新生児脳損傷後の作業とリファレンス記憶を評価〜8アーム放射状水迷路の使用

サマリー

8アームの放射状水迷路は、被験者が脱出プラットフォームを見つけるために迷路外の手がかりを使用することを要求し、陸上の放射状アーム迷路の設計で観察された制限を改善することにより、参照と作業記憶のパフォーマンスを同時に評価するように設計されています。

要約

ワーキングと参照メモリは、一般的に陸上放射状迷路を用いて評価している。しかし、このパラダイムはpretraining、絶食を必要とし、香りキュー交絡を導入することができる。 8アーム放射状水迷路は、エスケープ·プラットフォームおよび救済陸上放射状迷路のデザインで観測限界を見つけるために、余分な迷路の手がかりを使用するように被験者を必要とすることによって、同時に参照し、ワーキングメモリの性能を評価するために設計されています。具体的には、被験者は各試験日の間に、以前のエスケープに使用武器（ワーキングメモリ）を避けるだけでなく、エスケープ·プラットフォーム（参照メモリ）を含有したことがない固定アームを避けるために必要とされる。再エントリが既に試験セッション中に脱出するために使用されている（したがって逃避台が除去された）及び再エントリの参照メモリにアームにアームが作動記憶障害の指標である。あるいは、参照メモリアームへの最初のエントリは、基準memorの指標であるY赤字。我々は、低酸素性虚血の誘導後の新生児の脳損傷および偽コントロールとラットのパフォーマンスを比較して、試験の11日後の作業と参照メモリの両方が大幅に赤字を表示するには、この迷路を使用していました。このプロトコルは、簡単に障害を学習する多くの他のモデルを検討するように変更することができた。

概要

ワーキングメモリ(WM)は、目標指向行動¹中のオブジェクトまたは場所の表現に必要な重要な認知領域に対応します。あるいは、これらのオブジェクトや場所を時間的に安定して表現するためには、参照メモリ(RM)が必要です。作業記憶と参照記憶は、陸上の放射状腕迷路パラダイム^2,3を使用してげっ歯類で長い間評価されてきました。ただし、ラットは自発的に迷路を走る素因がないため、これらのタスクには事前のトレーニングが必要になることがよくあります。これにより、実験の完了に必要な時間が大幅に増加し、時間的制約のある縦方向の設計に支障をきたす可能性があります。陸上の8アーム迷路のその他の制限には、食物の剥奪の要件や、各試行後に迷路に残される匂いの手がかりの変化を制御することの難しさが含まれます。これらの制限の多くは、モリス水迷路パラダイム⁴を使用することで克服されましたが、歴史的には、これらの設計は参照記憶と空間学習のテストに限定されていました(例外^5〜9)。8アーム放射状水迷路は、ラットとマウス^5-7の参照記憶と作業記憶の両方を評価するために使用されてきた8アーム放射状陸路の修正版です。従来の陸上迷路とは対照的に、8アームの放射状水迷路は、食物の剥奪を必要とせず、潜在的な混乱する匂いの手がかりを最小限に抑え、被験者の脱出の動機を、事前トレーニングを必要とせずに、作業と参照学習と記憶を同時に評価する効果的な手段として利用します^5-7。

このパラダイムの1つのアプリケーションは、新生児の脳損傷後のワーキングメモリの欠損をテストすることです。ヒトでの研究によると、脳損傷のリスクがある早産児は、後年でワーキングメモリの欠損を示すことが示されています^10,11。新生児の脳損傷は、出生後の発達の早い段階で低酸素/虚血(HI)を誘発することにより、げっ歯類でモデル化できます^12-15。さらに重要なことに、リスクのある乳児に見られる空間学習とワーキングメモリの欠損は、橈骨腕水迷路を使用したげっ歯類で並行しており、このような障害の研究のための堅牢なモデルとなっています^8,9。また、8アームの放射状水迷路は、参照メモリとワーキングメモリの同時定量化を可能にし、時間的制約のあるモデル(すなわち、離散的な発達未亡人)における脳損傷者と非負傷者の比較や、カウンターバランスのとれた縦方向のデザインに最適です。

このプロトコルでは、8アームの放射状水迷路(図1を参照)を使用したテスト手順と、新生児の低酸素性虚血性損傷の有無にかかわらずラットのサンプルデータについて説明します。低酸素性虚血 (HI) は、右総頸動脈の焼灼と 120 分間の 8% 酸素曝露後、出生後 7 日目に誘発されました。この外科的処置は、未熟児および新生児脳損傷の病理をモデル化するために広く使用されています(詳細については^{、12,13,16,17}を参照)。ラジアルアームウォーター迷路パラダイムは、新生児HI損傷後の参照記憶と作業記憶能力の欠損を明らかにすることを示します。現在のプロトコルでは、参照メモリは、8 アームの放射状水迷路の 4 つの特定のアームを使用して評価され、テスト全体を通じて追加の迷路の手がかりに対して一定に保たれます。これらのアームにはエスケーププラットフォームが含まれていないため、これらのアームへの被験者のエントリは、参照記憶のパフォーマンスの低下と長期学習の欠陥を反映しています。残りの4つのアームには、一日の初めにすべて脱出プラットフォームが含まれていますが、動物がアームにうまく入り、水から脱出すると、各プラットフォームは取り外されます^5-7。そのためには、動物は4回の連続した試行でどの腕に入ったかを覚えておく必要があり、追加のプラットフォームが取り外されるたびにワーキングメモリの必要量が増加します。作業記憶は、同じテスト日内に以前に脱出に使用されたアームへの再エントリ、または参照メモリアームへの再エントリを調べることによって評価されます。さらに、この設計では、海馬に依存する空間学習を反映した脱出プラットフォームを特定するために、迷路外の手がかりを利用しています。ワーキングメモリエラーと参照メモリエラーを評価するためのこの方法は、もともとJarrardらによって使用されました。¹⁸ それ以来、老化関連の神経障害、学習障害、およびホルモン操作^5,6,7,19,20に続くげっ歯類モデルを評価するために広く使用されています。

このパラダイムの主な目的は、参照記憶と作業記憶を評価することです。したがって、8アームの放射状水迷路の設計は、発達性脳損傷による欠損のテストに限定されるべきではありません。それどころか、このパラダイムを用いた先行研究では、多くの実験的文脈^{5,6,7,18,19,20}において、学習と記憶の病理を評価するために、さまざまなげっ歯類モデルを評価できることが示されている。

プロトコル

すべての手順は、ロードアイランド大学の施設内動物管理および使用委員会によって承認され、実験動物の世話と使用に関する国立衛生研究所のガイドに準拠しています。

1. 迷路の設定

1. 迷路の周りに、明確で静的な、目立つ迷路外の手がかり(塗装された形状、家具、またはその他の静止した部屋の特徴)を配置します.
   注: 迷路以外の手がかりは、実験期間中、同じ場所に留まる必要があります。
2. ラジアルアーム迷路のハブとアームをプラスチック製の浴槽に置きます(例:ample:機器テーブル).
   注:このプロトコルで使用される迷路は、黒く塗装された円形のステンレス鋼のベースに取り付けられた8つの中央サポートに取り付けられた8つの取り外し可能なステンレス鋼のアームで構成されています(図と対応する寸法については図1を参照してください)。図 1 に示すプラスチック製の浴槽の内径は 122 cm、高さは 60 cm です。
3. 室温(22-26°C)に温めた水で浴槽を満たします7。
4. 8本のアームのうち4本の両端に、水面から1cm下のプラットフォームを置きます
   注1:各被験者について、プラットフォームの位置はテスト期間中固定されています。構成に関係なく、プラットフォームが 2 つ以上の隣接するアームに配置されないように注意する必要があります (隣接するアームに 2 つ以下のプラットフォームを配置する必要があります)。スタートアームにプラットフォームを置かないでください.
   注2:隠されたプラットフォームは、迷路の背景に溶け込むために、迷路インサートと同じ色に塗装する必要があります。

2. テスト用の被験者の転送

1. 指定された検査順序を維持して、被験者をビバリウムから検査室に移します.
   注:動物は不透明なケージに入れて、予期ストレスを軽減し、試験室の合図が見えないようにする必要があります。
2. テストルームに入ったら、グループ1のすべての不透明なケージをステージングベンチまたはテーブルに置き、テストの順序を維持します。
   注:大規模な研究(例:30人の被験者)では、被験者をテストグループ(例:10人の被験者からなる3つのグループ)に分割するのが最善かもしれません。これは、試験室の規模と被験者の輸送の実現可能性によって異なります。

3. 迷路の腕のエントリを記録するためのデジタルタブレットプロトコル

1. デジタルタブレットでPDFライタープログラムを開きます。
2. グループ1.
   の被験者のすべての事前保存されたデータ記録テンプレートをインポートします 注:各録画テンプレートは、事前に保存して、特定の被験者と試験番号(例:被験者1_trial 1、被験者1_trial 2など)でラベル付けし、各被験者(試験1〜4)に合計4つのテンプレートを付ける必要があります。テンプレートには、迷路とプラットフォームの場所を空白で表現し、被験者番号、トライアル番号、テスト日、使用した脱出プラットフォーム、トライアルのレイテンシを記録する場所を含める必要があります (図 2 を参照)。
3. 最初の被験者の最初の試行のテンプレートを開きます。
   注:このシステムは、タブレットやタブレットベースのノート作成プログラムにアクセスできない研究者向けの紙テンプレートでも使用できます。

4. ラジアルアーム水迷路試験

1. 動物がペアで飼育されている場合は、テストセッションの前に被験者を分離してください。最初の被験者を別の不透明な加温ケージに移します。
   注:ケージは、テストの合間に体温を維持するために、加熱パッドを使用して37°Cに温める必要があります。
2. 各被験者の最初の試行に先立ち、被験者の識別番号がデータ記録シートの被験者番号と一致することを確認し、プラットフォームが8アームの水迷路に正しく配置されていることを確認してください。
3. 迷路の壁に面したスタートアームに被写体を置き、タイマーを開始します.
   注:このプロトコルは、データを記録する実験者と被験者を扱う実験者の2人のために設計されました。このコラボレーションでは、実験者間のコミュニケーションが最も重要です。各試験の前に、開始時間、被験者番号、および適切なプラットフォームの配置を確認することが不可欠です。
4. 各試行中は、キューの一貫性を維持するために、部屋の指定された位置で静止したままでください。
   注:実験中に目立たないように注意する必要があります(例:香水)そして実験者は、キューの一貫性を維持するために毎日同じ衣服(白衣)を着用する必要があります。
5. デジタルタブレットの記録テンプレートで対応するアームにマークを付けて、各エントリをアームに記録します。
   注:エントリーは、被験者の肩が腕の開口部を壊したときに発生します。
6. 被験者が4つのプラットフォームのいずれかを見つけるのに最大120秒かかります。動物がプラットフォームに到達したら、タイマーを停止し、トライアルは完了です。
   注:一貫性を保つために、被験者は前足がプラットフォーム上にあるときにターゲットに到達したと言われます。
7. 被験者が120秒以内にプラットフォームを見つけることができない場合は、動物を最も近いプラットフォームに注意深く誘導し、移動する前にプラットフォームに10秒間留まることを許可して、動物がターゲットの位置を認識していることを確認します。
8. 1日目のみ、被験者が空間的な手がかりを参照できるように、4つの試行すべての後に被験者を10秒間プラットフォームに座らせます。
9. 試用が完了したら、被験者を体でそっと持ち上げてプラットフォームから取り外します。
10. 90 秒のインタートライアルインターバルのタイマーを開始します。
11. 被験者を体温調節パッドの上の個々のケージに戻します。
12. データ記録テンプレート上の対応する位置を一周して、脱出に使用された特定のプラットフォームを記録します。
13. この間、前の試験で被験者が使用した脱出プラットフォームを取り外します。
14. 次の試行のテンプレートを開き、被験者が脱出に使用したすべてのプラットフォームを、以前の試行中に削除されたX.
    でマークします 注:後続の試行の前に、欠落しているすべてのプラットフォームをマークすることは、エラータイプ(参照メモリや作業メモリの正しいなど)を定義するために重要です。
15. その後の試験を開始する前に、被験者番号、試験番号、および残りのプラットフォームの位置を確認してください。
16. 90秒の試行間隔が経過したら、被験者を迷路の壁に面した開始アームに置き、次の試行のタイマーを開始します。
17. 試行2〜4についてこのプロセスを繰り返し、各試行後に到達した脱出プラットフォームを削除し、各試行中および各試行後にテンプレートを適切にマークします(つまり、取り外したプラットフォームの上にXを配置し、入力されたアームを示し、脱出に使用されたプラットフォームを円で囲みます)。
18. 被験者の4回の試行がすべて完了したら、脱出プラットフォームを迷路の適切なアームに戻し、次の被験者のテストプロセスを繰り返します(テスト手順4.1-4.17)。
19. グループ1のテストが完了したら、データ記録シートをそのテスト日(例:Day 1)のフォルダにエクスポートし、ファイルストレージシステムに保存します。
    注:データ損失の可能性を最小限に抑えるために、次のテストグループを開始する前にデータ記録シートをエクスポートする必要があります。
20. グループごとに繰り返します (テスト ステップ 2.1 から 4.19)。

5. 従属変数

1. 各試行について、以前にプラットフォームを持っていたアームへの最初と繰り返しのエントリの数を数えます。これは、データ記録シートのプラットフォーム上にXで示されます。これらはワーキングメモリの正しいエラーです。
   注: 作業メモリー修正エラーは、エスケープに既に使用されたプラットフォームの位置を記憶し、そのアームを回避することに依存するため、最初の試行で作業メモリー修正エラーが発生することはありません。
2. 各試行について、データ記録シートからプラットフォームを含まないアームへの最初のエントリの数をカウントします。これらは参照メモリエラーです。
3. 各試行について、データ記録シートからプラットフォームを含まないアームへの繰り返しエントリの数をカウントします。これらはワーキングメモリの不正なエラーです。
4. 各試行でプラットフォームに到達するまでの遅延を記録します。

結果

当研究室のサンプルデータでは、試験11日目において、HI群の動物はシャム群と比較して作業記憶の誤答数が有意に多いことが示されました（t = 2.124, p<0.05, 図3Aを参照）。また、HI群の動物は、試験11日目までにシャム群と比較して参照記憶の誤答数も有意に多いことが示されました（t = 2.303, p<0.05, 図3Bを参照）。作業記憶の誤答および参照記憶の誤答には、11日目の各個体における全4回の試行の累積誤答数が含まれます。これらの結果は、新生児脳損傷モデルにおける作業記憶および参照記憶を評価する本タスクの妥当性を裏付けるものであり、さらに、他の神経行動病理モデルを評価するための本パラダイムの有用性を支持しています。

ディスカッション

8 アーム放射状水迷路パラダイムは、新生児脳損傷の有無にかかわらずラットの作業記憶能力と参照記憶能力を評価するために、私たちの研究室や他の研究室によってうまく利用されています^5-7,18-20。現在のパラダイムでは、各試行後に脱出プラットフォームを削除すると、その後の試行で作業記憶の需要が増加します (被験者の脱出オプションが少なくなります)。したがって、試験 4 では、プラットフォームが 1 つだけ残り、ワーキング メモリの需要が最も高くなるため、動物が以前に訪問した腕に再入る可能性が高まります (ワーキング メモリ エラー)。エスケープアームはテスト中ずっと一定であるため、プラットフォームが含まれていないアームに最初のエントリを記録することで、基準メモリを簡単に分析できます。このパラダイムのその他の重要な利点には、食料不足の必要がなく、潜在的な交絡的な匂いの手がかりのリスクが少なく、従来の陸上の迷路^5-7,18-20 とは異なり、事前トレーニングの必要がないことが挙げられます。

検査の長さ(日数)に関して、研究者は、最適な結果を得るた...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ARM-19455 http://www.gototanks.com	プラスチック浴槽	Gototanks	のサイズは、テストされた種や個々のラボのニーズによって異なります。
iPadなどのデジタルタブレット	Apple Inc.	N / A
http://www.apple.com 注目度またはその他のメモ取りアプリケーション	Gingerlabs	N / A	http://www.gingerlabs.com デジタルPDFライターまたはメモ取りプログラム
デジタルタイマー	任意の	N / A
デルタフェーズ等温加熱パッド	Braintreeサイエンティフィック	ASS7D
http://www.braintreesci.com/ ステンレススチール製の迷路	家で製造	N/A