方法論記事

沈殿形成ポリエチレングリコールマイクロゲルの特性は、反応物の分子量によって制御されます

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DOI：

10.3791/51002

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2013年12月23日

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1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron, 2Saint Vincent Saint Mary's High School

この記事について

サマリー

この研究は、光重合沈殿反応によるポリ(エチレングリコール)(PEG)マイクロゲルの形成について説明しています。PEG分子量を大きくすると、マイクロゲルの直径と膨潤率が増加しました。PEGマイクロゲル沈殿反応への単純な適応は、薬物送達媒体および組織工学足場としてのマイクロゲルの将来の応用のために探求されています。

要約

この研究は、光重合沈殿反応によるポリ(エチレングリコール)(PEG)マイクロゲルの形成について説明しています。沈殿反応は、従来のマイクロスフェア製造技術に比べていくつかの利点があります。エマルジョン、懸濁、および分散技術とは対照的に、沈殿によって形成されたマイクロゲルは、有機溶媒または安定剤を使用せずに、均一な形状およびサイズ、すなわち低い多分散指数を有する。沈殿反応の穏やかな条件、マイクロゲルのカスタマイズ可能な特性、および注入用の低粘度により、in vivo目的に適用できます。他の作製技術とは異なり、マイクロゲルの特性は、開始ポリマーの分子量を変更することで変更することができます。開始PEG分子量を増加させると、マイクロゲルの直径と膨潤率が増加しました。マイクロゲル架橋中に分子をカプセル化するなど、さらなる修飾が提案されています。PEGマイクロゲルビルディングブロックへの単純な適応は、薬物送達媒体および組織工学の足場としてのマイクロゲルの将来の応用のために探求されています。

概要

定義上、マイクロゲルは、等価直径が約0.1〜100μm1の任意の形状のハイドロゲルです。そのサイズと特性により、高分子マイクロゲルは、薬物送達および組織工学システムを進歩させるための汎用性の高いツールを提供します。バルクハイドロゲルは、組織工学の足場や薬物送達媒体として広く利用され、大きな成功を収めています2-4が、近年の足場のマイクロスケール制御への移行は、マイクロゲルを建築用足場のベース材料として使用するユニークな機会を提供しています。さらに、マイクロゲルは細胞間相互作用に対して表面積と体積の比率が高く、溶液中での粘度が低いため、注入に最適です。最後に、マイクロゲルは、所望のマイクロゲル特性に応じて様々な方法で多数のポリマーを使用して形成することができ、様々な用途に対して高度にカスタマイズ可能になります。

マイクロゲルを製造する技術には、懸濁重合、エマルジョン重合、分散重合、または沈殿重合が含まれます。エマルジョン重合および懸濁重合には、通常、マイクロゲルを形成するために有機溶媒と界面活性剤または安定剤が必要です。これらの方法の性質により、高度に分散した粒度分布が得られます5。分散反応と沈殿反応により、粒子の多分散性が低くなります6。しかし、分散重合によって形成される粒子は、依然として安定化剤の使用を必要とする6。沈殿反応によって形成されるマイクロゲルは、安定剤や界面活性剤を使用せずに均一なサイズと形状の粒子を形成するという点で独特です。マイクロゲル形成は、エンタルピー沈殿またはエントロピー沈殿7によって連続相から分離したポリマー鎖を成長させるときに達成される。沈殿重合はしばしば高温で行われ、これは、溶媒8へのポリマーの溶解度を低下させるkosmotrophic塩の使用によって低下させることができる。この研究は、生物学的に適合した条件下での光重合沈殿反応によってポリ(エチレングリコール)(PEG)から形成されたマイクロゲルに焦点を当てており、マイクロゲルの特性を変更し、薬物送達アプリケーションのために分子をカプセル化するためのバリエーションがあります。

PEGハイドロゲルを用いた先行研究では、重合条件がハイドロゲルの物理的および機械的特性、すなわちハイドロゲルの含水率と圧縮弾性率3,9に大きく影響することが示されています。これらの架橋材料は、Flory10で記述された構造特性と物理的特性の関係を利用して、架橋ヒドロゲルを特定用途に合わせて調整できるため、興味深いものです。これらの原理は、マイクロゲルについても同様です。沈殿物形成PEGマイクロゲルは、再生医療の可能性を秘めていることがわかっています11が、将来の生物医学的応用のためにそのレパートリーを強化するためには、マイクロゲルの特性をさらに調査する必要がありました。本稿では、これらの材料を薬物送達や再生医療にさらに発展させるために重要となる、沈殿反応によるマイクロゲルの作製方法と、微粒子径、多分散指数(PDI)、密度、膨潤などの特性を変化させる手順について述べる。

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プロトコル

1. マイクロゲル製造で使用する溶液の準備

  1. 沈殿反応を開始する前に、必要な溶液を作り、37°Cに温めます。必要な溶液には、0.5%光開始剤、1.5 M Na2SO4、緩衝液、200 mg/ml PEG-ジアクリレート(PEG-DA)溶液、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が含まれます。注:すべてのPEG前駆体を公表された方法に従ってアクリル化し、使用までアルゴンの下で-20°Cで保存してください12。
  2. 光開始剤を秤量し、脱イオン(DI)H2Oに溶解して0.5(w/v)%溶液にします。溶液を紫外線にさらされないように保護することが重要です。
    1. 完全に溶解した後、0.22μmフィルターでろ過します。この溶液は事前に作成し、暗所で4°Cで保存することができます。注:攪拌しながら溶液を40°Cに加熱することにより、攪拌時間を約1時間に短縮します。
  3. 1x PBSの場合、1 L DI H2Oに1錠PBSを添加し、0.22 μmフィルターでろ過します。PBSは事前に作成し、4°Cで保存することができます。
  4. 39.4 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH = 7.4)を測定し、612 μlのトリエタノールアミン(TEOA)と260 μlの6 M塩酸(HCl)を加えます。注:TEOAは非常に粘性があります。ピペッティングする前にTEOAを37°Cに予熱します。
    1. バッファーのpHを約7.7になるように調整し、0.22μmフィルター(最終pH~7.8)でろ過します。緩衝液はスケールアップし、事前に製造し、37°Cで保存することができます。
  5. 毎回、反応を開始する前にPEG-DA溶液を調製し、溶液を保存すると反応性の低下が観察されています。PEG-DAを秤量し、PBS/TEOA/HCl緩衝液を最終濃度200 mg/mlまで加えます。注:緩衝液をゆっくりと加えて、PEG濃度を慎重に制御します。なぜなら、PEGは溶液中で膨潤するためです
    注:このソリューションは高度にカスタマイズ可能です。マイクロゲルのカスタマイズには、PEGの開始分子量を変更してマイクロゲルの特性を変更する方法、分解性PEG前駆体を使用して分解性マイクロゲルを製造する方法、生物学的に無菌なマイクロゲルのすべての溶液を滅菌ろ過する方法、層流フードでの形成プロセスを完了する方法、最後にPEG溶液に官能基を組み込んで表面に官能基を追加する方法などがあります。
  6. Na2SO4 を秤量し、DI H2O に溶解して 1.5 M 溶液にします。最良の結果を得るには、反応を開始する直前に硫酸ナトリウム溶液も作る必要があります。
    1. Na2SO4が完全に溶解するまで溶液を加熱し、渦巻きにします。必要に応じて0.22μmフィルターを通してろ過します。

2. マイクロゲル製造

  1. 127.5 μlのPBS/TEOA/HClバッファー、10 μlの0.5%光開始剤、および25 μlの200 mg/mL PEG溶液を、マイクロゲルが形成されるチューブ(通常は2 mLの微量遠心チューブ)に入れます。
    1. これらのチューブを1.5 M Na2SO4溶液とともに37°Cに加熱します。
    2. 加熱しながらチューブを混合します。注:このマイクロゲルプロトコールはスケールアップ可能です。
  2. 分子をマイクロゲルにカプセル化するには、目的の分子(オボアルブミンなど)をPBS/TEOA/HClバッファー、光開始剤、およびPEG溶液に加えます。架橋後、分子はマイクロゲルネットワークに閉じ込められます。
  3. 各マイクロゲル反応を一度に1つずつ完了させます。最初のチューブに1.5 M Na2SO4 87.5 μlを加えます。
  4. チューブをピペッティングで3〜5回混合し、または30秒待ちます。混合後、塩分濃度は均一に分布し、溶液は透明でなければなりません。
  5. チューブをUVライトの下に置き、30秒間架橋します。架橋に続いて、溶液の上に曇った層があるはずで、この層にはマイクロゲルが含まれています。反応スキームについては、図1を参照してください。
  6. 遠心分離時に750 μl PBSを加えてペレット状にし、よく混ぜ合わせてください。
  7. マイクロゲルを4,000 x gで2分間遠心分離してペレットを形成し、上清をPBSと交換することにより、マイクロゲルを5回洗浄します。注:バッファー交換中にマイクロゲルペレットを乱さないでください、すべての上清を除去することができない場合があります。

3. マイクロゲルのサイズと多分散性

  1. 1 mLのDI H2Oで遠心分離して形成したペレットから30 μlのマイクロゲルをピペットで移します。最良の結果を得るには、マイクロゲル溶液をウォーターバスソニケーターで1時間(50-60Hzおよび1.4A)超音波処理するか、激しく混合してマイクロゲルを懸濁します。
  2. 15 μlのマイクロゲル溶液を清潔なスライドガラスにピペットで移し、#1.5カバースリップを上に置きます。スライドとカバースリップを実験室のティッシュに裏返し、スライドを押し下げて余分な溶液を取り除き、マイクロゲルが単層にあることを確認します。
  3. DIC 100X オイル対物レンズを使用して、マイクロゲルの画像を数枚撮影します。通常、サンプルごとに5枚の画像が撮影され、バッチごとに3つのサンプル、合計15枚の画像が推奨されます。注:現在までにバッチ間の変動は観察されていません。
  4. マイクロゲルを測定して、代表的な直径を求めます。
  5. 次の体積ベースの方程式を使用してPDIを計算します(Nはマイクロゲルの総数、Viはマイクロゲルiの体積
    6. )。

4. マイクロゲル密度

  1. デキストラン7、6、5、4、3、および1(w/v)%溶液をDI H2O中に調製して、マイクロゲル密度を測定します。これらの密度は、それぞれ1.022、1.020、1.018、1.016、1.014、および1.010 g / cm3であると計算されました。
  2. 1 mLの7%デキストラン溶液を15 mLの遠心分離チューブに加えます。
    1. 6%デキストラン溶液1mlをゆっくりとピペットで動かし、7%デキストランの上に明確な層を形成します。.
    2. 5分間待ってから、5%溶液1mlを追加します。
    3. すべてのデキストラン溶液がデキストラン濃度が減少する順に層状になるまで続けます。.
  3. 1%デキストラン溶液の上にマイクロゲルを慎重に重ねます。
  4. グラジエントを4,000 x g、5°Cで10分間遠心分離します。遠心分離後のマイクロゲルの位置により、密度13を簡単に計算できました。

5. マイクロゲル平衡膨潤

  1. 平衡膨潤(48時間)後の質量として定義されるマイクロゲルの膨潤質量(Ms)を測定するには、まずマイクロゲルをDI H2Oで5回洗浄し、事前に秤量したマイクロ遠心チューブで最低48時間膨潤させます。
  2. マイクロゲルを4,000 x gで10分間遠心分離します。
  3. すべての上清を取り除き、濡れた塊を記録します。ろ過方法を使用して、余分な水がすべて除去され、より正確な結果が得られるようにします。
  4. マイクロゲルを-80°Cで凍結し、凍結乾燥して一定の質量にすることで、乾燥質量(Md)を得ます。
  5. マイクロゲル中の水分含有量をWater% = (Ms - Md) / Md x 100で計算します。
  6. ポリマー含有量をPolymer% = 100 - Water%で決定します。
  7. SASとn因子ANOVAおよびTukeyポストホック検定を使用して、すべてのデータに対して統計分析を実行します。p<0.05 の場合、違いは注目されます。

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結果

マイクロゲルのサイズは重合条件に依存します。図 2Aは、PEGの開始分子量および架橋時間の増加に伴い、マイクロゲルの直径がどのように増加するかを示しています。さまざまな分子量を用い、30秒間架橋させてサイズ測定に使用したマイクロゲルの代表的な画像を図 2C-Gに示します。分子量3,000 DaのPEGでは、UV照射時間を30〜600秒に増加させると、マイクロゲルの平均直径は1.65±0.26から2.20±0.54 μmに増加しました（図 2B）。UV照射時間を30秒に固定し、分子量を3,000〜10,000 Daに増加させると、マイクロゲルの直径は1.65±0.26から2.17±0.33 μmに増加しました（図 2A）。3,000、4,000、および4,600 Daの分子量間では、有意な差は認められませんでした。沈殿形成によるマイクロゲルの統計的な有意差の詳細については、表 1および 2に記載しています。重合時間が長くなると架橋が進み、...

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ディスカッション

PEGミクロゲルの物性を調べて、重合条件の変化を調べた。この沈殿反応では、緩衝液、20%(w/v)PEG-ジアクリレート(MW 3,000、4,600、または6,000 Da)溶液、および光開始剤を混合し、37°Cに加温した。水分子間の相互作用を増加させる共生栄養塩である1.5 M Na2SO4を添加すると、PEGが添加時に瞬間的に沈殿した。この効果は、分子量が高いPEG8ほど顕著であり、実際のミクロゲル形成は鎖の成長と沈殿の組み合わせであることを示唆しています。マイクロゲルは、紫外線(UV)光による光重合から得られました。紫外線曝露は、30、90、120、300、および600秒の範囲で変化しました。ポリマーが臨界分子量に達すると沈殿し、絡み合って架橋されたミクロゲルを形成します。マイクロゲルへのタンパク質のカプセル化は、UV曝露前に分子を溶液に添加することによって達成されました。ポリマー鎖が架橋を形成すると、ポリマーネットワーク2,4にタンパク質を閉じ込めます。

ミクロゲルのサイズとPDIは、...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

このプロジェクトの資金は、NSF CBET Award 1061834を通じて行われました。著者らは、光開始剤のサンプルについてCIBAに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)MPバイオメディカル2810305
トリエタノールアミン(TEOA)JTベイカー9468-0137°Cに予熱します。ピペッティング前のC
塩酸(HCl)BDH AristarBDH3028
Sodium SulfateJ.T. Baker3891-01
Irgacure 2959Ciba029891301PS04
Ovalbumin (OVA)Invitrogen34782
PEG 1,500Alfa AesarA16241
PEG 3,000Fluka03997-1KG
PEG 4,000Alfa AesarA16151
PEG 4,600Sigma373001-250G
PEG 6,000Fluka03394-1KG
PEG 10,000Alfa AesarB21955
Dextran 70TCID1449

参考文献

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