野生動物は、一般的にさまざまな蠕虫に寄生されます。蠕虫には、主に "回虫" (線虫)、"トゲトゲミズ" (Acanthocephalans)、"吸虫" (吸虫)、"条虫" (条虫) の 4 種類があります。ここでは、脊椎動物から蠕虫を採取する方法と、蠕虫の保存方法と分類学的識別方法について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
野生動物は一般的に広範囲の蠕虫に寄生されます。蠕虫の4つの主要なタイプは、「回虫」(線虫)、「とげのある頭の虫」(acanthocephalans)、「吸虫」(吸虫)、「条虫」(条虫)です。蠕虫を収集するための最適な方法は、ほとんどの蠕虫がまだ生きているため、4〜6時間以内に死んだ宿主を調べることです。徹底的な剖検を行い、すべての主要な臓器を検査する必要があります。臓器を流水で106μmのふるいにかけ、実体顕微鏡で内容物を検査します。すべての蠕虫がカウントされ、代表的な数が固定されます(70%エタノール、10%緩衝ホルマリン、またはアルコール-ホルマリン-酢酸のいずれか)。種の同定のために、蠕虫はラクトフェノール(線虫および小さなアカントセファラン)で除去されるか、ハリスのヘマトキシリンまたはセミコンのカーミンを使用して染色(吸虫、条虫、および大きなアカントセファラン)されます。蠕虫は、さまざまな構造(例えば、線虫の雄の針状体や条虫のロステラム)を調べることにより、種に鍵を当てられます。ここで概説するプロトコルは、任意の脊椎動物に適用することができます。彼らは、さまざまな臓器を認識し、蠕虫を他の組織の破片や腸の内容物と区別できるようにするための専門知識を必要とします。収集、保存、染色は、最小限の機器と試薬で済む簡単な技術です。分類学的な同定、特に種の同定は、非常に時間がかかる場合があり、専門家への標本の提出やDNA分析が必要になる場合があります。
概要
脊椎動物は、4つの主要な群の蠕虫(ワーム)に寄生されます。吸虫、または吸虫、および条虫、またはサナダムシの2つのグループは、Phylum Platyhelminthesに分類されます。他の2つのグループは、線虫、または回虫(線虫)とacanthocephalans、またはとげのある頭の虫(Acanthocephala)です。これらの寄生虫の多くは、野鳥や哺乳類の罹患率と死亡率の原因として文書化されています1,2。
ほとんどの蠕虫は、複数の宿主が関与する複雑なライフサイクルを持っています1,2 .例えば、吸虫には1つまたは2つの中間宿主(通常は無脊椎動物)と最後の宿主があります。サイクルを完了するためには、すべての宿主が利用可能であり、したがって成虫の蠕虫が最終宿主(この原稿のトピックです)に存在する必要があります。したがって、一部の蠕虫種の蠕虫の有病率と強度には季節変動が発生する可能性があり、特定の宿主のアウナの完全な蠕虫を捕捉するには長期的な監視が望ましいことに留意することが重要です。
蠕虫を収集するための最適な方法は、安楽死させた宿主を調べることです。これにより、蠕虫がまだ生きている間に蠕虫を収集し、適切なリラクゼーションと固定が可能になります。24時間以上死んだ宿主からの物質、または検査のために凍結および解凍された宿主からの材料は、多くの場合、劣っており、識別が困難です。凍結または形式化された宿主からの吸虫と条虫は、しばしばひどく収縮し、吸虫の口腔棘や条虫の肩甲骨のフックなど、識別に重要な構造を失っています。しかし、現実には、最近、脊椎動物の宿主から入手可能なほとんどの材料は冷凍または保存されています。
蠕虫のDNA配列情報を含むデータベースは急速に成長しており、したがって分類学的同定はすでに多くの種で可能です。したがって、蠕虫は可能な限り潜在的なDNA分析のために保存する必要があります。しかし、検体がホルマリンに固定されていると、良質なDNAを得ることはできません。ここで概説した蠕虫の収集と殺処分の方法は、DNA抽出と遺伝子分析に適した材料をもたらします。
以下では、蠕虫の収集のために脊椎動物(両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類、魚類の単属吸虫は含まない)の剖検方法に関する詳細な方法について説明し、その後、分類学的同定のために脊椎動物を保存し、処理する方法についての手順を説明します。
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プロトコル
次の実験で使用された動物は、ロードキルとして死んでいるのが発見されました。
1. 蠕虫採取のための動物剖検と主要臓器のスクリーニング
- 動物を平らな面に置き、虫眼鏡で耳、口腔、目を含むすべての外部開口部を調べて、線虫(丸い)と吸虫(平らでセグメント化されていない)の存在を確認します(図1を参照)。
- 鳥を扱う場合は、解剖する前に水道水で洗って羽を湿らせてください。
- 鋭利な刃物またはナイフを使用し、一対の解剖鉗子を使用して、臓器を破裂させないように注意しながら腹腔を切開します。甲羅が硬いカメの場合は、ハンドヘルドソーを使用して、胸部と腹部の棘の間の橋部分の骨を切り裂きます。
- 上記のように胸腔を開きます。大型の動物の場合は、肋骨を切断するために骨カッターまたは小型の手持ちのこぎりが必要になるかもしれません。
- 鳥を扱う場合は、臓器を摘出する前に、その場で気嚢を調べてください。必要に応じて虫眼鏡を使用してください。
- 両方の空洞にフィラリア性回虫と大きな吸虫がないか調べます。
- 腹腔から胃腸管を切除する前に、食道の始まりの近くに糸を結び、大腸(直腸)の端に別の糸を結びます。
- 実体顕微鏡(10-30X)で検査するために、次の胸部臓器をペトリ皿(または臓器が大きすぎる場合はガラストレイ)に分けます:心臓と主要な血管、気管、肺。
- 肝臓、胆嚢と胆管、膵臓、脾臓、腎臓、膀胱を取り外し、手順1.8で説明されているように検査します。
- 消化器系全体を取り外し、各セクションをガラス皿/トレイに入れます。
- 臓器を摘出した後、0.9%生理食塩水で満たされたホースまたは噴出ボトルで体腔を106μmメッシュのふるいに洗浄し、実体顕微鏡でふるいの内容物にフィラリア虫または吸血虫の有無がないか調べます。
- 各消化管切片をハサミで開き、粘膜をこすり落とし、大きな寄生虫(>1 cm)の存在を注意深く調べます。必要に応じて虫眼鏡を使用してください。アカントセファランの吻は、腸の壁に深く埋め込まれていることが多く、鉗子や小さなハサミで組織から慎重にからかう必要がある場合があります。
- 開いた各切片を流水の下に置き、ステップ1.11で説明したように、すべての内容物を106μmのふるいに洗います。
- 心臓と主要な血管(肺と大動脈)、気管、尿と胆嚢を開き、同様に内容物を調べます。
- 鋭利な刃と鉗子を使用して、肺、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓などの固形臓器を切り裂き、からかいます。ステップ1.11で説明したように、流水で106μmのふるいに洗います。
- 見つかった寄生虫の種類、各種類の数、およびそれらが見つかった臓器を記録します。固定および染色方法を以下に示します。
- 鉛筆で書かれた無地のインデックスカードの小片を置いて、バイアル/ジャーにラベルを付けます(インクと罫線入りのインデックスカードはアルコールに「流れ」、標本を染色します)。
2. 蠕虫の保存
- 後の遺伝学的研究のために保存する必要がある蠕虫の場合は、それらを80〜90%エタノール(グリセリンなし)に直接入れます。エタノールは、95%エタノール、できれば試薬グレード(表1)を希釈して製造する必要があります。ホルマリンはDNAを分解して使用不能な状態にするため、これらの標本をホルマリンにさらさないでください。
- 生理食塩水の滴にガラス顕微鏡スライド上に生きた吸虫を置き、ガラスカバースリップを置き、生理食塩水を沸騰させずにスライドを炎の上に置きます。
- スライドをAFA(アルコール-ホルマリン-酢酸、表1を参照)が入ったシャーレに落とし、カバースリップを浮かせます。
- AFAで1〜数日間固定し、水道水ですすぎ、70%エタノールを充填した5mlガラスバイアル(または寄生虫のサイズと量によってはより大きなガラスバイアル/ジャー)に移して長期保存します。
- 死んだ吸虫をAFAまたは10%緩衝ホルマリンで48時間固定し、その後、70%エタノールを充填したバイアル/ジャーに移して長期保存します。
- ペトリ皿でライブ条虫をリラックスさせ、沸騰近い水を注ぎ、70%エタノールで満たされたバイアル/ジャーに移して長期保存します。 テン
- グが完全にエバートされるまで冷蔵庫(~4°C)の水道水に1〜数時間ペトリ皿に入れて、生きたアカントセファランをリラックスさせます(これには最大24時間かかる場合があります)。70%エタノールまたはAFAを充填したバイアル/ジャーに移して長期保存します。
- 死んだ条虫と先頭虫は、死んだ吸虫と同じように扱います(上記を参照)。
- 生きた小さな線虫(<5 mm)または壊れやすい線虫(例:. トリコストロンギリド、毛細血管)を高温(沸騰に近い)70%エタノールで殺し、70%エタノールと5%グリセリン(表1)を添加したバイアル/ジャーで保存して、蒸発の場合にワームを保存します。
- 中型から大型(>5 mm)の線虫(例:. 回虫、スピルリド、オキシウリド、フィラリド)を冷たい氷酢酸(表1)を入れたシャーレに入れ、15分後に70%エタノールと5%グリセリンで満たされたバイアル/ジャーに移します。.酢酸はこのように繰り返し使用できます。
- 死んだ線虫を70%エタノールと5%グリセリンで満たされたバイアル/ジャーに直接置きます。
3. 蠕虫の分類学的同定
- ヘマトキシリンをアルコールに溶かし、硫酸アンモニウムアルミニウムを水に熱で溶かして、ハリスヘマトキシリンを調製します。両方の溶液を混合し、沸騰させます。
- ヨウ素酸ナトリウムを加え、室温に戻した後、フィルター(541濾紙)溶液を2〜3分間沸騰させます。
- 吸虫、条虫、および棘頭虫を希釈(1:10)したハリスヘマトキシリンまたはセミチョンカーミンに一晩放置することにより、オーバーステインします(表1を参照)。
- 臓器が見えるまで70%酸性エタノールを使用して汚れを落とします(数秒から1時間以上かかる場合があり、注意深く観察する必要があります)。
- 検体を70%塩基性エタノールに少なくとも30分間移すことにより、脱染色を停止します。次に、一連の段階的なエタノール(80%、95%、100%)でそれらを脱水し、キシレンまたはサリチル酸メチルで透明にします。
- カナダバルサムを一滴加え、カバースリップを加えた後、顕微鏡スライドに標本をマウントします。一晩乾かします。
- 中小規模の線虫および表皮動物を、カバースリップ付きの顕微鏡スライド上にラクトフェノールを一時的にマウントして15〜30分間透明にします。
- 大型の線虫(回虫類およびスピルリド類)およびアカントセファランには、80%フェノールを最大60分間使用します。光学顕微鏡(40-400X)で、より小さな構造(オスの針状体とフック)を評価します。
- 特殊な構造物の検査には、次の方法を使用します。
- 条虫の場合は、肩甲骨を切り取り、ラクトフェノールと「スカッシュ」で顕微鏡スライドに置き、ロステラフックを測定およびカウントするためのカバースリップを使用します(図1Bを参照)。
- 線虫の場合は、前端を切り取り、顕微鏡スライドに面して数滴のラクトフェノール(カバースリップなし)またはグリセリンゼリーに永久マウント(カバースリップ付き)を取り付け、光学顕微鏡(35〜400X)でマウスパーツを観察します(図1Dを参照)。
- 大型の線虫の尾を切り取り、ラクトフェノール製の顕微鏡スライドにカバースリップを取り付けて、光学顕微鏡下で雄の腹側乳頭と針状体の形態を観察します(図1Dを参照)。
- 一次文献と次のような標準的な分類学の参照を組み合わせて、種の寄生虫を特定します。
- 吸虫:Yamaguti(1958、1971)3,4およびGibsonら。5-7
- アカントケファラン:ヤマグティ8
- セストデス:ヤマグティ9、シュミット10、およびカリルら。11 名
- 線虫:Yamaguti12およびAnderson et al.13 名
4. 米国国立寄生虫コレクションの寄生虫の保管庫
- 代表的な蠕虫標本を米国国立寄生虫コレクション(USNPC)に寄託します。これは、ほとんどの寄生虫ジャーナルに必須です。投稿後、各蠕虫種には、原稿に含めるためのアクセッション番号が割り当てられます。
- 標本を提出する際には、次の情報を含めてください:1)寄生虫の学名。2)宿主情報(種、地理的位置の経度/緯度座標)3)宿主に見つかった臓器。4)標本を収集した人の名前と収集日。5) 使用した固定剤、染色剤、またはクリア剤/封入剤の種類6)他のコレクションの場所(博物館番号とアクセッション番号)追加の標本が他の場所で提出された場合。7)出版物とジャーナルに関する情報。これらのデータも、標本と一緒に、別々のカバーで送信する必要があります。
- 試験片は耐衝撃性吸収材を使用した丈夫な容器に包装します。ガラスバイアルにテープ/パラフィルムスクリューキャップを取り付け、各バイアルを別々のビニール袋に入れます。スライドを紙で包み、衝撃吸収材を挟んだスライドボックスに入れます。
- 米国国立寄生虫コレクション、USDA、ARS、ANRI、ビル1180、BARC-East、10300ボルチモアアベニュー、ベルツビル、MD 20705-2350に、標本と標本に関する情報が記載された別の手紙を発送してください。
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結果
上述の手法を用いて、2007年から2011年にかけてモンタナ州ミズーラ郡において、シロハラトガリネズミ（Sorex cinereus）の蠕虫相調査を実施した。ピットフォールトラップで捕獲した計56匹のトガリネズミを、死後2時間以内に検査した。全体の感染率は96%であり、寄生虫がいなかったのはわずか2匹であった。条虫類9種、線虫類6種の計15種の蠕虫が同定された。そのうち、条虫類のStaphylocystoides属の1種は、これまで記載されていない新種であった。感染が認められた器官は、小腸（条虫9種、線虫3種）、胃（線虫1種）、肺（線虫1種）、および膀胱（線虫1種）であった。感染個体1匹あたりの総感染強度は7〜234匹の範囲であった。種豊富度（感染個体1匹あたりの蠕虫種数）は1〜8種で、平均は4.1種であった（図2）。
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ディスカッション
貧弱な資料に基づいて、属であっても蠕虫寄生虫を特定することは非常に困難です。特にセストドと吸虫は、宿主の死後、かなり急速に死に、悪化する傾向があります。条虫の分類は、凍結物質で失われることが多いロスターフックの数、サイズ、形状に大きく依存します。同じことが、棘口動物や異糸動物など、口腔吸盤の周囲に棘がある特定の吸虫にも当てはまり、これらも頻繁に失われます。キューティクルが厚いため、線虫と棘頭類は少し丈夫ですが、それでも収縮したり、テングが引っ込められたりする可能性があります。したがって、可能な限り新鮮な材料を入手することの重要性は、どれだけ強調してもしすぎることはありません。最適なのは、生きた宿主を捕獲し、安楽死させ、直ちに検査する必要があります。それができない場合は、宿主は死後3〜4時間以内に検査されるか、できるだけ早く凍結する必要があります。宿主を採取した直後に腸管を除去し、液体窒素で急速凍結することで、優れた材料が得られました。少数の宿主でも新鮮に検査し、蠕虫を適切に識別できれば、その後の冷凍材料から収集された種の選別が可能になる可能性があります。蠕虫は死後宿主内を移動する可能性があり、剖検中に寄生虫の位置を説明する際にはこれを考...
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開示事項
開示するものは何もありません
謝辞
このビデオの制作のために、蠕虫の収集に使用された標本を提供してくださったパデュー大学のインディアナ州農務省APHIS野生生物サービスプログラムの疾患生物学者であるJoe N. Caudell博士に感謝します。ジェニファー・セラフィンは、すべての化学溶液を準備しました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Fixing | |||
| アルコール-ホルマリン-酢酸(AFA) | フィッシャーサイエンティフィック | A407-1(エタノール) F75F-1GAL(ホルムアルデヒド) BP2401500(氷酢酸) | エタノール85%(85 ml)+ホルムアルデヒド37%(10 ml)+氷酢酸(5 ml) |
| 殺傷および長期保存用エタノール | フィッシャーサイエンティフィック | A407-1 | エタノール100%(70 ml)+蒸留水(30 ml) |
| 固定およびDNA研究用エタノール | フィッシャーサイエンティフィック | AC61511-0010 | タノール80-90%(80-90 ml)+蒸留水(20-10 ml)、それぞれ |
| ホルマリン緩衝フィ | ッシャーサイエンティフィック | SF100-4 | マリン10%(10 ml)+蒸留水(90 ml) |
| グリセリンアルコール | ッシャーサイエンティフィック | A407-1(エタノール) AC15365-1000 (グリセリン) | エタノール 70% (95 ml) + グリセリン (5 ml) |
| <強力>クリアリング、染色、マウント | |||
| エタノール 染色中の脱水用 | フィッシャー・サイエンティフィック | A407-1 | エタノール 80%、95%、100% (80 ml、95 ml、100 ml) + 蒸留水 (20 ml、5 ml、0 ml) |
| ラクトフェノール | フィッシャー・サイエンティフィ | R400-27 | - |
| フェノール | フィッシャー・サイエンティフィ | ックA931I-1(フェノール) A407-1(エタノール) | フェノール100%(80ml)+エタノール100%(20ml) |
| ハリス'ヘマトキシリン | フィッシャーサイエンティフィック | S25347 (ヘマトキシリン) A407-1 (エタノール) A567-500 (硫酸アンモニウム) S25553 (ヨウ素酸ナトリウム) | ヘマトキシリン (5 g) + エタノール 100% (50 ml) + 硫酸アンモニウム (100 g) + ヨウ素酸ナトリウム (0.37 g) + 蒸留水 (1,000 ml) |
| セミチョン's 酢酸カーミン | フィッシャー サイエンティフィック サイエンティ | BP2401500 (氷酢酸) S25236 (カーミン) A407-1 (エタノール) | 氷酢酸 (100 ml) + カーミン (1.5 g) + 蒸留水 (100 ml)。沸騰水浴で15分間加熱し、冷まします。ストック溶液を作るためのフィルター。染色のために70%アルコールと1:2を混ぜます。 |
| キシレン | フィッシャーサイエンティフィック | X4-4 | 化学薬品ヒュームフードの下でのみ使用してください。 |
| サリチル酸メチル | フィッシャーサイエンティフィック | S25437 | - |
| エタノール塩基性 | フィッシャーサイエンティフィック | A407-1(エタノール) S25159A(濃縮水酸化アンモニウム) | エタノール70%(100 ml)+水酸化アンモニウム(0.1 ml) |
| エタノール酸 | フィッシャーサイエンティフィック | A407-1(エタノール) SA9233-100(塩酸) | タノール70%(99.5 ml)+ 塩酸(0.5 ml) |
| カナダバルサム | フィッシャーサイエンティフィック | B10-100 | - |
参考文献
- Atkinson, C. T., Thomas, N. J. Parasitic Diseases of Wild Birds. Hunter, D. B. , John Wiley & Sons, Blackwell Press. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
- Parasitic Diseases of Wild Mammals. Samuel, W. M., Pybus, M. J., Kocan, A. A. , Second Edition, Iowa State University Press. Ames, Iowa, USA. (2001).
- Yamaguti, S. Parts 1 and 2. The Digenetic Trematodes of Vertebrates. Systema Helminthum. I, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1958).
- Yamaguti, S. Synopsis of Digenetic Trematodes of Vertebrates. I and II, Keigaku Publishing Company. Tokyo, Japan. (1971).
- Gibson, D. I., Jones, A., Bray, R. A. Keys to the Trematoda. 1, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2002).
- Jones, A., Bray, R. A., Gibson, D. I. Keys to the Trematoda. 2, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2005).
- Bray, R. A., Gibson, D. I., Jones, A. Keys to the Trematoda. 3, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2008).
- Yamaguti, S. Acanthocephala of Vertebrates. Systema Helminthum. V, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1963).
- Yamaguti, S. The Cestodes of Vertebrates. Systema Helminthum. II, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1959).
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- Yamaguti, S. The Nematodes of Vertebrates. Parts 1 and 2. Systema Helminthum. III, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1961).
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