このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索

7.2K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/50950

⸱

2013年12月20日

 ,  ,  , 
1Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

セルロソームは、セルロースを消化するために設計された多酵素複合体です。AFMベースのSMFSを使用して、セルローム関連タンパク質集合体の機械的特性とフォールディング配置を研究しました。セルロソームの組み立てに関与する個々の受容体-リガンド複合体の相互作用を研究するための、タンパク質の固定化、データ取得、およびデータ解析のための完全なワークフローを紹介します。

要約

セルロソームは、嫌気性細菌や真菌の一部がリグノセルロース基質を消化するために使用する個別の多酵素複合体です。非触媒性足場タンパク質への酵素の組み立ては、相互作用するコヒーシンモジュールとドッカーリンモジュールを含む関連する受容体-リガンドペアのファミリー間の相互作用によって指示されます。コヒーシンモジュールとドッカーリンモジュール間の非常に強い結合により、低ピコモルからナノモルの範囲で解離定数が生じ、従来のバルク法では正確なオフレート測定が妨げられる可能性があります。原子間力顕微鏡を用いた単一分子力分光法(SMFS)は、力に対する個々の生体分子の応答を測定し、他の単一分子操作法(光ピンセットなど)とは対照的に、高力領域(>120 pN)をプローブする能力があるため、高親和性受容体-リガンド相互作用の研究に最適です。ここでは、セルロソームタンパク質集合体を単一分子レベルで研究するための完全なプロトコルを紹介します。天然セルロソームに由来するタンパク質トポロジーを用いて、酵素-ドッカーリンおよび糖鎖結合モジュール-コヒーシン(CBM-コヒーシン)融合タンパク質を用い、それぞれが遺伝子操作されたシステイン残基にアクセス可能な遊離チオール基を有するタンパク質を用いました。ここでは、部位特異的な表面固定化プロトコルと、高親和性複合体の詳細な結合パラメータを取得するための測定およびデータ解析手順を紹介します。結合ウェルの単一サブドメイン展開力、複雑な破裂力、運動オフレート、および潜在的な幅を定量化する方法を示します。マルチドメインセルロース分解複合体の集合に関与するコヒーシン-ドッカーリン相互作用を特徴付ける上でのこれらの方法の成功した適用がさらに説明されています。

概要

セルロソームは、嫌気性セルロース分解細菌(C. thermocellumなど)の表面に表示される大きな多酵素複合体で、植物細胞壁のリグノセルロースを可溶性オリゴ糖1に効率的に解重合するように進化しました。セルロソームの中心的な属性は、高親和性コヒーシン-ドッカーリン相互作用です。最も顕著なパラダイムでは、高度に保存された60-75アミノ酸I型ドドクリンモジュールが、さまざまな細菌酵素のC末端に示されています。ドッカーリンモジュールは、I型ドッカーリンモジュールに特異的なコヒーシンドメインのポリタンパク質を含む非触媒的スカフォールドタンパク質(「スカフォールディン」)に、酵素の相乗的な組み合わせの組み立てを指示します。より高いレベルでは、セルロソームの構造は非常に複雑になり、構造を細胞表面に固定し、複数のスキャフォールディングを含む分岐構造の組み立てを可能にする代替のコヒーシンとドッカーリンのペア(例:II型、III型)を組み込んでいます2。さまざまなコヒーシン-ドッカーリンタイプは、関連する構造を持っているにもかかわらず、意図しない足場や他のセルロソーム産生細菌種の成分との交差反応性を抑制する異なる結合特異性を示します。バイオインフォマティクスのアプローチにより、遺伝子レベルで数千ものユニークなセルロソーム成分が同定されてきましたが、タンパク質構造は比較的少なく、コヒーシン-ドッカーリン特異性の決定に働くメカニズムは、依然として構造生物学研究の活発な分野です。

Binnigらによる原子間力顕微鏡(AFM)の発明以来。図3に示すように、非接触イメージング、発振モードイメージング4、1分子力分光法(SMFS)5,6など、さまざまなAFM動作モードが開発され、継続的に改善されています。SMFSは、個々のタンパク質7-11、核酸12-15、および合成ポリマー16-19を直接プローブするために広く使用されている技術に進化しました。受容体-リガンド結合を調査するための典型的なSMFS実験20,21では、AFMカンチレバーチップは結合パートナーの1つで修飾され、平らなガラス表面は相補的結合パートナーで修飾されます。変更されたカンチレバーは表面に接触し、パートナーが結合できるようにします。次に、カンチレバーのベースを一定速度で引き抜き、光学レバーのたわみ法を使用して力を測定します。結果として得られる力-距離データトレースは、結合が確立されている場合、のこぎり歯のようなピークを示します。結合パートナーが複数のタンパク質ドメインに融合している場合、力-距離トレースの各ピークは、単一のタンパク質ドメインまたは折り畳まれたサブドメインのアンフォールディングと相関し、最後のピークはタンパク質結合界面の破裂に対応する。耐力性要素の特定の位置は、目的のさまざまなタンパク質ドメインを特定するためのフィンガープリントとして使用できます。この方法は、タンパク質のフォールディングと安定化に関与する重要なアミノ酸を調べるために使用できます。SMFS実験で観察された特徴的な力の伸長挙動を治療するために、多くのモデルが文献で報告されています。最も一般的に使用されるモデルには、自由結合チェーン(FJC)モデル22、ウォームライクチェーン(WLC)モデル18,23-25、および自由回転チェーン(FRC)モデル25,26が含まれます。

以前の研究11では、コヒーシンモジュールとドッカーリンモジュールの相互作用を調査するために単一分子の力分光法を使用しました。ここでは、酵素-ドッカーリンおよびCBM-コヒーシンタンパク質コンストラクトによるガラス表面およびカンチレバーの機能化の実験的プロトコールを紹介します。また、データ取得および解析手順を含むAFMベースのSMFSプロトコルについても紹介します。記載されているプロトコルは、他の分子系に容易に一般化することができ、高親和性受容体リガンドペアに関心のある研究者にとって特に有用であることが証明されるはずです。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

本研究においてコヘシン-ドッカーリン相互作用を調べるために使用したプルイング・ジオメトリ（牽引構成）の概略をFigure 1Aに示します。カンチレバーおよびカバーガラスの機能化のためにここで報告するタンパク質固定化プロトコルは、既報27の手順を変更したものです。タンパク質は、一般的な手法を用いてプラスミドベクターからE. coliで発現させました。これらのタンパク質は溶媒接近可能なチオール基を持つように設計されており、マレイミド化学と組み合わせて、安定なチオエーテル結合を介してカバーガラス表面およびカンチレバーにタンパク質を繋ぎ止めました。CBM-コヘシンおよびキシラナーゼ-ドッカーリンの両融合タンパク質に設計したシステイン残基は、コヘシン-ドッカーリン結合界面から離れたタンパク質のN末端側に配置しました11。タンパク質固定化に採用した化学結合の詳細な概要をFigure 1Bに示します。

1. サンプルの調製

  1. 緩衝液
    1. カルシウム添加Tris緩衝生理食塩水（TBS）を調製する：25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7.2
    2. ホウ酸ナトリウム緩衝液を調製する：50 mM Na2B4O7, pH 8.5
      サンプル調製ステップを示すプロセスフロー図を図2に示す。
      カンチレバーおよびカバーガラスを取り扱う際は、セルフロック式ピンセットの使用を推奨する。
  2. カバーガラスのアミノシラン化（約 1.5 時間）
    1. カバーガラス（直径 24 mm、厚さ 0.5 mm）をPTFEホルダーに配置する。
    2. 1:1 のエタノール：超純水（v/v）中でカバーガラスを 15 分間ソニケーションする。
    3. カバーガラスを超純水で洗浄する。
    4. カバーガラスをピラニア溶液（1:1 H2SO4（濃縮液）：H2O2（30%）（v/v））に 30 分間浸漬し、その後超純水で十分に洗浄する。カバーガラスを N2 の緩やかな気流下で乾燥させる。注意：ピラニア溶液は極めて腐食性が高いため、眼および皮膚の保護具が必須である。
    5. 45:5:1 のエタノール：超純水：3-アミノプロピルジメチルエトキシシラン（v/v）にカバーガラスを浸漬する。室温（RT）で 60 分間、シェーカーで振盪させる（約 50 rpm）。
    6. カバーガラスをエタノールと超純水に順次浸漬させる（それぞれ 2 回ずつ）。カバーガラスを N2 の緩やかな気流下で乾燥させる。
    7. オーブンでカバーガラスを焼成する（80 °C で 30 分間）。
    8. シラン化されたカバーガラスは、アルゴン下で最大 6 週間保存可能である。
  3. カンチレバーのアミノシラン化（約 1.5 時間）
    注：提示されたチップ機能化プロトコルは、シリコンカンチレバーチップに適している。
    1. カンチレバーを清潔なガラススライド上に配置する。UVオゾン処理を 15 分間行う。
    2. 1:1 のエタノール：3-アミノプロピルジメチルエトキシシラン（v/v）に少量の触媒（0.25%, (v/v)）として超純水を加えた液中に、カンチレバーを 3 分間浸漬させる。
    3. トルエン、エタノール、超純水を入れたビーカーで、緩やかに攪拌しながら順次 60 秒間ずつカンチレバーを洗浄する。洗浄の合間に、ろ紙を用いて慎重にカンチレバーを乾燥させる。
    4. レバーを清潔なガラススライド上に配置し、焼成する（80 °C で 30 分間）。
  4. タンパク質のジスルフィド還元（約 3 時間）
    すべての溶液は、カンチレバー1本あたり約 30 µl、カバーガラス1枚あたり 20 µl の希釈タンパク質が得られるように調製すること。タンパク質溶液を Tris(2-カルボキシエチル)ホスフィン (TCEP) ジスルフィド還元ゲルと 1:2 (v/v) の比率で混合する。
    1. マイクロチューブに TCEP ジスルフィド還元ビーズを分注する。TCEPビーズスラリーをピペッティングする際は、ハサミでマイクロピペットチップを切断して孔径を広げることを推奨する。
    2. TCEPビーズスラリーを 1 ml の TBS 緩衝液で洗浄し、850 rcf で 3 分間遠心分離する。
    3. マイクロピペットを用いて上清を慎重に取り除き、廃棄する。
    4. ステップ 1.4.2 から 1.4.3 を 2 回繰り返す。
    5. 濃縮タンパク質溶液（1-10 mg/ml）を TCEP ビーズに添加し（タンパク質：TCEPビーズスラリー = 1:2 (v/v)）、マイクロピペットチップで穏やかに攪拌して混合する。気泡が混入しないように注意する。
    6. タンパク質/TCEPビーズスラリー混合物をローテーターに設置し、2.5 時間放置する。
  5. カバーガラスおよびカンチレバーのPEG化（約 1.5 時間）
    1. NHS-PEG-マレイミドリンカーによる修飾の前に、アミノシラン化されたカンチレバーとカバーガラスをホウ酸ナトリウム緩衝液（pH 8.5）に 45 分間浸漬させ、表面の一次アミン基を脱プロトン化する。
    2. NHS-PEG-マレイミド粉末のキャップを開けて 25 mM 溶液に必要な量を量り取る前に、粉末を室温（RT）まで温めておくこと。未使用の NHS-PEG-マレイミドは -20 °C でアルゴン下で保存する必要がある。ポリマー溶液は、カンチレバー1本あたり約 30 µl、カバーガラス2枚（重ねた状態）あたり 90 µl 必要である。
    3. 5 kDa NHS-PEG-マレイミドを量り取った後、ホウ酸ナトリウム緩衝液を加え、ボルテックスして 25 mM 溶液とする。
      注：pH 8.5 における NHS の半減期が極めて短いため、溶液は可能な限り速やかに使用すること。ボルテックスおよびカンチレバー/カバーガラスへの液滴下は 1-2 分以内に完了させる必要がある。
    4. ペトリ皿内で、30 µl の NHS-PEG-マレイミド溶液の液滴にカンチレバーを浸漬させる。カバーガラスの場合は、1枚のカバーガラス上に 90 µl の NHS-PEG-マレイミド溶液を滴下し、その上に2枚目のカバーガラスを重ねて、中央に溶液を挟んだサンドイッチ構造にする。
    5. カンチレバー/カバーガラスを NHS-PEG-マレイミド溶液とともに、水飽和雰囲気下の室温（RT）で 1 時間インキュベートする。
  6. タンパク質の接合（約 2 時間）
    重要：PEG化されたカンチレバーおよびカバーガラスの空気への露出を最小限に抑えること。
    1. TCEPビーズ/還元タンパク質溶液を 100 rcf で 1 分間遠心分離し、上清を回収する。
    2. タンパク質溶液を TBS で希釈する。表面接合時のタンパク質濃度が 0.5-2 mg/ml の範囲になるように調整する。カンチレバーとカバーガラスを洗浄している間、還元・希釈したタンパク質溶液を数分間置いておく。
    3. カンチレバーとカバーガラスを、3つの超純水ビーカーで順次洗浄する。
    4. N2 の緩やかな気流下で、カバーガラスの端を慎重にろ紙に触れさせ、残留液を丁寧に取り除く。カンチレバーも同様にろ紙に触れさせて残留液を慎重に取り除く。直ちに希釈タンパク質溶液を適用する。
    5. AFM装置に適合する適切なサンプルホルダーにカバーガラスを固定する。
    6. PEG化されたカバーガラスおよびカンチレバーを、それぞれの希釈タンパク質溶液とともに室温（RT）で 1-2 時間インキュベートする。
    7. 未結合のタンパク質を除去するため、カンチレバーを TBS を入れた3つのビーカーで順次洗浄する。カバーガラスはピペッティングによる洗浄を少なくとも 10 回行う。
    8. 測定まで、カンチレバーとカバーガラスを TBS 下で保存する。

2. データ収集

本研究では、Asylum Research社のMFP-3D AFMコントローラーと独自に作成したIgor Proソフトウェアで制御される、カスタムメイドのAFM28を使用しました。カンチレバーのたわみは、光学的ビーム偏向法29によって測定されます。ここで提供する試料調製およびデータ解析プロトコルは、使用するAFMの正確なモデルに関わらず適用可能です。ただし、AFMモデルは液体中での測定に適しており、z-ピエゾの速度範囲として約200-5,000 nm/secまで設定可能なものである必要があります。

  1. 機能化されたカンチレバーとガラス表面をAFMに装着します。全工程において、表面はバッファーで覆われた状態を維持してください。カンチレバーを装着する際は、空気への露出を最小限に抑えます。レーザー光の調整が正しく完了した後、ドリフトの影響を軽減するためにシステムを少なくとも30分間平衡化させ、必要に応じて再調整を行ってください。
  2. カンチレバーを表面から十分に離した状態で、熱雑音スペクトルを記録します。 すなわち 減衰効果がない場合に。
  3. 測定前に、カンチレバーのチップを損傷させることなく表面を検出するため、音響アプローチのような低侵襲な手法を用いてください。可能であれば、カンチレバーで手動で表面に近づけ、ヘッドホンを使用してAFMコントローラーからの生の偏向出力における熱雑音を聴取してください。カンチレバーが表面に近づくと、音に明確な変化が生じます。
    注：カンチレバーのチップが2-5 µm 表面の。音の変化の性質は、使用するカンチレバーに依存します。本研究で使用したカンチレバーの共振周波数は、水中でおよそ25 kHzであり、人間の可聴範囲を超えています。表面付近での減衰効果により、共振が低周波数側へシフトし、カンチレバーの共振が可聴範囲に入ります。その結果、周波数と音強度が表面上増加したように知覚されます。
    偏向信号のオーディオ出力が利用できない場合は、偏向信号のアクティブフィードバックを有効にしたまま、z-ピエゾを用いて表面に接近させることができます。表面の圧入によって偏向信号が規定量増加した時点で、接近動作を停止させます。
  4. 1ボルトのたわみ信号あたりのチップ変位量（nm）を表す、逆光学レバー感度（InvOLS）を決定します。これは、カンチレバーチップで表面を押し込むことで行います。カンチレバーチップの変位が約3 nmに相当するたわみセットポイント電圧に設定することを推奨します。
  5. 等配分定理に基づき、熱雑音スペクトルに単振動子の応答関数をフィッティングさせることで、カンチレバーのばね定数を決定する。30,31.
  6. 実験ルーチンを開始します。本研究では、以下の測定パラメータセットを使用しました：接近速度：3,000 nm/sec、押し込み力：180 pN、表面滞在時間：10 msec、後退速度：0.2, 0.7, 2.0 5.0 µm/sec サンプリングレートはそれぞれ2,000、5,000、15,000、20,000 Hzとし、後退距離（retract distance）は500 nmとする。
    注：オーバーサンプリングを回避し、データサイズを適正に保つため、サンプリングレートは10 points/nmを超えないように設定してください。
  7. 各力-距離曲線（force-distance trace）の測定後、x軸およびy軸のピエゾステージを駆動させ、カンチレバーが接する表面上の位置を更新します。この手法により、長期的な測定においてカバーガラス表面のより広い領域をサンプリングすることが可能になります。
  8. 偏向ステージの定期的なリゼロイング（ゼロ点調整）を行い（すなわち （フォトダイオードの位置）および、偏向信号が範囲外にドリフトした場合や表面との接触が失われた場合の、長期測定中におけるz-ピエゾシャーシの高さ。
  9. 測定ランの完了後、測定前よりも大幅に高いインデンテーション力を用いて再度InvOLS測定を行い、より精緻なInvOLS値を取得してください。
  10. 表面から十分に離れた位置で、別の熱雑音スペクトルを記録します。実験走行の最後にバネ定数を決定します。

3. データ解析

図3のフローチャートは、データ解析のプロセスを示しています。Igor ProやMATLABなどの適切なソフトウェアパッケージを使用して、すべてのデータ操作を行ってください。まず、検出器からの生信号を力の単位に変換し、オフセットとドリフトを補正します。続いて、バイオポリマーの弾性モデルを用いて、展開経路におけるエネルギー障壁を特定し、タンパク質のサブドメインを同定します。最終的に、受容体-リガンド相互作用の動力学的およびエネルギー的パラメータを得ます。

  1. 単位変換およびデータの修正
    1. 検出器の電圧を力の単位に変換するため、生のたわみ信号（V）にInvOLS（nm/V）およびばね定数（pN/nm）を乗じます。
    2. まず、力-距離トレースの最後10%（表面から最も遠い位置で取得された領域）の力値を平均し、次にその平均値をデータトレース内のすべての力値から差し引くことで、負荷のないカンチレバーの力値が0 pNになるようにデータをオフセットします。
    3. 各トレースをx方向にオフセットさせ、距離軸との最初の交点が0 nmになるようにしてください。
    4. InvOLSは、カンチレバー上のレーザースポットの位置に依存します。カンチレバーのフットプリントがレーザースポットサイズと同程度である場合、光学読み出しシステムのわずかなドリフトであっても、InvOLSに顕著な変化が生じる可能性があります。これについては、ゼロフォース時のたわみ信号のノイズを解析することで補正してください。周囲条件が一定であると仮定すると、たわみ信号のノイズはInvOLSに正比例します。
      1. 各力-距離曲線（force-distance trace）の最後の10%におけるルート平均二乗（RMS）変位値（零荷重下のノイズレベル）を測定する。
      2. ノイズを曲線番号に対してプロットし、適切なフィッティングを行います。通常は、次のような形式の指数フィッティングを用います。 Exponential decay formula, N(n_i)=N_0 * e^(-kn_i), mathematical representation. Nをノイズ、niを曲線番号、N0およびkをフィッティングパラメータとすると、これが最適に機能します。また、特定のデータセットには線形フィッティングが適切である場合もあります。
      3. 各曲線のスケーリング係数（SF）を決定します。

        式1：
        static equilibrium equation; (SF)=(N₀e^(-knᵢ)+C)/(N₀e^(-knₓ)+C); mathematical formula
        ここで、$n_i$は曲線の番号、$n_f$は最終曲線の番号、$C$はオフセットである。
      4. 次に、各個別の曲線におけるすべての力値をスケーリング係数で除します。この手順により、各曲線は、現在の曲線のRMSノイズ値と、InvOLS測定の直前に取得した最終トレースのRMSノイズ値との比率でスケーリングされます。
      5. 距離軸（z）を分子の伸長（z*）に変換するために、たわみ補正を行う。これにより、z-ピエゾセンサーの位置によって報告される値よりも、力によるカンチレバーの曲がりによってカンチレバーの先端とサンプルの間の距離が短くなる点について補正を行う。

        式2：
        Static equilibrium equation, z* = z - F/k, formula; physics calculations, force analysis
        どこ z 測定されたZセンサー位置であり、 F カンチレバーに作用する力および k ばね定数
  2. 輪郭長解析
    タンパク質のコンター長とは、ポリペプチド鎖を最大限に引き伸ばしたときの長さのことである。タンパク質の折りたたみ状態とは、二次構造および三次構造によって決定される形状および末端間距離を指す。タンパク質のコンター長は、その折りたたみ状態と直接的に関連している。9,25,32力-伸長曲線の特定の破断位置は、PEGリンカーの多分散性に加え、温度、緩衝液の特性、負荷速度などの外部パラメータによって大きく変動します。このため直接的なデータ解析は困難になりますが、力-伸長データを輪郭長空間に変換することで解決できます。この手法により、膨大なデータセットの平均化が可能となり、また、特徴的なアンフォールディングイベントを特定するための自動パターン認識を利用できるようになります。したがって、提示された相互作用の種類に応じて、個々の力曲線を選別することが可能です。以下に、既報の手順を記します。25 力-伸長データを輪郭長空間に変換するために使用されます。
    1. WLCモデル（式3）の解法23 輪郭長について L 一定の持続長において p 式4の結果から、輪郭長が求められる。 L(x,u)ここでは、 入力がありません。翻訳するテキストをご提示ください。 距離および u=F*p/kBT、ここで kB はボルツマン定数であり、Tは温度である。実数解のみを考慮するものとする。追加の制約条件は以下の通りである。 x, F>0, L>0, x>0;

      式3：
      Force-extension formula, F(x,L), polymer physics equation, illustrates entropic elasticity.

      式4：
      Static equilibrium, L(x,u), complex formula, educational diagram, analytical expression interpretation.
      ここで、
      Polynomial function \( g(u) \) equation, mathematical analysis, symbolic computation.
    2. 変換後のデータポイントを、力対コンター長のプロットに描画します。ノイズを除去するため、約10 pNの力しきい値を適用します。ロングパス長さフィルターを適用することで、非特異的相互作用を除外できます。コンター長のヒストグラムを作成します。
    3. 相互相関させる33 得られたヒストグラムをテンプレートヒストグラムと比較し、PEGの多分散性を補正するためにx軸方向にオフセットさせます。得られた相関値を用いて、個々のデータトレースの類似性を測定します。これにより、データトレースをあらかじめ定義されたクラスに分類し、その後の解析を簡略化することができます。
    4. 自己相関を用いて、単一のトレース内の繰り返し特徴を検出する同様の手法を用います。 例： 複数のIgドメインのアンフォールディングについて。
    5. 他のアンフォールディング事象を調査するため、トレースを手動でソートする。
  3. 負荷速度解析
    力スペクトルに適したモデルを適用することで、受容体-リガンド解離に関する動力学的およびエネルギー的な情報を抽出する。 すなわち 破断力 対 ln(負荷速度) プロット。
    1. 特定の牽引速度において、対象となる破断イベントの破断力および負荷速度を決定します。
      1. 目的の破断イベント付近の力-時間トレースに対して直線近似を行います。ピークへの直線近似の傾きから、負荷速度を決定します。目的の破断イベントを示すすべてのトレースに対して、この手順を繰り返します。
      2. 破断力のヒストグラムにガウスフィッティングを適用し、最も可能性の高い破断力を決定します。代替のフィッティング関数を用いることも可能です。
      3. 最も可能性の高い負荷速度を決定してください。
    2. すべての牽引速度について、ステップ 3.3.3.1 から 3.3.3.3 までを繰り返します。
    3. 最確破断力を、最確負荷速度の自然対数に対してプロットし、フォーススペクトルを得る。
    4. 力スペクトルに適切な理論モデルを適用し、速度論的およびエネルギー的パラメータを抽出する（図 4C）。多くの場合、線形Bell-Evansモデルは20,34 使用可能であり、～の良好な推定値が得られます。 koff、外力が加わらない場合の解離速度、およびDx, 式5に示される、反応座標に沿った遷移状態までの距離。

      式5：
      static force equation ⟨F⟩, k_B T/Δx, formula analysis for thermal fluctuation experiments

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

記述された手順を用いて、C. thermocellum由来のタイプI cohesin-dockerinペアを調査しました。cohesin-dockerinペアの結合に成功すると、記録された力-距離トレースに特徴的なピークパターンが示されました。代表的なトレースを図4aに示します。トレース内の各ピークは1つのタンパク質サブドメインの展開を表しており、最後のピークは受容体-リガンド複合体の解離に対応しています。

本研究で検討したCBM-コヒーシン-ドケリン-キシラナーゼ複合体において、初期の力の立ち上がりはPEGリンカー分子の伸展に対応します。それに続く最大3回の下降方向へのフォースディップ（力の低下）の一連の流れは、キシラナーゼドメインのアンフォールディングを反映しています。最終的なピークは、コヒーシンとドケリンの結合界面の解離を表しています。

記録されたすべての力-距離トレースを力-輪郭長空間に変換した。得られたバリア位置のヒストグラムをFigure 4B

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

単一分子力分光実験から意味のあるデータを得るには、明確に定義された再現性のある引っ張り形状を実現することが重要です。ここで使用されるプロトコルは、定義された引っ張り形状におけるタンパク質複合体の部位特異的固定化をもたらします。

この研究で使用されたカンチレバーは、力の感度と水中での共振周波数が高いため選択されました。さらに、約10 nmの小さな先端曲率は、複数の相互作用の可能性が低いため、単一分子実験に有利です。ただし、カンチレバーアームの設置面積が小さい(38x16μm2)ため、光たわみ法29 を使用する場合、レーザービームの調整が複雑になります。この研究に使用されたセットアップで集束されたレーザービームの直径は、カンチレバーの幅に匹敵します。その結果、定常和信号を取得することが困難になる場合があります。カンチレバーのレーザードリフトは、説明したように、データ曲線全体のノイズ解析を使用して逆光学レバー感度を補正することで部分的に補正できます。現在、当社グループでは、データ品質向上のため、光路を短くし、レーザースポットサイズを小さくした新...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

著者は、欧州研究評議会(European Research Council)のヘルマン・ガウブへの助成金を認めています。マイケル・A・ナッシュは、Society in Science-The Branco Weiss Fellowshipプログラムからの資金提供に感謝しています。著者らは、この研究で使用されたタンパク質を寛大に提供してくれたワイツマン科学研究所のEdward A. Bayer氏、Yoav Barak氏、Daniel B. Fried氏に感謝します。著者は、有益な議論をしてくれたHermann E. Gaub、Elias M. Puchner、およびStefan W. Stahlに感謝します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3-アミノプロピルジメチルエトキシシランABCR GmbHAB110423
5 kDa NHS-PEG-maleimideRapp ポリマー13 5000-65-35
TCEP ジスルフィド還元ゲルThermo Scientific, Pierce77712www.thermoscientific.com/pierce
>Tris(hydroxymethyl)aminomethane
BioLever ミニ窒化ケイ素カンチレバーオリンパスBL-AC40TS-C2ソフトバッチ
XYZ圧電アクチュエータPhysik Instrumente GmbH
赤外線 "ブロードスペクトラム」IRレーザーSuperlum
MFP-3D AFMコントローラーアサイラムリサーチ
Igor Pro 6.31Wavemetricsデータ収集と分析
塩化
塩化
メーター
ホウ酸
ピンセット
カバーメガネThermo Scientific、Menzel-GLä24mm、厚さ0.5mm
PTFEサンプルホルダーカスタムメイド
ソニケーターバス
エタノール分析純度
硫酸(濃縮)分析純度
過酸化水素(30%)分析純度
オービタルシェーカー
トルエン分析純度
濾紙
ガラススライド
マイクロチューブ
マイクロピペット
マイクロチューブに適した遠心分離機
ローテーター
ペトリ皿
ビーカー
光学顕微鏡
ナトリウムカルシウムpHナトリウム ser直径の

参考文献

  1. Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).
  2. Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. From Cellulosomes to Cellulosomics. Chem. Rec. 8 (6), 364-377 (2008).
  3. Binnig, G., Quate, C. F. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).
  4. Garcı́a, R., Perez, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf. Sci. Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
  5. Engel, A., Müller, D. J. Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 715-718 (2000).
  6. Li, H., Cao, Y. Protein Mechanics: From Single Molecules to Functional Biomaterials. Acc. Chem. Res. 43 (10), 1331-1341 (2010).
  7. Florin, E. -L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  8. Oberhauser, A., Hansma, P., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2), 468-472 (2001).
  9. Puchner, E. M., Gaub, H. E. Force and function: probing proteins with AFM-based force spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 19 (5), 605-614 (2009).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J., Gaub, H. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Sci. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Stahl, S. W., Nash, M. A., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin–dockerin complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  12. Boland, T., Ratner, B. D. Direct measurement of hydrogen bonding in DNA nucleotide bases by atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5297-5301 (1995).
  13. Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. B-S Transition in Short Oligonucleotides. Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).
  14. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).
  15. Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. Cytosine methylation alters DNA mechanical properties. Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).
  16. Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
  17. Giannotti, M. I., Vancso, G. J. Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy. Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).
  18. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).
  19. Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Stimuli-Responsive Oligo(ethylene glycol) Copolymer to Gold. ACS Nano. 6 (12), 10735-10742 (2012).
  20. Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy. Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).
  21. Morfill, J., Neumann, J., et al. Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide. Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).
  22. Ortiz, C., Hadziioannou, G. Entropic Elasticity of Single Polymer Chains of Poly(methacrylic acid) Measured by Atomic Force Microscopy. Macromolecules. 32 (3), 780-787 (1999).
  23. Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, F. Entropic Elasticity of l-phage DNA. Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).
  24. Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28 (26), 8759-8770 (1995).
  25. Puchner, E. M., Franzen, G., Gautel, M., Gaub, H. E. Comparing Proteins by Their Unfolding Pattern. Biophys. J. 95 (1), 426-434 (2008).
  26. Livadaru, L., Netz, R. R., Kreuzer, H. J. Stretching Response of Discrete Semiflexible Polymers. Macromolecules. 36 (10), 3732-3744 (2003).
  27. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nat. Protoc. 5 (6), 975-985 (2010).
  28. Gumpp, H., Stahl, S. W., Strackharn, M., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Ultrastable combined atomic force and total internal fluorescence microscope. Rev. Sci. Instrum. 80 (6), 063704 (2009).
  29. Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture. J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).
  30. Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).
  31. Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration. Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).
  32. Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds. Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).
  33. Dietz, H., Rief, M. Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition. Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).
  34. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  35. Dietz, H., Rief, M. Protein structure by mechanical triangulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).
  36. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments. Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).
  37. Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

原子間力顕微鏡コヒージンとドッカリンの相互作用セルロソームの構築タンパク質の展開力動的力スペクトルベル・エバンスモデル部位特異的固定化受容体-リガンド結合速度論的解離速度
AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。