その時 液体中の生物学的集合体のTEM

サマリー

ここでは、透過型電子顕微鏡を用いて、ナノメートル分解能でウイルス複合体を画像化する手順について説明する。

要約

研究者は定期的に透過電子顕微鏡(TEM)を使用して生物学的実体を調べ、新しい材料を評価します。ここでは、液体環境でのウイルスアセンブリの表示- これらの機器のための追加のアプリケーションを説明します。この新しい生物学的構造の可視化手法は、最近開発されたマイクロ流体ベースの検体ホルダーを利用しています。ビデオ記事では、TEM内の液体標本を画像化するためにマイクロ流体ホルダーを組み立てて使用する方法を示しています。特に、モデルシステムとしては、シミアンロタウイルスの二重層粒子(DMP)を用います。また、DDLPsを視受窓につなげたアフィニティバイオフィルムで液体チャンバーの表面をコーティングする手順についても説明する。これにより、3D構造の決定に適した方法でアセンブリをイメージすることができます。このように、我々は、天然の液体環境における亜ウイルス粒子の最初の一見を提示する。

概要

生物学者や技術者の共通の目標は、分子機械の内部の仕組みを理解することです。透過型電子顕微鏡(TEM)は、原子に近い分解能^1~2でこれらの複雑な細部を可視化するのに理想的な装置です。TEMの高真空システムを維持するために、生体試料は、典型的には、ビトレウス氷³の薄膜に埋め込まれ、糖^4、重金属塩^5、またはそれらの組み合わせ6が挙^げられる。その結果、埋め込み標本の画像は、動的プロセスの限られたスナップショットのみを明らかにすることができる。

環境液体室で水和した生物学的標本を維持する初期の試みは、パーソンズと同僚が差動ポンプステージを使用して行った。未染色カタラーゼ結晶の電子回折パターンは、水和状態で3Åの分解能に記録された^7-8.さらに、相分離脂質ドメインは、ヒト赤血球^9〜10の水和膜で調べることができた。しかし、液体の拡散や電子線との干渉による運動は、重度の分解能損失をもたらし、生物学的標本を用いたさらなる実験は最近まで試みられなかった。

半導体マイクロチップを利用してマイクロスケール環境室を形成する新開発のマイクロ流体試料ホルダーが導入されました。これらのデバイスは、TEM 列^{11 から 12}に配置されている間、サンプルを液体に保持できます。TEMイメージングにおけるこの技術的ブレークスルーにより、研究者は分子レベル¹³で初めて進行性のイベントを見ることを可能にしました。この新しいモダリティを「その時点での 分子顕微鏡」と呼び、EMカラム^14-15の「内部」で実験を行うことができるようになりました。この方法の全体的な目的は、ナノメートル解像度でのそれらの動的挙動を観察するために液体中の生物学的アセンブリを画像化することです。開発された技術の背後にある根拠は、リアルタイムの観測を記録し、溶液中の生物学的機械の新しい特性を調べることです。この方法論は、細胞生物学および分子生物学におけるより広範な目的のためのTEMの使用を拡大^{する 12-16}.

現在のビデオ記事では、市販のマイクロ流体標本ホルダーを組み立て、使用するための包括的なプロトコルを紹介しています。これらの専門のホルダーは、溶液の微細なボリュームを囲む液体チャンバーを形成するために、統合されたスペーサーで製造されたシリコン窒化マイクロチップを利用します。薄く透明な窓は、撮像目的のためにマイクロチップにエッチングされる^12。TEMを用いて、マイクロ流体ホルダーを用いて、液体中のシミアンロタウイルス二重層粒子(DRP)を調べるのが適切な方法を示す。DMPなどの生物学的アセンブリがイメージング中に遠距離で急速に拡散しないようにするために、我々は、それらをマイクロ流体室¹⁶の表面にテザーするためにアフィニティキャプチャアプローチを採用する。この分子捕獲ステップは下流の処理ルーチンに使用されるイメージの獲得を可能にするので液体の生物学的標本をイメージするための 代替技術より大きな利点 がある。マイクロ流体イメージングと組み合わせて使用されるこのキャプチャステップは、当社の手順¹⁷に固有です。TEMまたはマイクロ流体イメージングチャンバを使用して構造生物学アプリケーションを採用している読者は、分子レベルでの動的観測が最終目標である場合、アフィニティーキャプチャ技術の使用を検討することができます。

プロトコル

1. アフィニティ キャプチャ デバイスの準備¹⁶

1. 窒化ケイ素Eチップを15mlのアセトンで2分間インキュベートし、2分間15mlのメタノールを2分間洗浄します(図1A)。薄層の空気流の下でチップを乾燥させます。
2. 乾燥したチップを加熱した攪拌板に150°Cで1.5時間インキュベートし、使用前に室温まで冷却します。
3. ハミルトン注射器を使用して、小さなガラス管の脂質混合物を構成して25%クロロホルムを含み、 55%DLPC(1,2-ジロイル・ホスホコリン)クロロホルム(1mg/ml)および20%Ni-NTA脂質(1,2-ジオレオロイルイミノ酢酸-サクシニルニッケル塩)をクロロホルム(1mg/ml)で合計体積40μlとした。
4. 湿度の高いペトリ皿のパラフィルムに、15μlのミリ-Q水の各15μl滴の混合物のアリコートを適用する(図1B)。氷上でサンプルを少なくとも60分間インキュベートします。

2. 高分子の捕獲¹⁷

1. 150 nm の統合スペーサを備えた E チップを単層サンプルの上に置き、1 分間インキュベートします (図 1C)。
2. サンプルからチップをそっと持ち上げ、His タグ付きプロテインA.インキュベートの3 μl アリコートを室温で 1 分間インキュベートします (図 1D)。
3. Whatman#1ろ紙を使用して余分な滴を消し去り、すぐに抗体溶液の3μlアリコートを加えます。室温で1分間インキュベートします。
4. ハミルトンシリンジを使用して余分な溶液を除去し、50 mM HEPES(pH 7.5)、150 mM NaCl、10 mM MgCl₂および10 mM CaCl₂を含む緩衝溶液に1μlのロタウイルスDLP(0.1mg/ml)のアリコートをすぐに加える。室温で少なくとも2分間インキュベートする。DMP の準備については、前に¹⁸を説明しました。

3. マイクロ流体室を組み立て、イン ・ザ・イン ・シーク・フィエサー

1. ウイルスサンプルを含むウェットEチップをマイクロ流体試料ホルダーの先端にロードします。2番目のフラットEチップを1分間グロー放電し、スペーサーチップの上に積み込みます(図2、 パネル1-5)。
2. あるいは、生体高分子のコントラストを高めるために、重金属染色(例えば0.2%ウラニルシフィジ)を、湿った試料に第2のEチップを置く前に湿った標本に加えることができる。しかし、試料を含むEチップは、造影試薬を添加する前にミリQ水で洗浄する必要があります。
3. アセンブリ全体を挟み合わせて密閉されたエンクロージャを形成し、3本の真鍮ネジでホルダー内に機械的に保持します(図2、パネル6-8)。
4. アセンブリに続いて、ホルダーの先端は、TEMの内側にホルダーを配置する前に、ターボポンプドライポンプ場を使用して^10-6 Torrにポンプで送られます。

4. 透過型電子顕微鏡を用いた液体中のイメージング

1. LaB₆フィラメントを搭載し、120kVで動作する透過型電子顕微鏡(FEI社)にインザッチの標本ホルダーをロードします。
2. TEMフィラメントをオンにし、ウォブラー機能を使用して、カラム内のサンプルを前後に-15°から+15°まで傾けることで、標本に対して顕微鏡ステージのユーセントリックな高さを調整します。この手順は、液体チャンバの適切な厚さを考慮するために、Z方向のステージを調整します。このステップはまた、正確な倍率が画像を記録するときに使用されることを保証します。
3. 最初に、エッジに沿って、マイクロ流体室の隅の領域に画像を記録します。通常、これらの領域には最も薄いソリューションが含まれます。CCDカメラを用いて低線量条件(1-3電子^/Å2)の下での検体の画像を記録します。6,000X ~ 30,000X の公称倍率を使用します。
4. 流体チャンバの端に焦点を合わせ、適切な焦点脱焦点値を決定します。30,000X倍率で画像を記録するには、-1.5 μmの値を使用します。厚い溶液が発生した場合、または造影剤が試料調製に使用されていない場合は、-2〜-4 μmの範囲でより高い脱焦点値を使用してください。
5. 実験中にマイクロ流体室に溶液が含まれていることを確認するには、デバイス内の液体に気泡が形成されるまで電子線を焦点を合わせます。

結果

グロー放電されたEチップを用いた液体中のDMPの代表的な画像(図3A)は、アフィニティキャプチャデバイスで富化されたDMPと比較して、拡散によるものと考えられる特定の視聴領域におけるDMPの数が少なくなっています(図3B)。イメージングチャンバにウラニルのフォーマットを加えて、試料のコントラストが高まり、溶液中の個々のDMPの視認性が高まります(図3C、トップパネル)。より良いコントラストは、粒子平均化(図3C、ボトムパネル)や3D再構成ルーチン(図3C、インセット)などのダウンストリーム画像処理を、前述の¹⁷のように可能にする。簡単に言えば、3D再構成のために、SPIDERソフトウェアパッケージ¹⁹を用いて600個のDMP粒子を選択しました。選択粒子を、80Å分解能に濾過したロタウイルス^DLP20の初期モデルに対して精製した。RELIONソフトウェアパッケージ²¹を用い、約25Åの...

ディスカッション

今回の研究では、テザーロタウイルスDMPに対するアフィニティキャプチャアプローチをマイクロ流体プラットフォームに採用しました。これは、液体微小環境における高分子複合体の画像化をその 場 で可能にした。キャプチャアプローチは、生物学的標本をイメージングウィンドウに局地化して、液体中の画像を記録している間に発生する大きな拡散性の問題を否定するため、 他のマイクロ流体イメージング技術に関して重要です 。しかし、 我々のプロトコルにおける最も重要なステップ の1つは、マイクロチップ表面への脂質バイオフィルムの移動を含む。脂質単層がグリッド上に均等に広がることができない場合、これは欠陥のある実験をもたらすでしょう。不十分な転送ステップの兆候は、ウイルスアセンブリがほとんどまたはまったく流体チップに結合されることです。転写工程における制限は、脂質層の流動性に関する熱安定性である。転写工程が不十分な場合、落下の不均一な広がりによって評価されるように、脂質層は氷上または振動のない冷たい部屋でインキュベートする必要があります。また、ペトリ皿は適切な湿度を維持するためにパラフ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Eチップ、スペーサーチップ	プロトチップス	EPB-52TBD	400 μメートル×50 μm window
E-chip, top chip	Protochips, Inc. (英語)	EPT-45W	400 Μメートル×50 μm window
Ni-NTA脂質	Avanti Polar Lipids	790404P	粉末形態
DLPC (12:0) 脂質	Avanti Polar Lipids	850335P	粉末形態
容積フラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	20-812A; 20-812C	1 ml; 5 ml
ハミルトンシリンジハ	ミルトン株式会社	80300、80400	1-10 μl;1-25 Μl
Whatman #1 濾紙	Whatman	1001 090	100 個、90 mm
ガラス ペトリ皿	コーニング	70165-101	100 mm x 15 mm
ガラス パスツールピペット	VWR	14673-010	14673-010
ガラス培養管	VWR	47729-566	6 mm x 50 mm
アセトン	フィッシャー サイエンティフィック	A11-1	1 L
メタノール	フィッシャーサイエンティフィック	A412-1	1 L
クロロホルム	電子顕微鏡科学	12550	100 ml
Hisタグ付きプロテインA	アブカム社	ab52953	10 mg
ミリQウォーターシステム	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	超純水
HEPES	フィッシャーサイエンティフィ	BP310-500	500g
装置
ポセイドン In situ 試料ホルダー	Protochips, Inc.		FEI対応
FEI Spirit BioTwin TEM	FEI Co.		120 kV
Eagle 2k HS CCDカメラ	FEI Co.		10 Å/pixel 30,000X
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		ポンプホルダー先端 10-6 range
PELCO easiGlow, グロー放電ユニット	Ted Pella, Inc.		負極性モード
Isotemp 加熱攪拌板	Fisher Scientific		Heat to 150 ºCで1.5時間

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