リンパ節間質細胞起源の研究のためのリンパ節脂肪パッドキメラの生成

Summary

リンパ節間質細胞の起源を研究するためのリンパ節/脂肪パッドキメラの生成について記載しています。この方法は、新生仔マウスおよび胚性脂肪パッドからのリンパ節の単離、キメラリンパ節脂肪パッドの生成、および宿主マウスの腎臓嚢下でのそれらの移動を含む。

Abstract

間質はリンパ節の構造と機能の主要な構成要素です。しかし、その起源、正確な細胞組成、およびその形成を支配するメカニズムについてはほとんど知られていません。リンパ節は常に脂肪組織にカプセル化されており、最近、リンパ節間質の形成に対するこの関係の重要性を示しました。脂肪細胞前駆細胞は、その発生中にリンパ節に移動し、Lymphotoxin-b受容体が関与すると、脂肪形成をオフにしてリンパ系間質細胞に分化します(Bénézechら。¹⁴)脂肪組織のリンパ間質電位に基づき、リンパ節間質細胞前駆細胞の系統追跡を可能にするリンパ節/脂肪パッドキメラを用いた方法を提示する。新生児のリンパ節とEYFP⁺胚性脂肪組織を分離し、LN/EYFP⁺脂肪パッドキメラを作る方法を示します。宿主マウスの腎臓嚢の下に移植した後、リンパ節は局所脂肪組織前駆細胞を取り込み、その形成を終えます。得られたリンパ節のEYFP⁺脂肪パッド細胞の子孫解析は、酵素的に消化されたリンパ節のフローサイトメトリー解析、またはリンパ節凍結切片の免疫蛍光解析によって行うことができます。この方法は、異なるノックアウトマウスモデルの脂肪パッドを使用することにより、異なるリンパ節間質細胞集団の起源を分析する効率的な方法を提供します。

Introduction

リンパ節(LN)は、リンパ管ネットワークに沿って体内の戦略的な部位に位置する免疫系の主要な器官です。それらは、抗原および病原体の濾過を可能にし、リンパ球への抗原提示および適応免疫応答の誘導のための部位を提供する。間質は、LNの基本構造を形成し、適応免疫応答のさまざまな造血参加者の動きを指揮し、これらの臓器の機能の中心です。間質細胞の異なる集団は、免疫系の造血成分の運動、局在化、生存、増殖、成熟に不可欠かつ特異的な手がかりを提供します^1-3。成体のLN間質細胞は、血液内皮細胞、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞の3つのカテゴリーに分類されます。これら 3 つのカテゴリには、異種集団が含まれます。線維芽細胞集団には、線維芽細胞網状細胞(FRC)、濾胞性樹状細胞(FDC)、辺縁網状細胞(MRC)が含まれ、一方、カプセルを形成する線維芽細胞、髄質、およびまだ同定されていない他の細胞^1-5。異なるLN間質細胞集団の成熟を支配する起源とメカニズムは不明であり、特定のLN間質細胞集団の運命マッピングを可能にする特定のマーカーがないため、彼らの研究は特に困難になっています。しかし、適応免疫応答の理解には、LN間質細胞の個体発生を完全に理解することが必要であり、耐性に寄与するメカニズムであり、人工LNの開発の基礎となっています。

これまで、LN間質細胞の起源と発生の研究は、野生型マウスと異なるノックアウトマウス系統^6-9の胚と新生児におけるLN発生の直接的な評価にほとんど限られていました。これらのアプローチは、LNの発生に重要な遺伝子の欠失を持つ一部のマウス系統の胚および周産期の致死性によって制限されます。また、リンパ組織の発生に必須な遺伝子の中には、RANK^10-11やNF-κB2¹²のように、幅広い生物学的プロセスに関与しているものもあります。これらの問題に対処するために、宿主マウスの腎臓嚢下への胚性LNの単離と移植が行われてきた^12-13。この技術により、例えば、遺伝子組み換え胚性LNを野生型の環境に移植し、臓器の発達や宿主細胞の動員と組織化を評価することができます。しかし、成体宿主の腎臓嚢の下に移植された胚性LNの成長が損なわれるため、この技術の使用は制限されます。

LNと脂肪沈着物は解剖学的に密接に関連しており、胚形成中に同時に発生します。私たちは最近、LN/脂肪組織の会合が、LNの間質細胞前駆細胞の供給に重要な役割を果たしていることを示しました。特に、LTβRを介したシグナル伝達は、脂肪形成を阻害し、代わりにLN間質細胞表現型¹⁴への成熟を促進することにより、脂肪細胞前駆細胞の運命を制御する。ここでは、発生中のLN中の脂肪組織由来細胞の追跡を可能にするLN脂肪パッドキメラの生成に基づく方法について説明します。この方法は、脂肪組織の異なるLN間質細胞集団への寄与を決定するのに役立ち、遺伝子改変マウス系統の組織の使用と組み合わせることで、異なるLN間質細胞サブセットの分化を制御するメカニズムをよりよく理解できるようになります。

Protocol

マウスは、英国内務省および地元の倫理委員会の規則に従って、バーミンガム大学の生物医学サービスユニットでSPF条件下で飼育および維持されました。このプロトコルに記載されているすべての手順は、地元の倫理委員会と内務省の両方によって承認されたプロジェクトライセンスの下でカバーされています。

1. 新生児LNの分離

1. 子宮頸部脱臼により新生児マウスを犠牲にします。
2. 頭を切片にし、胸部の上部から腹部の下部までハサミで体を開き、腹腔からすべての内臓(心臓、肺、肝臓、腸、腎臓、膀胱)を慎重に取り除きます。
3. RF10培地(10%ウシ胎児血清、100U / mlペニシリン、100mg / mlストレプトマイシン、2mM L-グルタミンを補充したRPMI1640培地)を含む90mmシャーレに体を移します。.このステップ以降、組織は無菌状態に保たれ、組織培養フードで取り扱われます。
4. 本体をRF10が入った新しい90mmシャーレに移します。
5. 解剖顕微鏡の下で、鼠径部の皮膚から腹膜を慎重に取り外します。鼠径部のLNは、脂肪パッドの3つの血管の交点に位置しています。
6. LNを慎重に取り外します。すべての脂肪組織が除去されていることを確認してください。LNをRF10メディアを含む50mmシャーレに移します。手順を続行している間、組織を氷の上に保ちます。

2. E18.5脂肪パッドの分離

1. 妊娠18.5日目(E18.5)にマウス胚を生成するには、ケージごとに雌マウスと雄マウスを一晩配置して、時限妊娠を設定します。午前中にマウスを分離し、膣栓を確認します(妊娠日E0.5)。
   1. 妊娠18.5日目に子宮頸部脱臼により、詰まった女性を安楽死させます。
   2. 胚を取り出し、RF10が入った90mmのシャーレに入れます。
2. このステップ以降、組織は組織培養フードで滅菌技術を使用して取り扱う必要があります。解剖顕微鏡の下で、頭部を切片にし、胸部から腹部の底部までハサミで胚を開き、体腔からすべての内臓(心臓、肺、肝臓、腸、腎臓、膀胱)を慎重に取り除きます。
3. 残っているすべての内臓組織から体をきれいにし、PBSで洗って、解剖をより困難にする可能性のある血液の痕跡をすべて取り除きます。
4. きれいな本体をRF10が入った新しい90mmのペトリ皿に移します。
5. 鼠径部の皮膚から腹膜を慎重に取り外します。鼠径部のLNは、脂肪パッドの3つの血管の交点に位置しています。
6. LNを慎重に取り外して廃棄します。キメラに使用される脂肪パッドがリンパ系間質細胞によって汚染されていないことを確認するために、LNを完全に除去することが非常に重要です。
7. 鼠径部脂肪パッドを取り外し、RF10培地が入った50mmのシャーレに移します。手順を続行している間、組織を氷の上に保ちます。

3. LN-fatパッドキメラの生成

1. in vitro臓器培養システムを調製^{する 15}.
   1. スポンジとフィルターの準備:これは事前に行うことができ、スポンジとフィルターは培養フード内のペトリ皿に滅菌して保管します。
      1. Vulkanアンダーラップを1〜1.5 cm^2個にカット
      します
      2. スポンジを蒸留水で2時間茹でます。
      3. スポンジを細胞培養フードで数時間乾燥させます。
      4. フィルターを20分間煮沸します。
      5. フィルターを細胞培養フードで数時間乾燥させます。
   2. 10%ウシ胎児血清、10 mM HEPES、1x MEM 非必須アミノ酸溶液、50 mM 2-メルカプトエタノール、100 U/mL ペニシリン、100 mg/ml ストレプトマイシン、および 2 mM L-グルタミンを添加した DMEM 培地を調製します。
   3. 50mmのペトリ皿に2mlの培地を加えます。
   シャーレの
   4. 底にスポンジを1つ並べます。スポンジの両面をメディアに沈めて濡らします。
   5. スポンジの上にフィルターを1つ置きます。フィルターは液体と空気の界面に配置されています。
2. 解剖顕微鏡下で、1つの新生児LNを1つの胚性脂肪パッドに慎重に再結合します。
3. LN脂肪パッドキメラをフィルターの上に置きます。
4. 蓋にいくつかの穴があり、湿度を確保するために底に水が入った長方形のプラスチックの箱にペトリ皿を移します。
5. 蓋を箱にテープで密封します。蓋の2つの穴は開いたままにしておきます。
6. ボックスを37°Cの細胞培養インキュベーターに5% CO₂で移します。ボックスを2時間平衡化させてから、蓋の穴をテープで塞ぎます。
7. 組織を少なくとも2日間インキュベートして、LNが脂肪パッドに付着し、腎臓カプセルの下に移すことができるようにします。

4. 宿主マウスの腎臓嚢下へのLN-fat Pad Chimeraの転写

1. フィルターからLN脂肪パッドキメラを採取し、宿主マウスの腎臓カプセルの下に移します。腎臓嚢移植法については、既に説明した¹⁶。

5. 転送されたLNの分離

1. 腎臓カプセルの下で3〜4週間後、LN脂肪パッドキメラを収穫する準備が整います。承認されたガイダンスを使用して宿主マウスを安楽死させます。
2. 宿主マウスから腎臓を取り出します。
3. 解剖顕微鏡下で、LN脂肪パッドキメラを分離し、LNを解剖します。

6. フローサイトメトリー解析のための転移LNの酵素消化

1. 酵素が臓器に浸透し、消化を促進するために、小さなハサミでLNに1つの切開を行います。
2. 600 μlの消化バッファー(RPMI 1% FCS、2.5 mg/ml Collagenase D、100 μg/ml DNase I)を含む1.5 mL Eppendorfに1つのLNを入れます。
3. 攪拌サーマルブロック上で37°Cで30分間インキュベートします。ピペットを上下に動かして、10分ごとに組織の解離を助けます。
4. 6 μl EDTA 0.5 Mをチューブに加え、ピペットで上下に動かして組織の解離を終了します。
5. 490 x gで5分間遠心分離します。
6. 一次抗体の組み合わせを含む染色溶液(PBS、0.1%BSA、5%ラット血清、5%マウス血清)に細胞ペレットを再懸濁します。
7. 氷上で30分間インキュベートします。
8. PBSで2回洗う
9. 必要に応じて、二次抗体と20分間インキュベートします。
10. PBSで2回洗ってください。
11. フローサイトメーターで解析します。

7. 免疫蛍光法による転移LNの解析

1. 凍結および凍結切片プロセス中のEYFP保存のための固定:LNをPBS、4%PFA、10%スクロースの溶液に入れ、3〜4時間放置します。
2. アルミホイルの小片に冷たいOCTコンパウンドを1滴ずつ入れます。気泡を避けてください。液滴の中央に液体を入れずにLNを慎重に置きます。
3. アルミホイルをドライアイスの上に置いて臓器を凍結します。
4. クライオスタットを使用して、8〜10μmの切片を余分な接着剤のスライドガラスにカットします。スライドを2時間乾燥させてから、-20°Cで保管します。
5. 染色手順は、使用する一次抗体によって異なり、以下のプロトコールから最適化することができます。一次抗体の組み合わせを含む染色溶液(PBS、1% BSA)で切片を染色します。
6. 加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベー
トします。
7. PBSで5分間2回洗浄します
8. 二次抗体と1時間インキュベートします。
9. PBSで5分間2回洗浄します。
10. DAPIを含む封入メディアにスライドをマウントします。
11. 蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して画像をキャプチャします。

Results

移植から3週間後、腎臓からLN/脂肪パッドキメラが回収されます。キメラは、それ自体の脂肪パッド内の正常なLNと非常によく似ており、LNは脂肪組織の中心に見えます(図1)。LNが特定できない場合は、腎臓への移植中にLNが失われた可能性があります。LNの発生に潜在的に重要な遺伝子の役割を評価する場合、回収されたLNは非常に小さく、見つけるのがより困難になる可能性があります。これは、LTβR^-/-マウス由来の脂肪組織が新生児LNsに再結合する場合^である14。

LNを慎重に単離することで、EYFP⁺脂肪由来細胞の子孫をさらに分析することができます。LNの凍結切片および免疫蛍光分析により、EYFP⁺脂肪由来細胞がLNに移動し、そこでGp38⁺ERTR-7⁺ LN間質細胞ネットワークに寄与することが明らかになりました(図2A)。フローサイトメトリー解析により、LN間質細胞の重要な画分が局所EYFP...

Discussion

この記事では、発生中のLNに対する脂肪組織前駆細胞の寄与をアッセイおよび定量化する方法と、それらの子孫の分析を可能にする2つの技術を紹介しました。胚性脂肪パッドと新生児LNの解剖は繊細であり、実際のLN脂肪パッドキメラを生成する前に、多くの練習によって得られた手作業のスキルが必要です。解剖の品質を制御するために、ファットパッドとLNに対してフローサイトメトリー分析を実行できます。 胚性脂肪パッドの調製にはリンパ節がなく、CD45⁺CD4⁺IL-7Ra⁺ リンパ組織誘導細胞が含まれていてはなりません。新生児のLN製剤は、脂肪組織を完全に含まず、CD45-CD31-ICAM-1、^高VCAM-1、^高リンパ組織組織細胞^6,13-14を高の割合で含んでいる必要があります。汚染のリスクを減らすために、組織培養と手術の標準的な無菌技術に従う必要があります。

未熟なLN間質細胞へのLTβRの関与は、完全に成熟したLN間質...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-メルカプトエタノール	Σ	M3148
50 mm Sterilin ペトリ皿	アップルトンウッズ	SC265
90 mm Sterilin ペトリ皿	アップルトンウッズ	SC260
接着スライド	Surgipath	00202
アンチマウス CD31 eFluor 450	eBioscience	48-0311
アンチマウス CD4 アレクサ 647	eBioscience	51-0041
抗マウス CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
抗マウス IgM ローダミン レッド	ストラテック	715-296-020-JIR
抗マウス ポドプラニン PE/Cy7	バイオレジェンド	127411
抗マウス ポドプラニン精製	eBioscience	14-5381
コラゲナーゼ D	ロシュ
DMEM ミディアム	シグマ	D5671
DNase I	シグマ	DN25-1G
デュモン #5 鉗子 イノックス バイオロジー	FST	11252-20	胚および新生児解剖用の極細鉗子
EDTA溶液 0.5 M	シグマ	E7889
ERTR-7	生合成
ウシ胎児血清	シグマ	F9665
微細虹彩はさみストレート11cmFST14090-11			剖HEPES溶液用の小さなはさみ
	シグマ	H0887
イソポアメンブレンフィルター0.8 μm ATTP	Millipore	ATTPO 1300
L-グルタミン溶液	Sigma	G7513
MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
ペニシリン-ストレプトマイシン	Sigma	P4458
蓋付きプラスチックボックス	ワトキンスとドンカスター	E6052	in vitro臓器培養用のサンドイッチボックスです。蓋に2つの穴を開けて、CO2インキュベーターでガス交換できるようにします。
RPMI 1640 ミディアム	シグマ	R0883
スポンジ バルカン アンダーラップ	パターソン メディカル	004383
実体顕微鏡	ライカ	MZ95	ズーム付き解剖顕微鏡
サーモミキサー	エッペンドルフ	5436
ベクタシールド 埋込媒体 DAPI	付き Vector Laboratories	H-1200