セルロソームは、セルロースを消化するために設計された多酵素複合体です。AFMベースのSMFSを使用して、セルローム関連タンパク質集合体の機械的特性とフォールディング配置を研究しました。セルロソームの組み立てに関与する個々の受容体-リガンド複合体の相互作用を研究するための、タンパク質の固定化、データ取得、およびデータ解析のための完全なワークフローを紹介します。
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方法論記事
AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
セルロソームは、嫌気性細菌や真菌の一部がリグノセルロース基質を消化するために使用する個別の多酵素複合体です。非触媒性足場タンパク質への酵素の組み立ては、相互作用するコヒーシンモジュールとドッカーリンモジュールを含む関連する受容体-リガンドペアのファミリー間の相互作用によって指示されます。コヒーシンモジュールとドッカーリンモジュール間の非常に強い結合により、低ピコモルからナノモルの範囲で解離定数が生じ、従来のバルク法では正確なオフレート測定が妨げられる可能性があります。原子間力顕微鏡を用いた単一分子力分光法(SMFS)は、力に対する個々の生体分子の応答を測定し、他の単一分子操作法(光ピンセットなど)とは対照的に、高力領域(>120 pN)をプローブする能力があるため、高親和性受容体-リガンド相互作用の研究に最適です。ここでは、セルロソームタンパク質集合体を単一分子レベルで研究するための完全なプロトコルを紹介します。天然セルロソームに由来するタンパク質トポロジーを用いて、酵素-ドッカーリンおよび糖鎖結合モジュール-コヒーシン(CBM-コヒーシン)融合タンパク質を用い、それぞれが遺伝子操作されたシステイン残基にアクセス可能な遊離チオール基を有するタンパク質を用いました。ここでは、部位特異的な表面固定化プロトコルと、高親和性複合体の詳細な結合パラメータを取得するための測定およびデータ解析手順を紹介します。結合ウェルの単一サブドメイン展開力、複雑な破裂力、運動オフレート、および潜在的な幅を定量化する方法を示します。マルチドメインセルロース分解複合体の集合に関与するコヒーシン-ドッカーリン相互作用を特徴付ける上でのこれらの方法の成功した適用がさらに説明されています。
概要
セルロソームは、嫌気性セルロース分解細菌(C. thermocellumなど)の表面に表示される大きな多酵素複合体で、植物細胞壁のリグノセルロースを可溶性オリゴ糖1に効率的に解重合するように進化しました。セルロソームの中心的な属性は、高親和性コヒーシン-ドッカーリン相互作用です。最も顕著なパラダイムでは、高度に保存された60-75アミノ酸I型ドドクリンモジュールが、さまざまな細菌酵素のC末端に示されています。ドッカーリンモジュールは、I型ドッカーリンモジュールに特異的なコヒーシンドメインのポリタンパク質を含む非触媒的スカフォールドタンパク質(「スカフォールディン」)に、酵素の相乗的な組み合わせの組み立てを指示します。より高いレベルでは、セルロソームの構造は非常に複雑になり、構造を細胞表面に固定し、複数のスキャフォールディングを含む分岐構造の組み立てを可能にする代替のコヒーシンとドッカーリンのペア(例:II型、III型)を組み込んでいます2。さまざまなコヒーシン-ドッカーリンタイプは、関連する構造を持っているにもかかわらず、意図しない足場や他のセルロソーム産生細菌種の成分との交差反応性を抑制する異なる結合特異性を示します。バイオインフォマティクスのアプローチにより、遺伝子レベルで数千ものユニークなセルロソーム成分が同定されてきましたが、タンパク質構造は比較的少なく、コヒーシン-ドッカーリン特異性の決定に働くメカニズムは、依然として構造生....
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プロトコル
本研究においてコヘシン-ドッカーリン相互作用を調べるために使用したプルイング・ジオメトリ（牽引構成）の概略をFigure 1Aに示します。カンチレバーおよびカバーガラスの機能化のためにここで報告するタンパク質固定化プロトコルは、既報27の手順を変更したものです。タンパク質は、一般的な手法を用いてプラスミドベクターからE. coliで発現させました。これらのタンパク質は溶媒接近可能なチオール基を持つように設計されており、マレイミド化学と組み合わせて、安定なチオエーテル結合を介してカバーガラス表面およびカンチレバーにタンパク質を繋ぎ止めました。CBM-コヘシンおよびキシラナーゼ-ドッカーリンの両融合タンパク質に設計したシステイン残基は、コヘシン-ドッカーリン結合界面から離れたタンパク質のN末端側に配置しました11。タンパク質固定化に採用した化学結合の詳細な概要をFigure 1Bに示します。
1. サンプルの調製
- 緩衝液
- カルシウム添加Tris緩衝生理食塩水（TBS）を調製する：25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7.2
- ホウ酸ナトリウム緩衝液を調製する：50 mM Na2
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結果
記述された手順を用いて、C. thermocellum由来のタイプI cohesin-dockerinペアを調査しました。cohesin-dockerinペアの結合に成功すると、記録された力-距離トレースに特徴的なピークパターンが示されました。代表的なトレースを図4aに示します。トレース内の各ピークは1つのタンパク質サブドメインの展開を表しており、最後のピークは受容体-リガンド複合体の解離に対応しています。
本研究で検討したCBM-コヒーシン-ドケリン-キシラナーゼ複合体において、初期の力の立ち上がりはPEGリンカー分子の伸展に対応します。それに続く最大3回の下降方向へのフォースディップ（力の低下）の一連の流れは、キシラナーゼドメインのアンフォールディングを反映しています。最終的なピークは、コヒーシンとドケリンの結合界面の解離を表しています。
記録されたすべての力-距離トレースを力-輪郭長空間に変換した。得られたバリア位置のヒストグラムをFigure 4B
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ディスカッション
単一分子力分光実験から意味のあるデータを得るには、明確に定義された再現性のある引っ張り形状を実現することが重要です。ここで使用されるプロトコルは、定義された引っ張り形状におけるタンパク質複合体の部位特異的固定化をもたらします。
この研究で使用されたカンチレバーは、力の感度と水中での共振周波数が高いため選択されました。さらに、約10 nmの小さな先端曲率は、複数の相互作用の可能性が低いため、単一分子実験に有利です。ただし、カンチレバーアームの設置面積が小さい(38x16μm2)ため、光たわみ法29 を使用する場合、レーザービームの調整が複雑になります。この研究に使用されたセットアップで集束されたレーザービームの直径は、カンチレバーの幅に匹敵します。その結果、定常和信号を取得することが困難になる場合があります。カンチレバーのレーザードリフトは、説明したように、データ曲線全体のノイズ解析を使用して逆光学レバー感度を補正することで部分的に補正できます。現在、当社グループでは、データ品質向上のため、光路を短くし、レーザースポットサイズを小さくした新.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
著者は、欧州研究評議会(European Research Council)のヘルマン・ガウブへの助成金を認めています。マイケル・A・ナッシュは、Society in Science-The Branco Weiss Fellowshipプログラムからの資金提供に感謝しています。著者らは、この研究で使用されたタンパク質を寛大に提供してくれたワイツマン科学研究所のEdward A. Bayer氏、Yoav Barak氏、Daniel B. Fried氏に感謝します。著者は、有益な議論をしてくれたHermann E. Gaub、Elias M. Puchner、およびStefan W. Stahlに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3-アミノプロピルジメチルエトキシシラン | ABCR GmbH | AB110423 | |
| 5 kDa NHS-PEG-maleimide | Rapp ポリマー | 13 5000-65-35 | |
| TCEP ジスルフィド還元ゲル | Thermo Scientific, Pierce | 77712 | www.thermoscientific.com/pierce |
| >Tris(hydroxymethyl)aminomethane | |||
| BioLever ミニ窒化ケイ素カンチレバー | オリンパス | BL-AC40TS-C2 | ソフトバッチ |
| XYZ圧電アクチュエータ | Physik Instrumente GmbH | ||
| 赤外線 "ブロードスペクトラム」IRレーザー | Superlum | ||
| MFP-3D AFMコントローラー | アサイラムリサーチ | ||
| Igor Pro 6.31 | Wavemetrics | データ収集と分析 | |
| 塩化 | |||
| 塩化 | |||
| メーター | |||
| ホウ酸 | |||
| ピンセット | |||
| カバーメガネ | Thermo Scientific、Menzel-GLä | 24mm、厚さ0.5mm | |
| PTFEサンプルホルダー | カスタムメイド | ||
| ソニケーターバス | |||
| エタノール | 分析純度 | ||
| 硫酸(濃縮) | 分析純度 | ||
| 過酸化水素(30%) | 分析純度 | ||
| オービタルシェーカー | |||
| トルエン | 分析純度 | ||
| 濾紙 | |||
| ガラススライド | |||
| マイクロチューブ | |||
| マイクロピペット | |||
| マイクロチューブに適した | 遠心分離機 | ||
| ローテーター | |||
| ペトリ皿 | |||
| ビーカー | |||
| 光学顕微鏡 |
参考文献
- Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).
- Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. From Cellulosomes to Cellulosomics. Chem. ....
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再版と許可
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