方法論記事

マイクロ流体のPicoinjectionは金属電極がなければ削除します

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DOI：

10.3791/50913

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2014年4月18日

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, Unversity of California, San Francisco

この記事について

サマリー

我々は、金属電極を必要としないマイクロ流体滴をpicoinjectingする技術を開発した。このように、私たちの技術を取り入れたデバイスが作製し使用する方が簡単です。

要約

マイクロ流体液滴に試薬をpicoinjectingするための既存の方法は、マイクロ流体チップに統合された金属電極を必要とする。これらの電極の統合は、デバイス製造プロセスに面倒で間違いを起こしやすいステップを追加する。我々はpicoinjection中に金属電極のための必要性を不要にする技術を開発した。ほとんどの生物学的試薬が溶解し、電解質を含有し、導電性であるので、その代わりに、それは、電極として注入流体自体を使用する。電極を排除することによって、我々は、デバイス製造時間および複雑さを低減し、装置をより堅牢にする。また、我々のアプローチで、注入量はpicoinjection溶液に印加される電圧に依存する;これは、私たちは急速に印加される電圧を変調することにより、注入量を調整することができます。当社は、当社の技術は、緩衝液、酵素、および核酸を含む一般的な生物学的化合物を組み込んだ試薬と互換性があることを実証している。

概要

液滴ベースのマイクロ流体工学において、ミクロンスケールの水性液滴は、生物学的反応のための「試験管」として使用される。微細液滴で反応を行うことの利点は、各液滴が試薬のわずかpIを使用して、マイクロフルイディクスと、液滴が形成することができ、1キロヘルツ速度で処理することである。合わせた、これらの特性は、個々の細胞、核酸分子、または全材料のμlで分のうちに実行される化合物との反応の数百万を可能にする。

このようなアプリケーションのためのドロップを使用するには、技術が低下するための試薬の制御されたボリュームを追加するために必要とされる。このような動作は、試験管にピペッティングに類似している。これを達成するための一つの方法は、試薬の液滴が電場を印加することにより、ターゲットドロップとマージされるelectrocoalescenceある。電界は、液滴のインターフェイス上で界面活性剤分子の配列を乱す、IND薄膜の不安定性をucingと2以外の場合安定しているエマルジ ​​ョンで合体をトリガする。電気的に誘発されたマージはまたpicoinjector、これらは加圧されたチャネル3を通過して流れるように滴に試薬を注入する装置の設計に利用される。電界を印加する、picoinjectorデバイスは、金属電極を利用するが、液体ハンダワイヤを容易チャネル内の気泡や埃、ゴミ等により損なわれているように、マイクロ流体チップに金属電極の統合は、しばしば複雑でエラーが発生しやすいプロセスであるだけでなく、ストレスから骨折やデバイスのセットアップ中に曲げ。

ここでは、製造が簡単でよりロバストに、金属電極を使用することなくpicoinjectionを実行するための方法を提示する。ほとんどの生物学的試薬を溶解し、電解質が含まれており、導電性であるため、picoinjectionをトリガするために、我々はその代わりに、電極としての注射液そのものを使用しています。我々はまた、「ファラデーモアを追加ユニバーサルグランド（ 図1）のようなデバイスと行為の敏感な領域を遮蔽するt」は。堀は、電気的に、地面を提供し、意図しない液滴の合併を阻止することによりpicoinjection部位の上流の液滴を分離します。私たちの技術の付加的な利点がある液滴内に注入体積は、印加された信号を調整することによって調整することができるように、印加電圧の大きさに依存する。

我々はソフトのフォトリソグラフィ技術を4,5を使用してポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）で私たちのデバイスを製造する。我々のアプローチは樹脂、プラスチック、エポキシのような、他の材料で作製されたデバイスと互換性があります。チャンネルは、直径の小滴は50μm（65 PL）での作業に最適な30ミクロンの高さと幅を持っている。私たちは、0.50ミリメートルのメソッドの事項仕様と同様の生検パンチを持つデバイスの製造時に作成されたポートに挿入polyetheleneチューブ（0.3/1.09 mmの外/内径）を介して試薬を導入以前に5アイベッド。注入流体の正確な構成は特定の用途に依存する。流体はpicoinjectorに送信する電気信号のための十分な導電性をもたらすのに十分に高い濃度で溶解した電解質を含有するだけでよい。ベンチテストでは、この値は、流体の導電率は、特定のデバイス寸法および印加電圧の大きさに依存するのに10 mMよりも大きいイオン濃度は、6十分であることを見出した。

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プロトコル

1。実験に基づく設計デバイスの寸法およびトポロジは、コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して、ニーズ

注：球形の小滴よりも小さいセレクトエマルジョンチャネル直径。これは円筒形または「ソーセージ」形に液滴を強制し、より効果的なpicoinjectionが可能になります。我々の目的のために、我々は、直径が50ミクロンだった滴のための30×30μmのチャンネルを設計しました。

  1. モデルpicoinjection部位（単数または複数）が不要であるように、金属電極のためのチャネルは、除去されることを除いて和らげるら 3に記載されたものの後。
  2. ファラデーモートpicoinjectionサイト（S）と、彼らは、電界からの液滴をシールドするように、上流のエマルジ ​​ョンの間で実行します（ 図1）として機能するようにチャネルを追加。
    注意：これは、意図しないマージを防ぐことができます。

ソフトPhotolithを使用する2。製造装置ographicテクニック

  1. 既存の商用サービスを使用して、CADファイルに基づいて透明性のフォトリソグラフィ·マスクを生成します。
  2. 4以前に説明したようにフォトマスクを用いて、装置のマスターを製造するためにシリコンウェハ上にフォトレジストを硬化させる。
  3. PDMSは5cmのポリスチレンシャーレに含まれるデバイスのマスター上で硬化剤（11時01比）と混合注ぐ。
  4. 任意の気泡を除去するために約15分間、真空デシケーター中でPDMSとマスターを配置します。
  5. 1時間95℃のオーブン中に置くことによってPDMSデバイスを硬化させる。代わりに、PDMSは、24時間後に室温で硬化する。
  6. 外科用ブレードを用いて周囲の周りに切断し、慎重にマスターからデバイスを剥離することにより、デバイスを取り外します。
  7. 入口パンチと0.5ミリメートル生検パンチを使用して、PDMSに穴を差し込みます。
  8. プラズマボンダー4を用いてガラス顕微鏡スライドにデバイスを結合する。

3。空気圧を準備制御ポンプが流体を含む貯水池を加圧する

  1. 2.7ミリメートル、内径のポリエチレンチューブの長さによって、このような加圧された空気は終了し、そのポンプ出力を変更します。
  2. そのようなチューブはルアーロックの背面に乳首の上に内腔を嵌合することにより、ルアーロック注射器の先端で終了することを構築します。
  3. ルアーロックねじとエポキシとチューブの間の空間を充填して密封する。
  4. 27.5gの針を取り付けます。

4。準備水性単分散乳剤（油中水型）は、生体適合性界面活性剤7を溶存（重量/重量）の2％不活性フッ素化分散油に懸濁液滴

これらの液滴に含まれる特定の試薬は、用途に依存

  1. 再注入の準備のために、27.5gの針を1ミリリットルの注射器にエマルションをロードします。
  2. シリンジポンプにシリンジを固定し、（針上方向）に垂直ポンプを向けます。
    ノートこの方向は、液滴がキャリアオイルの上層にパックするようになります。ポンプが開始されると、液滴はその下油層によって高い体積分率でシリンジから押し出される。

5。マイクロ流体チップの紹介のための試薬を準備

  1. 生検パンチ、針、またはドリルを使用して（スクリューキャップを持つコンテナが十分であろう）15ミリリットル遠心管のキャップ内に3 0.5ミリメートルの穴をパンチ。
  2. それらは、チューブの底に達するように2つの穴を通って直径0.5mmのワイヤ電極とPE-2のチューブ〜20センチの長さを挿入する。
  3. 残りの穴に、それは液面の上に載るように、PE管の約20センチの長さの〜2.5センチメートルを通します。
  4. UV硬化エポキシでキャップの上のすき間をシール。
  5. キャップ上picoinjection液、ネジでチューブを埋める。
  6. インサートによってチューブの短い長さの空圧制御ポンプからの出力を接続する内腔に針をING。針がぴったりと収まる必要があります。
  7. ファラデー堀として機能するように、1M NaClで1ミリリットルの注射器を埋める。
  8. 27.5gの針を接続し、シリンジポンプにシリンジを固定します。
  9. キャリア/スペーサーオイルと他の1ミリリットルの注射器を埋める27.5 G針を接続し、シリンジポンプに固定します。

6。Picoinjectionためのマイクロ流体デバイスを準備します

  1. マイクロ流体チップ上picoinjection流体の入口ポートに注入流体容器から出力管（より長い長さ）を接続する。
  2. PEの管の長さを持つマイクロ流体チップ上のファラデーモートのための入口に1 M NaClを含む注射器を接続します。
  3. PEの管の長さのマイクロ流体チップの入口ポートにキャリアオイルを含む注射器を接続します。
  4. マイクロ流体チップ上のエマルジョン出口ポートへのPEチューブを挿入します。チューブはエマルジョン収集容器で終端、またべきであるマリー1.5ミリリットル遠心管。
  5. マイクロ流体チップ上でファラデーモートための出口ポートに、PEチューブを挿入します。チューブは、短絡を防止するために、非導電性と電気的に絶縁された容器内に終端する必要がある。
  6. picoinjection液に沈めた金属電極にワニ口クリップを介して高電圧（HV）アンプの出力を接続します。
  7. 1 M NaClを含む注射針の金属にワニ口クリップを経由して、HVアンプの接地電極に接続します。

マイクロ流体チップへ7。インフューズ試薬

  1. 100の割合でデバイスに1MのNaCl（ファラデー堀）を導入 μL/時。
  2. デバイスの寸法に適した速度で液滴エマルジョンとキャリアオイルをご紹介します。私たちのデモデバイスのために、我々は、それぞれ低下し、油200、および400μL/時をご紹介します。流速は、液滴が分離し、定期的にpicoinjectorを通過させるべきであるキャリアオイルのギャップによる。
  3. picoinjectionオリフィスでの流体の圧力は、液滴チャネルとの機械的な平衡状態にあるようにpicoinjection流体に加えられる圧力を調整する。
    注意：この圧力（ラプラス圧）、注射液はオフ出芽と（ 図2）は 、独自の滴を形成することなく、液滴チャネルに膨らむはずです。上述したこれらの流量で、我々は注射部位に平衡を達成するために、注入流体へ〜13 psiの圧力を適用する。

8。 Picoinjectionを開始

  1. 液滴が噴射オリフィスを通過すると、0〜10 V、10 kHzの適用、AC信号がHV-アンプ（ 図3）で1,000倍に増幅した。
  2. 印加電圧の振幅を変化させることにより、注入量を調節する。
    注意：より高い電圧が滴に導入する複数の流体のために許可する必要があります。今回のテストでは、電圧で安定的かつ一貫性の注入を観察することトゥイーン100および3,000 V、10〜500 mMの（ 図4）の範囲のNaCl注射溶液を用いて。

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結果

顕微鏡画像はpicoinjection流体の電化は、注射（ 図2）をトリガするのに十分であることをpicoinjectionサイトショーで撮影。注入量は、より高い注入量を可能にするより高い電圧が、印加電圧の振幅を変調することによって制御することができる。我々は、（ 図3）内の注入流体の3つの代表的なモル濃度のために印加される電圧の大きさに対して注入体積をプロットする。速度の手法を実証するために、我々は、選択的に蛍光染料（ 映画1）の存在または不在に依存して、注射部位を通過する液滴を注入した。 10kHzのできるだけ高いレートは、液滴検出機構3の機能に応じて、可能であるものの滴が、200 Hzでインジェクタを通過する。

我々は、液滴が接近しpicoinjectを通過するという事実のため、印加電圧に対する注入量の依存属性イオンオリフィスは、注射部位にバルジから液滴界面油分離層の厚さは8を減少させる。電気的に誘導された薄膜の不安定性の閾値電圧が...

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ディスカッション

注入量と印加電圧との関係は、彼らが通過するインジェクタデバイスの寸法、picoinjection流体装置、モル濃度にpicoinjection流体を運ぶチューブの長さ、液滴の速度を含む多くの要因に依存する。このような理由のために我々は、ボリューム/電圧関係は、電圧およびモル濃度の作業範囲の縁で注入量を測定することにより、picoinjectionの各実行の前に特徴づけられることをお勧めします。さらに、より高い電圧及び注入液モル濃度ではpicoinjection流体がもはや注入口で平衡状態に保持される現象を観察するのではなく、オフ芽及び流路内の小滴を形成する。水相は部分的に疎水性のチャネルを濡らし、請求我々はそれがオリフィスから、流路11内にクロールさせる、エレクトロウェッティングするこの動作を属性。この不安定性は、希望する前に発生した場合注入量が達成され、これらは注入器を通過して噴射時間を増加させるために液滴流路を狭めるように液滴流量を減らすことを検討してください。

著しくデバイスの製作の合理化に加えて、この技術は、より複雑なコンビナトリアル反応計画の実行を単...

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開示事項

我々は完全に我々の実験で観察された印加電圧と注入量との関係の背後にある正確な物理的メカニズムを理解していない。ラボの関心と専門知識の関連分野は、この長引く疑問を追求するのに適していません。我々は、この現象を探求するより、物理学や工学洞察力を持つものをお勧めします。

謝辞

この作品は、定量的な生命科学のカリフォルニア大学（QB3）、UCSFの生物工学および治療科学省によってサポートされており、ロジャースファミリー財団からのギャップ賞を埋めるた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mL Luer-Lok™ シリンジBD Medical309628
LocTite UV硬化接着剤Henkel35241
PE-2 チューブ科学商品BB31695-PE/2
Novec HFE-75003M98-0212-2928-5
NaClSigma AldrichS9888
1.5 ml 遠心分離管エッペンドルフ22363531
BD Falcon 15 ml チューブBD Biosciences 352097
空気圧制御ポンプControl Air Inc.DAQと制御ソフトウェアの制御下にあるものをお勧めします
シリンジポンプNew Era1mlのシリンジを保持し、100 μという低い速度で流れることができなければなりません。l/hr
HVアンプルフィア0.01 Vから10 Vまでの信号の1,000倍増幅が可能であること
プラズマボンダー/クリーナーハリックプラズマ
3インチシリコンウェーハシグマアルドリッチ647535
PDMSダウコーニングシルガード184硬化剤付き
SU-8フォトレジストMicroChemを含める必要があります粘度はデバイスの寸法に依存

参考文献

  1. Kritikou, E. It's cheaper in the Picolab. Nat. Rev. Genet. 6 (9), (2005).
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