マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

サマリー

ミクログリア生物学の成功の調査の一つの鍵は、CNS組織からの単離の間にex vivoでミクログリア免疫機能の維持である。蛍光イメージング、免疫細胞、および炎症誘発性刺激リポ多糖（LPS）とパム₃ CSK _4（PAM）を用いたELISA次のミクログリアの活性化によって評価されるように、高純度と免疫機能細胞培養で回転振盪結果を経由してミクログリアを分離する。

要約

CNS組織からミクログリアの単離は、ex vivoでミクログリア生物学を研究するために使用される強力な調査ツールです。本発明の方法は、ロータリーシェーカーで機械的攪拌により、新生児マウスの皮質からのミクログリアを単離するための手順を詳しく説明します。このミクログリアの分離法の利回り生体内で正常な、非病理状態で静止ミクログリアを示す形態学的および機能的な特徴を示す高純度皮質ミクログリア。この手順は、形態学的変化、NF-κB（P65）のp65サブユニットの核移行、および特徴的な前炎症性サイトカインの分泌の誘導によって示されるように、ミクログリア免疫表現および生化学的機能を維持し、腫瘍壊死因子α（TNF-α ）、リポポリサッカライド（LPS）とパム₃ CSK _4（PAM）の課題に依存する。そのため、本単離法は、静止してACTIの両方の免疫表現を保持するex vivoでの条件でミクログリア生物を調査する実験方法を提供し、ミクログリアをvated。

概要

小膠細胞は、CNS実質の監視マクロファージは、成体哺乳類の脳の全細胞集団の約12％を構成する。小膠細胞は、卵黄嚢、骨髄前駆細胞に由来し、成体CNS ^1-5内の異なる領域における細胞構築の細胞密度および形態が変化している。健康な成人の脳では、ミクログリアは、微細な、ダイナミックなプロセスと、小さな枝状または極性細胞である。周辺マクロファージの形態とは対照的に、ミクログリアは細胞非アクティブとして表示されることがあり、健康な脳では静止、ロープロファイル表現型を示すが、in vivoイメージング研究は、ミクログリアのプロセスを動的」を彷彿とさせる方法で、その微小環境を監視するために拡張し、撤回することを実証サンプリングと測量^」6,7。

ミクログリアは、スイッチング、高度かつ差別的脳における環境的および病態生理学的な変化に応答する監視者からの​​状態 - 一般的に彼らの休止およびそれぞれ活性化した状態とみなさエフェクターへ。活性化のこのスイッチは、このような病原体関連分子パターン（PAMP）に反応し、Toll様受容体（TLR）、などの膜結合パターン認識受容体（PRR）の係合によって、すなわち細菌やウイルス由来のリポタンパク質を媒介することができます、核酸、及び炭水化物^8-11。のPAMPのほかに、PRRは、また、細胞損傷^12-16のようなCNS恒常性に摂動を表す危険/ダメージ関連分子パターン（DAMPS）として知られている無菌の、非病原性の分子に対するミクログリア活性化を誘導することが示されている。かつて従事し、PRRははミクログリア細胞の形態や遺伝子発現の変化をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードを開始する、具体的には、活性化したミクログリアは、アメーバ様の表現型を適応させる細胞核にP65、NF-κBサブユニット（P65）を転位し、アップレギュレートのproductionような活性酸素種^{（ROS）16-24}に沿っ腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、インターロイキン1-β（IL-1β）などの炎症誘発性サイトカインの分泌。 CNSの先天性免疫応答の積分が、これらの分泌された分子はまた、それによって、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの^25-29疾患状態における神経変性を誘導し、悪化、ニューロンの酸化ストレスを増加させることが見出されている。

しかし、病的状態にあるミクログリア活性化のメカニズムは完全には理解されていない。ミクログリアの活性化の生体内での機能の多くは、培養中で要約することができるように、したがって、ミクログリアの単離は、これらの生物学的プロセスへの強力な調査ツールです。いくつかの方法がCNS組織^30,31の酵素消化後のパーコール勾配を経由して分離を含むミクログリアを分離するための利用可能です。しかし、酵素消化を変更することができます細胞表面抗原の発現^32を減少させることによって、細胞の免疫表現型、および本明細書に記載された方法よりも、動物あたりの細胞収量をもたらす。以前パーコール勾配収率3-5×10 ⁵細胞^30,33,34を経由して、全CNSから単離法を報告しながら、具体的には、7.5×10 ⁵細胞の子犬皮質あたりの平均ミクログリア収率を報告している。現在の手順では、それによってミクログリア免疫表現性と機能性を維持し、彼らの低接着特性に基づいたミクログリアを分離することにより、消化酵素の使用を回避する。

（CX3CR1-GFP ^{+ / - ）}は、本研究では、新生児のヘテロ接合カイン-GFPに由来し混合グリア培養からミクログリア細胞の単離を記載し、ロータリーシェーカー、以前の延長線上の機械的攪拌を経由して、C57BL / 6マウスの皮質公表された方法の^24,35。私たちは、ミクログリアの容易な視覚化のための前のマウス系統を利用単球特異的プロモーター^36〜38 -これらのマウスは、内因性CX3CR1遺伝子座の制御下にGFPを発現する。このメソッドは、保存免疫表現ex vivoで細菌性リポ多糖（LPS）またはパム₃ CSK _4、TLR4およびTLR1 / 2アゴニストでチャレンジしたときの形態学的変化、p65の核移行、およびTNF-αの分泌によって証明されるようにして高純度のミクログリアの文化を生産であった。

プロトコル

前にこのプロトコルを開始する、出生後日目新生仔マウスを集め1-3保護さと暖かさのために、元のケージ寝具を使用してネストされた滅菌容器内（P1-3）。これは、ミクログリア収率を最適化するためにこのプロトコルを介して迅速かつ効率的に作業することが重要である。完全な試薬リストについては、表1を参照してください。

1。楽器、文化メディア、料理の準備

1. 10ミリリットル/子犬ミクログリアを調製する完全培地（MCM; 1×最少必須培地イーグル[MEM]を補充した1 mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.6％v / vのD-（+） - グルコース、100μg/ mlのペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）、4％v / vのウシ胎児血清（FBS）、6％v / vのウマ血清）、各T-75フラスコ（1フラスコ/仔）に追加する、キャップと場所に水平にインキュベーター（37℃、5％CO _2）で 1時間平衡化する。 それは、切開を開始する前に、フラスコ（単数または複数）でこのメディアを平衡化することが不可欠である 。
2. PREPA37℃の水浴の解剖用MCM（6ミリリットル/ PUP）とセルの再懸濁のための独立した円錐状の管MCM（2ミリリットル/ PUP）内での一定分量、そして暖かい、再。 、準備分量、氷上ミンチメディア上のチル（MM、HBSSを補充：100μg/ mlのP / S、0.01MのHEPES、3ミリリットル/ PUP）、および解剖メディア（DM、MEMは/ 100μg/ mlのPを補充したがSであり、2ミリリットル/ PUP）。
3. 10分間、70％エタノールに浸漬して、次の手術器具を殺菌：シザー＃1（1;首を切るために）、＃1（2;鼻を確保し、皮質を除去するために）鉗子、はさみ＃2（1; nonangled、頭皮を開くために）、＃2（1鉗子、頭皮を除去するために）、＃3（1鉗子、頭蓋骨を除去するために）、＃4（2鉗子;髄膜を除去するために）、シザー＃3（1、脳組織をミンチにする）。無菌パッド上で空気乾燥させます。
4. 70％エタノールで水平気流ワークステーションと解剖顕微鏡を拭う。
5. 頭を取得するための2無菌、100ミリメートルペトリ皿にDMを分注（3ミリリットル、1/3匹の皿）と解剖（1ミリリットル;解剖の前に氷上で冷却）; / PUP 1一品。脳組織（; 1ディッシュ/ PUP 1ミリリットル）をミンチ用の1の滅菌、100ミリメートルペトリ皿に、MMを分注する。

2。脳の組織切開

1. 安楽死の前に、そっとラボの組織を用いて70％エタノールで首と子犬の頭を消毒。シザー＃1と、すぐに頭を削除して子犬を安楽死させる。先に調製したペトリ皿に頭を捕獲。安楽死させると次の動物に進む前に、1子犬の解剖を完了します。
2. チルド解剖皿に頭を移し、解剖顕微鏡下で＃1（あるいは、ヘッドが目のソケットを介して鉗子を穿孔することによって固定することができる）の鉗子を用いて鼻をつまんで頭部を固定し、オープンな頭皮シザー＃2を使用して作成することにより、 Yカット：ヘッドのベースから、目に向けて角度で始まる。優しく頭蓋骨を露出させ、横方向に剥離することにより、頭皮を削除するには＃3の鉗子を使用します。
3. 鉗子＃3を使用して、ゆっくりとベースの結合組織を取り除く頭。 （半球間裂以下）は、脳と頭蓋骨の間に鉗子の一方の腕を通すことによって頭蓋底が露出し、慎重に開いて頭蓋骨、グリップ、そっと開いて引き裂くために上方頭蓋骨を引く。
4. 鉗子＃1を用いて脳の腹側の下に結合組織を崩壊され、その後、同じツールを使用して脳を削除します。脳の腹側の下に上向きの力を利用して頭蓋骨から脳を持ち上げます。
5. その解剖学的位置に脳に注意してください。背側は、解剖顕微鏡下で皮質を視覚化するために上に向け、中脳および皮質の交差点に鉗子の先端を挿入して所定の位置に脳を固定し、完全に鉗子＃4で皮質髄膜を除去し、そして腹髄膜を除去して進んでください。髄膜が完全に除去された後、鉗子＃4を用いて脳の他の部分から皮質を分離する。 それが完全にミクログリアの純度とyielを最大化するために髄膜組織を除去することが不可欠であるD。

3。脳組織ミンチ

1. 転送皮質は、以前に料理をミンチ準備する。クラスII生物学的安全キャビネットの滅菌技術を使用してステップをミンチに進みます。
2. ミンチシザー＃3を使用して、脳組織、15ミリリットルコニカルチューブにみじん切りの組織を転送し、ハサミとMMの1ミリリットルごとにミンチの皿をすすぎ、みじん切りの組織を含む15ミリリットルコニカルチューブにリンスを収集し、分注このすすぎ工程を最大化します 。 すべての残存組織が ​​円錐管に移されるようにすることで、ミクログリアの収量 。刻んだ組織はチューブの底に沈降させ、1〜2分間乱さ組織懸濁液のままにしておきます。MMは必須栄養素が含まれていないように2分を超えないようにしてください。
3. 慎重に取り外し、定住みじん切り組織を破壊していない、あること、標準ピペットチップで汎用の千μlのピペットで上清を2ミリリットルを廃棄する。
4. みじん切り組織にMCMの3ミリリットルを追加します。標準のピペットチップを使用してジェネリック千μlのピペットを使用して完全な力で組織を粉砕するチュレーションが完了したときには識別可能な固形組織が ​​残っていないはずです 。。ピペットチップから残留粉末化したサンプルを収集し、同じピペットチップでMCMの別の3ミリリットルを追加します。

4。成長している皮質細胞

1. 遠心分離機細胞（215×gで、5分、室温で、スイングバケットローターを用いた臨床遠心分離機）をペレット化し細分化した組織。生物学的安全キャビネットにペレット化した細胞を戻し、削除し、上清を捨て、ゆっくりと細胞ペレット（; MCM 2ミリリットル/管）;再懸濁以前に調製したT-75フラスコに細胞の再懸濁を追加します。フラスコに蓋をして中に水平に配置します加湿された、標準的な組織培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）。細胞を24時間インキュベートすることができます。
2. 24時間後、静かに破壊するの手のひらに対してフラスコをタップ組織破片。前と残骸の完全な除去を確実にするためにタップした後、細胞を確認してください。セットフラスコ垂直、メディアを取り出し、廃棄し、フラスコの底に新鮮なMCMを追加（12ミリリットル、37℃）、キャップと水平に、インキュベーターに戻し入れます。
3. 汚染の毎日のセルをチェックして、成長を監視する。
4. 体外 （DIV） でのおよそ17〜21日、ミクログリア細胞は、混合グリア培養物から収穫の準備ができているでしょう。細胞は準備ができているかどうかを判断するには、倒立位相差顕微鏡で細胞を調べる。 ミクログリア〜40％の集密度でとき収穫の準備ができている。彼らは、他のグリアの上に単層として成長し、小さな、明るい球状セルとして表示されます。

5。混合グリア培養物からミクログリアの分離

1. ミクログリアを分離するために、積極的に実験台に対してフラスコをタップします。この攪拌は、ミクログリアの低接着特性のために、他のグリア細胞とは別のミクログリアに役立ちます。
2. パラフィルムでシール、T-75フラスコのキャップを、混合グリア培養（200 rpmで、37℃、5時間）回転させます。温度制御され、無加湿ロータリーシェーカーを使用して、細胞が5時間よりも長く握手させないようにしてください視覚的に検査します。ミクログリアは、倒立位相差顕微鏡を用いて、5時間後、フラスコ表面から持ち上げられている。 ミクログリアは明るく、球状、浮遊細胞である。フラスコの底に付着したアストロサイトとオリゴデンドロサイトの残留層が存在します。
3. 無菌コニカル遠心管にミクログリアを含む上清のメディアを集め、ペレットミクログリア（215 XG; 5分、バケットローターを振る）。
4. 〜2、0.6％体積/ vglucose、1mMのL-グルタミン、100μg/ mlののP / S、5％v / vのFBSを1 mMピルビン酸ナトリウム：;暖かいミクログリア増殖培地（MGMにおけるミクログリアペレットを再懸濁MEMを補充したミリリットル/フラスコ）、血球計数器を用いて細胞濃度を決定し、上の24ウェルプレートフォーマットにおいてウェル1×10 ⁵細胞/プレートプラスチックまたは（500μL/ウェル; MGM）を滅菌ガラスカバースリップ。 この手順を用いて、平均ミクログリア収量は7.5×10 ⁵細胞/ PUP皮質である。
5. 24時間後のめっき、浮遊細胞および破片を除去するために、新鮮なMGM（37°C）とメディアと再給細胞のすべてを削除します。 このステップでは、細胞の生存にし、静止ミクログリアを維持することが重要です。細胞は、すぐに再給紙後に実験のために利用することができる。

6。たとえばトリートメント

1. 加湿インキュベーター中で2又は24時間（37℃、5％CO _2）インキュベートし;パムの10 ng / mlの₃ CSK _4（パム）、10 ng / mlのリポ多糖（LPS）またはビヒクル対照に細胞をさらす。

7。機能性生体外を経由して免疫蛍光イメージングおよび免疫細胞化学のためにミクログリアを分析する

1. 微量遠心管（1.5ml）およびCENTR治療、収穫細胞培養培地の後にメディアを消去するには、卓上マイクロ（900 XG 2分）を使用してifuge。使用する準備ができるまで、すぐにアッセイ、または-20℃で保存、きれいなマイクロチューブに上清を移します。市販のマウスTNF-αELISAキットを介して細胞培養上清中のTNF-α濃度を分析します。
2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定（w / v）のパラホルムアルデヒド/ 4％（w / v）のスクロース/ PBS液pH7.4（4％PFA、15分、RT）。固定後、穏やかにオービタルシェーカー上で振盪しながら5分間PBSで細胞を洗浄。
   1. 免疫蛍光/免疫細胞化学で固定し、PBS洗浄、免疫細胞化学のためのプロセスミクログリアの後。 すべてのステップは、穏やかに振とうしながら行った 。 PBS/0.1％トリトンX-100で細胞を透過、一時間PBS/10％正常ヤギ血清でブロックセル。ブロッキング緩衝液中で、またはウサギ抗伊庭-1抗体（1/750）;ウサギ抗NF-κB抗体（1/1、250 p65サブユニット）と、O / N、4℃で細胞をインキュベートする。ビジュアル抗原をIZE：蛍光コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG二次抗体（1時間、1/1、000）とのインキュベーション後の抗体複合体。 PBS/0.1％トリトンX-100（3X 5分）で洗浄することによって結合していない二次抗体を除去する。
   2. 4 '、6 -ジアミジノ-2 -フェニルインドール/ PBS（DAPI; 0.1μg/ ml）を有するカウンター染色細胞。細胞核を視覚化する全てのミクログリアはCX3CR1-GFPに由来^{+ / -}マウスは、GFPを発現する。 DAPIを可視化するために350nmの波長フィルタを利用し、GFPを可視化する488nmの波長フィルターと594 nmの波長フィルタは、p65および伊庭-1免疫複合体を視覚化する。
3. マウントカバーは、水性マウンティング溶液を用いて、蛍光顕微鏡を用いて視覚化ミクログリアを滑る。

結果

隔離中のミクログリアex vivoでの免疫表現と機能性を保持することミクログリア生物学のための捜査モデルとして、これらの細胞を利用できることが重要です。本発明の方法を用いて、ミクログリアimmunofunctionalityの正常な保全性を実証するために、我々はP3新生児から皮質ミクログリアを単離した（CX3CR1-GFP ^{+ / -}およびC57BL / 6）およびLPS又はパムのいずれかで培養物を処理した。

図1（a）に示すように、回転振盪を通じて、攪拌を経由してミクログリアの単離は、通常のインビボ条件下でのミクログリアに起因する休止表現型を保持します。ミクログリアの純度を評価するために、CX3CR1-GFP ^{+ / -}細胞培養物は、マクロファージ、抗原伊庭-1および細胞核を可視化するためにDAPIで染色されたカウンター染色した。 presaの複数形を介して、 図1A及び図1B、低倍率下で、ミクログ...

ディスカッション

現在の手順では、新生マウスからの皮質ミクログリアの単離のための効果的な方法を提供しています。この手順では、蛍光イメージング、免疫細胞、およびELISAで測定し、1）保存ミクログリアの免疫表現と機能の2倍の利益を持っている、そして、2）ミクログリアの前に、他のグリア細胞（アストロサイトおよびoligodentrocytes）の存在下で成熟することができますグリア培養成熟期間中に重要な細胞間相互作用を促進することができる単離。重要なのは、単離された細胞は、保存機能性と免疫表現ex vivoで高い生存性と均一性を示した。

最高の純度と収率でミクログリアの成功を単離するための特別な注意と勤勉さで実行する必要があるいくつかのステップがあります。これらの手順は以下のとおりです。1）全体的な実験手順では、滅菌、健全な文化を維持、2）CORからすべての髄膜を除去したticesマイクロダイセクションの間に、皮質をミンチした後に、プレートとはさみをミンチの3）適切な洗濯; 4）マイクロダイセクションを開始する前に、インキュベーター内で、T-75フラスコ内でMCMを平衡; 5）24時間...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Glucose	Sigma	G8270	MilliQ水で20%ストック溶液を作り、フィルター滅菌し、4°Cで保存します。C;賞味期限:3-6ヶ月。MCMとMGMを作るのに使います。
ピルビン酸ナトリウム 100 mM (100x)	Hyclone	SH30239.01	4°Cで保存します。
ペニシリン/ストレプトマイシン 10,000 units/ml (100x)	Gibco	15140-122	-20°C で保存 MCM、MGM、MM、および DM の製造に使用されます。
L-グルタミン 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	-20°Cで保存 MCMおよびMGMの製造に使用。
ウシ胎児血清(定義)	ハイクロン	SH30070.03	フィルター滅菌;-20°Cで保存します。
最小エッセンシャルミディアムアールズ(MEM)	Cellgro	15-010-CV	。アール塩が含まれています。MCM、MGM、DM の製造に使用されます。
馬の血清	Gibco	16050	フィルターは殺菌し、-20 °C.で保存します。
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)	Cellgro	21-021-CV	カルシウムとマグネシウムなし。4°Cで保存します。
HEPES 1 M	Gibco	15630-031	4 °C. で MM を作るために使用されます。
T-75	Flask Corning	430641
4',6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI)	Invitrogen	D3571	細胞核の染色に使用。
ウサギ抗Iba1	和光	019-19741	Iba1のICC染色に1/750希釈で使用。
ウサギの抗NF&κ;B (p65)	Abcam	7970	/1,250希釈でp65のICC染色に使用。
Alexa Fluor 594 ヤギ抗ウサギIgG (H+L)	Invitrogen	A11012	ICCにおける抗原:抗体複合体の可視化に1/1,000希釈で使用。
10 ml 使い捨て血清ピペット	フィッシャー・サイエンティフィ	13-678-11E
50 ml ディスポーザブル遠心分離チューブ	フィッシャー・サイエンティフィック	05-539-8
15 ml ディスポーザブル遠心チューブ	フィッシャー・サイエンティフィック	05-539-12
滅菌ポリスチレン・ペトリ皿	フィッシャー・サイエンティフィ	フィ	875713 100 mm x 15 mm
はさみ:ストレート・メッツェンバウム (はさみ #1)	Roboz Surgical	RS-6010	1; 5 in; 頭部の取り外しに使用
はさみ: Vannas (はさみ #2)	Fine Science Tools	15000-08	1; 角度なし; 2.5 mm 刃先; 頭皮を開くために使用
はさみ: Student Vannas (はさみ #3)	Fine Science Tools	91501-09	1; 湾曲; 脳組織をミンチするために使用
鉗子: Dumont #7 (鉗子 #1)	Fine Science Tools	91197-00	2;鼻を固定し、皮質を取り除くために使用されます
鉗子: Dumont #2 (鉗子 #2)	Fine Science Tools	11223-20	1; 頭皮の除去に使用
鉗子: Dumont #3 (鉗子 #3)	Fine Science Tools	11231-30	1; 頭蓋骨の除去に使用
鉗子: Dumont #5a< br/> (鉗子 #4)	Fine Science Tools	11253-21	1; 髄膜を除去するために使用
特定の機器のテーブル
ズーム立体解剖顕微鏡	オリンパス	SZ4060	顕微鏡は、層流水平フローキャビネット内に配置されます
層流水平フローキャビネット	Nuaire	NU-201-330
生物学的安全キャビネット	Labconco	3440001	Class II
ウォータージャケット CO2 インキュベーター	VWR	97025-836	37 °C に設定。C、5% CO2
>スイングアウトバケット	フィッシャーサイエンティフィック	75006441	スイングアウトローターと併用
アウトローター	フィッシャーサイエンティフィック	75006445	最大半径:19.2 (cm)
ソーバルレジェンド RT+ 遠心分離機 (臨床遠心分離機)	フィッシャーサイエンティフィック	75-004-377	スイングアウトローター付き
アキュスピンマイクロ 17 微量遠心分離機 (卓上型微量遠心分離機)	Fisher Scientific	S98645	マイクロリットルローター付き (24 x 1.5/2.0 ml;ネコ #: 75003524)