得るためには、awの60°Cの真空オーブン（25 kPa）の中にドライフィルムを配置チャンバーの底部に試合開始ディッシュ。オーブン内の空気を汲み出し、そして少なくとも2時間、水蒸気アニールサンプルう。真空を解除し、鉗子を用いて基板から水不溶性フィルムをはがす。
    21. そのような電気抵抗のようなタンパク質合金膜上に金属パターンの電気的性質をテストし、ガラス上の元のパターンと比較します。
  4. プロテイン合金による医薬品原料の作製
    1. 、医薬化合物とのタンパク質合金膜を製造する工程3.2に記載のように第一のPDMS基板を作製した。蒸留水によって形成されたPDMS基板を清掃してください。
    2. 溶解または水溶液中に医薬化合物を分散させる。均一に水と医薬化合物を混合するために超音波または渦を使用してください。化合物が水溶性でない場合、イオンを含まない蒸留水に均一な分布を有する粉末を分散させる。
    3. 所望の質量比を計算する化合物溶液の化合物溶液のx重量パーセントの量：化合物溶液のタンパク質合金溶液のx重量パーセントの量（ここでは1重量％の合金溶液を用いた）によるタンパク質合金に対する化合物。タンパク質合金膜中の所望の化合物濃度を有するフィルムを得るために、比率を選択する。
    4. ゆっくりとセクション2のプロセス2.16で同じ指示に従ってタンパク質合金溶液と化合物溶液を混合する。 （注：ゲル化を回避するために、混合中に解決策をultrasonicateかボルテックスしないでください）​​。
    5. PDMS基板上に混合物の計算された体積を注ぎ、医薬化合物の設計された比率を含む得るタンパク質合金膜を化学フード中に少なくとも12時間乾燥する。
    6. 物理的には3.2節のプロセス3.2.8で同じ命令の次のフィルムを架橋する。低密度（LD）または高（HD）濃度の不溶性のモデル薬物との合金膜の一例を図4に見ることができる化学。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

（タンパク質Aおよびタンパク質Bとの間、例えば 、）は、典型的なタンパク質-タンパク質相互作用は、電荷-電荷（静電気）アトラクション、水素結合の形成、疎水性-親水性相互作用、ならびに特定の間の双極子、溶媒、対イオン、及びエントロピー効果を含めることができ2つのタンパク質のドメイン（ 図2）3。したがって、基本的に、私たちは、計算シミュレーションにより、これらの相互作用の効果を予測することができる。

figure-results-1
図タンパク質Aおよびタンパク質Bとの間の2相互作用は典型的には、これらの相互作用は、電荷-電荷（静電気）アトラクション、水素結合の形成、またはこれら2つのタンパク質の特定のドメインの間の疎水...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

「合金」は、タンパク質生産システムの中で最も重要な手順の一つは、ブレンドされた蛋白質の混和性を検証することである。それ以外の場合は、安定した波長可変特性なしのみ非混和性タンパク質混合物またはタンパク質複合システムである。実験的な熱分析法は、この目的のために使用することができ、それらの合金特性を確認するため。タンパク質-タンパク質相互作用は、フローリー·ハギンズの格子「溶媒」との間の相互作用としてモデル48（主要なタンパク質成分）および「溶質」（マイナーなタンパク質成分）に応じて見ることができる。このモデルに基づいて、「溶媒」と「溶質」との間の混合の間の自由エネルギー変化は、ブレンド48の混和性を支配する。一般的に、混和性の三つの異なる程度がある：（a）は完全に混和性（巨視的形態一相物質）、（b）は、準安定（フォームが半混和性材料中の相）、及び（c）の非混和性は、（個別のプロテインA及びBドメイン）3,48と元の2相のままである。これに対応して、二つのタンパク質系のガラス転移挙動はこれらの違いを実証することができ、理想的には相図のモデル（ 図6）を

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

利害関係が宣言されていない。

謝辞

著者らは、この研究をサポートするためローワン大学に感謝します。タフツ大学のXHも感謝デビッドL.カプランと前の技術的なトレーニングのためのNIH P41ティッシュ·エンジニアリングリソースセンター（TERC）。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Q100 示差走査熱量計 (DSC)TA Instruments, New Castle, DE, USA
N/Aソフトウェアで任意のタイプのDSCを使用して熱容量を計算することができます。
SS30T 真空スパッタリング装置 T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USAN/Aカスタムメイドの部品を使用して、任意のタイプのスパッタリングシステムをコーティングできます。
VWR 1415M 真空オーブンVWR インターナショナル、ブリッジポート、ニュージャージー州、米国N/A任意のタイプの真空オーブンを使用して、サンプルを物理的に架橋することができます。

参考文献

  1. Rosenbloom, J., et al. Extracellular matrix 4: The elastic fiber. FASEB J. 7, 1208-1218 (1993).
  2. Traub, W., et al. On the molecular structure of collagen. Nature. 221, 914-917 (1969).
  3. Hu, X., et al. Protein-Based Composite Materials. Materials Today. 15, 208-215 (2012).
  4. Hardy, J. G., Scheibel, T. R. Composite materials based on silk proteins. Progress in Polymer Science. 35, 1093-1115 (2010).
  5. Kidoaki, S., et al. Mesoscopic spatial designs of nano- and microfiber meshes for tissue-engineering matrix and scaffold based on newly devised multilayering and mixing electrospinning techniques. Biomaterials. 26, 37-46 (2005).
  6. Teng, W. B., et al. Recombinant silk-elastin like protein polymer displays elasticity comparable to elastin. Biomacromolecules. 10, 3028-3036 (2009).
  7. Foo, C. W. P., Kaplan, D. L. Genetic engineering of fibrous proteins, spider dragline, silk and collagen. Adv Drug Delivery Rev. 54, 1131-1143 (2002).
  8. Hu, X., et al. Charge-Tunable Autoclaved Silk-Tropoelastin Protein Alloys That Control Neuron Cell Responses. Adv. Funct. Mater. 23, 3875-3884 (2013).
  9. Hu, X., et al. Biomaterials derived from silk-tropoelastin protein systems. Biomaterials. 31, 8121-8131 (2010).
  10. Hu, X., et al. The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials. Biomaterials. 32, 8979-8989 (2011).
  11. Hu, X., et al. Biomaterials from ultrasonication-induced silk fibroin-hyaluronic acid hydrogels. Biomacromolecules. 11, 3178-3188 (2010).
  12. Gil, E. S., et al. Swelling behavior and morphological evolution of mixed gelatin/silk fibroin hydrogels. Biomacromolecules. 6, 3079-3087 (2005).
  13. Lu, Q., et al. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds. Macromol. Biosci. 10, 289-298 (2010).
  14. Lu, S., et al. Insoluble and flexible silk films containing glycerol. Biomacromolecules. 11, 143-150 (2010).
  15. Mandal, B. B., et al. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release. Biomaterials. 30, 2826-2836 (2009).
  16. Yeo, I. S., et al. Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds, preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponent nanofibrous structures. Biomacromolecules. 9, 1106-1116 (2008).
  17. Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat. Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
  18. Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New Opportunities for an Ancient Material. Science. 329, 528-531 (2010).
  19. Qin, G., et al. Mechanism of resilin elasticity. Nature Communications. 3, 1003(2012).
  20. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protocols. 6, 1612-1631 (2011).
  21. Wise, S. G., et al. Engineered tropoelastin and elastin-based biomaterials. Adv Protein Chem Struct Biol. 78, 1-24 (2009).
  22. Amsden, J. J., et al. Rapid nanoimprinting of silk fibroin films for biophotonic applications. Adv. Mater. 22, 1746-1749 (2010).
  23. Lawrence, B. D., et al. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
  24. Kim, D. H., et al. Dissolvable films of silk fibroin for ultrathin conformal bio-integrated electronics. Nat. Mater. 9, 511-517 (2010).
  25. Zhang, J., et al. Stabilization of vaccines and antibiotics in silk and eliminating the cold chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 11981-11986 (2012).
  26. Pritchard, E. M., et al. Effect of silk protein processing on drug delivery from silk films. Macromolecular Bioscience. 13, 311-320 (2013).
  27. Lammel, A. S., et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31, 4583-4591 (2010).
  28. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101, 11007-11028 (1997).
  29. Shao, Z., Vollrath, F. Materials: Surprising strength of silkworm silk. Nature. 418, 741-741 (2002).
  30. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424, 1057-1061 (2003).
  31. Hu, X., et al. Determining Beta-Sheet Crystallinity in Fibrous Proteins by Thermal Analysis and Infrared Spectroscopy. Macromolecules. 39, 6161-6170 (2006).
  32. Hu, X., et al. Dynamic Protein-Water Relationships during β-Sheet Formation. Macromolecules. 41, 3939-3948 (2008).
  33. Hu, X., et al. Microphase separation controlled beta-sheet crystallization kinetics in fibrous proteins. Macromolecules. 42, 2079-2087 (2009).
  34. Cebe, P., et al. Beating the Heat - Fast Scanning Melts Beta Sheet Crystals. Scientific Reports. 3, 1130(2013).
  35. Pyda, M., et al. Heat Capacity of Silk Fibroin Based on the Vibrational Motion of Poly(amino acid)s in the Presence and Absence of Water. Macromolecules. 41, 4786-4793 (2008).
  36. Buxton, G. A., et al. A lattice spring model of heterogeneous materials with plasticity. Model. Simul. Mater. Sci. Eng. 9, 485-497 (2001).
  37. Buxton, G. A., Balazs, A. C. Modeling the dynamic fracture of polymer blends processed under shear. Phys. Rev. B. 69, 054101(2004).
  38. Kolmakov, G. V., et al. Harnessing labile bonds between nanogel particles to create self-healing materials. ACS Nano. 3, 885-892 (2009).
  39. Duki, S. F., et al. Modeling the nanoscratching of self-healing materials. J. Chem. Phys. 134, 084901(2011).
  40. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  41. Bell, G. I., et al. Cell adhesion. Competition between nonspecific repulsion and specific bonding. Biophys. J. 45, 1051-1064 (1984).
  42. Wang, Q., et al. Effect of various dissolution systems on the molecular weight of regenerated silk fibroin. Biomacromolecules. 14, 285-289 (2013).
  43. Wray, L. S., et al. Effect of processing on silk-based biomaterials: reproducibility and biocompatibility. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 99, 89-101 (2011).
  44. Lawrence, B. D., et al. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646(2012).
  45. Hu, X., et al. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
  46. Yucel, T., et al. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophys J. 97, 2044-2050 (2009).
  47. Yucel, T., et al. Non-equilibrium silk fibroin adhesives. J Struct Biol. 170, 406-412 (2010).
  48. Flory, P. J. Principles of polymer chemistry. , Cornell University Press. Ithaca, N.Y.. (1953).
  49. Chen, H., et al. Thermal properties and phase transitions in blends of Nylon-6 with silk fibroin. J Therm Anal Calorim. 93, 201-206 (2008).
  50. Scabarozi, T. H., et al. Epitaxial growth and electrical-transport properties of Ti7Si2C5 thin films synthesized by reactive sputter deposition. Scripta Materialia. 65, 811-814 (2011).
  51. Tao, H., et al. Silk materials-a road to sustainable high technology. Adv Mater. 24, 2824-2837 (2012).
  52. Annabi, N., et al. Cross-linked open-pore elastic hydrogels based on tropoelastin, elastin and high pressure CO2. Biomaterials. 31, 1655-1665 (2010).
  53. Moll, R., et al. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol. 129, 705-733 (2008).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

シルクタンパク質ブレンド電子回路コーティングタンパク質溶液の再生薄膜作製熱分析光学材料電気材料医薬品材料タンパク質間相互作用
バイオメディカル応用のためのシルクシルクプロテイン合金材料設計
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。