私たちは、最小限のコストや専門知識を持つECMタンパク質の直接結合を可能にするヒドロキシPAAmを呼ばれる新しいポリアクリルアミドハイドロゲルを、提示します。マイクロコンタクトプリント法でヒドロキシ - のPAAmハイドロゲルの組み合わせは、細胞のmechanostransductionを研究するための天然の細胞の微小環境の多くの手がかりを独立して制御を容易にします。
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この記事について
サマリー
要約
現在では、多くの細胞機能は、それらの細胞外マトリックス（ECM）環境の物理化学的および機械的な手がかりを用いた細胞の相互作用によって調節されることが確立されている。真核細胞は、常に、遺伝子発現の特定の変化を達成するために、生化学的シグナルにECMの物理的変化を形質導入し、これらの信号を統合するために、表面mechanosensorsを通じて局所微小環境を感知する。興味深いことに、互いにECM缶のカップルの物理化学的及び機械的パラメータは、細胞の運命を調節する。そのため、メカノを理解する鍵は、細胞機能上のECM手がかりの相対的な寄与を分離することです。
ここでは、迅速かつ容易にin vitroでのメカノ手がかりから独立チューニングのための生物学的に関連するヒドロゲルを生成するために、詳細な実験プロトコルを提示します。私たちは化学的に修飾されたポリアクリルアミドハイドロゲル（PAAmを）は、それらの本質的に非adhesを克服するために重合中にヒドロキシル官能アクリルアミドモノマーを組み込むことによって特性をアイブ。私たちは、ECMタンパク質の任意の所望の性質の固定化を可能にするヒドロキシPAAmを呼ばれる小説のPAAmハイドロゲルを、取得した。マイクロコンタクトプリンティング、ヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルの組み合わせは、独立して、単一細胞の形態、マトリックス剛性、性質およびECMタンパク質の濃度を制御することを可能にする。私たちは、in vitro細胞メカノ過程で勉強するすべての生物学の実験室で設定することができ、簡単で迅速な方法を提供する。今後は、ECMの剛性と核との間の機械的結合を実証する内皮細胞上の実験を行うことにより、この新規二次元のプラットフォームを検証します。
概要
局所的な細胞微小環境（ 例えば 、剛性、細孔径、タンパク質の性質、または細胞リガンド密度）の多くの局面は、運動性、細胞増殖、分化、および遺伝子発現のような細胞プロセスを制御する調節手がかりの座標セットを提供する。細胞外環境の物理化学的特性の改変は、細胞によって認識されると細胞の分極の変形、移動、および分化を含む、異なる生理学的結果を引き起こすことができる。これは、細胞が細胞の生化学的シグナルにECMの変更を変換する方法が、依然として不明である。したがって、主要な重要性メカノ経路を研究するための細胞とそれらの微小環境との間の相互作用を再現できるin vitroでの微小環境を制御操作することである。この問題に対処するために、容易に二ダイムを生成するために、ヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルと呼ばれる新規な方法1を 、最近導入されている独立して重要なメカノキューを制御することが可能とnsionalソフト行列：行列のこわばり、セルの形状と閉じ込め、タンパク質の性質および細胞リガンド密度。
ECMはモルフォゲン（走化性）における勾配、接着性タンパク質（走触性）、および剛性（durotaxis）を介して細胞プロセスを指示します。過去数十年にわたり、in vitroでのプラットフォームの高度は、細胞が生理学的プロセス2-5に生化学的および生物物理学的特徴を翻....
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プロトコル
1ガラスカバースリップの表面を活性化
- ペトリ皿とスミア（推奨化学ヒュームフード）で5分間、その上に、0.1MのNaOH溶液中でガラスの円形カバースリップ（直径25mm）。
- NaOH溶液を外し、静かに無菌培養フード内で揺動板に揺動しながら、完全に20分間、無菌のddH 2 Oでカバースリップを浸す。
- 無菌のddH 2 Oを排出し、ステップ1.2を繰り返します。
- 無菌ピンセットでカバーガラスを取り外して、活性化した顔を上にして新しいペトリ皿に配置します。
- 高純度窒素ガスの定常流の下で乾燥したカバースリップ。
- 無菌培養フードでは、1時間カバースリップの活性化された側の3-（トリメトキシシリル）プロピルアクリレート（92％）の薄層を汚す。
- 広範囲に無菌のddH 2 Oを3回洗浄したカバーガラスを洗浄し、新しいシャーレに無菌のddH 2 Oでそれらを浸す。
- ペトリ皿をタップそしてパラフィルムで10分間穏やかに攪拌しながらロッカープレートの上に置きます。
- 細かいヒントを、滅菌ピンセットでのddH 2 Oからのカバーガラスを取り外して、活性化した顔を上にして新しいペトリ皿に配置します。
- カバーガラスに付着するほこりを避けるために、アルミホイルで乾燥した場所....
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結果
図1Aは、ランダムラジカル重合によって埋め込 まヒドロキシル基（水酸基のPAAm）、ポリアクリルアミドの親水性ネットワークを形成された一次ヒドロキシル基を含むN-ヒドロキシエチル（HEA）モノマーとアクリルアミドの共重合（AAM）を提示し、ビスアクリルアミド（ビス-AAmと） 。このプロトコルでは、HEAの重量65 mgのHEPESの1ミリリットルの容量で希釈しなければならない。 HEAの密度は1にほぼ等しいことを知って、私たちは1065液（HEA + HEPES）の作業容量を取得することを前提としています。 表1に示したように、AAmと400μlのとbisAAm50μlのに1065μlの総付加は、1515μlの容量につながる。したがってHEPESの3,485μlの容量を5mlの最終容量に対する解決策を調整するために必要とされる。ステップ2.6に示すように、22ミリメートルのカバーガラスの表面を生じさせることなく、それを除去するために、UV /オゾンでの7分の間に活性化されなければならないヒドロゲル表面への損害。実際に、ガラス表面は、UV /オゾン処理した後に、よ.......
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ディスカッション
現代の細胞生物学のin vitroでの観察の多くは、多くの場合、ECMタンパク質またはRGD配列を含む合成ペプチドの薄層で被覆された硬質ガラス製カバースリップ上で行われている。しかし、そのような基本的な培養基質は、細胞のメカノプロセスを研究するための正確なモデルを提供しないので、ECMの全体の物理化学の複雑さを再現していません。この問題に取り組むために、任意の所望の量およびECMタンパク質の性質二次元ヒドロゲルを官能化するための単純な代替案を提案する。この方法は、このようなマトリックスのこわばり、細胞形態および閉じ込めまたは細胞リガンド密度として、重要なメカノ合図を独立して制御することができます。また、ヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルに固定化し、複数のECMタンパク質の空間分布を制御することができないことであり、現在の官能化法の最大の限界の一つを克服する。水力発電の高親和のためにXY-PAAmを生体分子のためのヒドロゲル、人はどんな補助装置を必要としないシーケンシャルmicroprintingsを使用することによって、関係なく、マトリックスの剛性を同一面上にさまざまなECMタンパク質の空間分布を制御することができます。.......
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
謝辞
この研究は、ベルギー国立科学研究財団(F.R.S.-FNRS)の「MIS共焦点顕微鏡法」、「Crédit aux Chercheurs」助成金、および「Nanomotility FRFCプロジェクト」(no. 2.4622.11)を通じて支援されました。T.G.博士研究員は、Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research（FRIA）の支援を受けています。著者らは、機械的特性評価のためのSylvain Desprez氏と共焦点イメージングのためのGéraldine Circelli
氏に感謝します。....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| UV/オゾンフォトリアクター | 紫外線 製品 | PR-100 | |
| ロッキングプレート | IKAcWerke | 型KS 130 ベーシック | |
| ボルテックス | 科学産業 | モデル ボルテックス Genie2 | |
| 真空脱気室 | 応用真空工学 | DP-8-KIT | |
| パラフィルム | シグマ・アルドリッチ | P7793-1EA | |
| 細い先端のステンレス鋼鉗子 | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| ドレッシング組織鉗子 | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| ポリスチレンのシャーレ | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| アルミホイル、厚さ0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| アイソポア メンブレン フィルター (0.2 µ細孔径) | Millipore | GTTP フィルターコード | |
| 丸型ガラスカバースリップ(直径22mm) | Neuvitro | GG-22 | |
| 丸型ガラスカバースリップ(直径25mm) | Neuvitro | GG-25 | |
| 可変容量マイクロピペット | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| タンパク質微量遠心チューブ | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| メスハンドル | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| メスブレード | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| 細胞培養フラスコ (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| 超音波バストレイ、固体(ステンレス鋼) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| ポリジメチルシロキサン | ダウコーニング | シルガード184シリコーンエラストマーキット | |
| アクリルアミド(粉末) | シグマアルドリッチ | A3553 | |
| N、N'-メチレンビス(アクリルアミド) | シグマアルドリッチ | 146072 | |
| N-ヒドロキシエチルアクリルアミド | シグマアルドリッチ | 697931 | |
| N、N'、N'、N'-テトラメチルエチレンジアミン | グマアルドリッチ | T9281 | |
| 過硫酸アモニウム (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(トリメトキシシリル)プロピルアクリル酸 | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| ヒト血漿 フィブロネクチン | ミリポア | FC010 | |
| EHSからのラミニン | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| 水酸化ナトリウム | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| 二蒸留水(ddH2O) | |||
| 内皮細胞増殖培地 | 細胞 アプリケーション | 211K-500 | |
| ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES 緩衝液 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| 抗生物質-抗真菌薬 | PAA 研究所 | P11-002 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | PAA 研究所 | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 ファロイジン | 分子プローブ | A12379 | |
| マウスで産生される抗ビンキュリン抗体 | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| ヤギ抗マウス抗体-テトラメチルローダミン | 分子プローブ | T-2762 | |
| 抗フィブロネクチン(ウサギ) | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| ストレプトアビジン | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| 抗ラミニン抗体 (ウサギ) | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| 抗ウサギ IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| トリプシン-EDTA溶液 | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| 無水エタノール | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
参考文献
- Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
- Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O.
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再版と許可
