イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

サマリー

ここで説明するプロトコルは、全量網膜製剤の構造評価のためのものです。これには、組織解剖、親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)メンブレンインサートへのマウント、蛍光マーカーによるボーラスローディング、細胞およびシナプス成分の免疫組織化学的分析のためのカルボジイミドおよびパラホルムアルデヒドによる固定の比較の説明が含まれます。

要約

デリケートな組織を扱うことは、免疫組織化学的評価を行う際に複雑な要因となる可能性があります。ここでは、リング支持された親水性PTFEメンブレンを利用して、免疫組織化学処理中に生体組織と固定組織の両方に構造的支持を提供する方法を紹介します。まず、これは、生きている網膜組織への蛍光マーカーのボーラスローディングによって実証されます。この方法により、標的構造の迅速な可視化が可能になるとともに、メンブレンサポートは注入中の組織の完全性を維持し、さらなるイメージングやプロセッシングのための調製物の移し替えを容易にします。

次に、カルボジイミドで固定した組織での抗体染色の手順について説明します。パラホルムアルデヒド固定がより一般的ですが、カルボジイミド固定はシナプスタンパク質の可視化に優れた基質を提供します。カルボジイミドの限界は、結果として生じる固定組織が比較的壊れやすいことです。ただし、これは支持膜を使用することで克服されます。網膜組織は、これらの技術を実証するために使用されますが、任意の壊れやすい組織に適用することができます。

概要

デリケートな無傷の組織で免疫組織化学を行うと、取り扱いや移入中に損傷を受けるリスクがあります。これは、脳スライスまたは変性した網膜などの他の薄い組織のいずれかで発生する可能性があります。さらに、ニューロン構造の免疫染色に有利な組織固定の方法もありますが、構造安定性が損なわれ、その使用ができなくなります。この特定の例は、カルボジイミドベースの固定であり、これは受容体およびホルモン^1-7の染色に優れていますが、固定組織の不安定性のために一般的に避けられます。

ここでは、親水性のPTFE膜を利用して、固定または未固定の繊細な組織を構造的に支持する手順について説明し、さまざまな染色技術を実現します。支持膜により、固定前後のデリケートな組織の操作が可能になり、組織損傷のリスクを最小限に抑えながら、いくつかのステップの処理が可能になります。全体として、組織の完全性を維持するためのこの簡単な方法は、他の方法では避けられる可能性のある技術を使用する機会を提供します。そのため、このアプローチは、スライス手順後に壊れやすくなる脳スライスなど、さまざまな組織の調製にもうまく使用できます。

プロトコル

すべての実験手順において、動物は眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明の規則に従って、ワイルコーネル医科大学によって承認されたプロトコルに従って扱われました。動物は二酸化炭素とその後の子宮頸部脱臼によって安楽死させられました。

1. Wholemount Retinaの解剖

1. マウスを安楽死させた後、眼を摘出し、酸素化HEPES緩衝リンゲル液に入れます(表1)。
2. 小さなハサミでオラセラータに沿って円形の経路で切り込み、鉗子で眼を輪部に保持して角膜を取り除きます。鉗子でレンズを引き出します。
3. 鈍いエッジの鉗子を使用して、できるだけ多くのガラス質を取り除きます。このステップは、ボーラス注射や電気生理学的記録にとって重要です。免疫組織化学を単独で行う場合は必要ありません。
4. 網膜とアイカップの間に鉗子を配置し、鉗子を円周の周りでゆっくりと動かして、網膜をアイカップから取り外します。2セット目の鉗子で強膜をしっかりと保持して、アイカップを安定させます。網膜とアイカップの間の位置で視神経を切断して、アイカップからの網膜の分離を容易にします。
5. 網膜は、断片(四分の一など)に解剖することも、全体として使用することもできます。細かく切るには、はさみを使って網膜周辺から視神経まで切開します。あるいは、網膜全体を使用するには、視神経の半分まで末梢から切開を行います。切開部はフラットな準備をするのに役立ちます。

2. 親水処理PTFEメンブレンインサートへの取り付け

1. 以下に説明するようにメンブレンを準備します。生理学的記録や色素注入実験を行う場合は、旋盤またはハンドソーを使用してホルダーを短くし、残りのリングの高さが1mmになるようにします
   注:培養プレートインサートは、未改変または改変のいずれかです(図1A)。構成の選択は、実験の目的によって決まります。免疫染色には、未修飾のインサートが適しています。
2. 粗い表面を細かい(300グリット以上)サンドペーパーで磨き落とします。
3. (オプション)はさみでリングの下の足を外します。
4. 破片を取り除くには、メンブレンを蒸留水で2〜3分間すすぐか超音波で洗い流します。
5. 組織をメンブレンにマウントします(図1A)。プラスチック製のトランスファーピペットでメンブレンの上に溶液を含む組織を置きます。移し替え中に組織サンプルがピペットに付着しないように、必要に応じてピペットの細い先端を切り取ります。
6. 神経節細胞(GC)で網膜を上に取り付けます:膜上で、網膜を広げ、鉗子でひだを広げながら溶液を徐々に取り除きます。
7. メンブレンの反対側に、空のシリンジ(1 ml)を組織の真下に置きます。プランジャーを0.2〜0.3mlの容量まで引き戻して吸引します。使用前にシリンジの保持先端を切断することにより、吸引の表面積を増やしてください。組織は膜内に物理的に絡み合っているため、接着のためにそれ以上の治療は必要ありません。

3. イソレクチンAlexa488のボーラス注射

1. パッチピペットと染色液を準備します。ホウケイ酸キャピラリーガラスから、フレーミング/ブラウンプーラーを使用して、~1MΩの抵抗でパッチピペットを引き出します。ピペットの先端をそっと折します。
2. ステップ1.2で説明したHEPES緩衝リンゲル液10 μlに、イソレクチンAlexa 488ストック溶液0.3 μlを加えて染色液を作製します。
3. サンプルをパッチクランプセットアップに移して注入します(図1C)。組織を付着させたメンブレンを、温めた(37°C)および酸素化HEPES緩衝リンゲル溶液で灌流した記録チャンバーに入れます。
4. 色素の入ったピペットを内側の制限膜に当てます(ILM、図2A)。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットがILMに浸透するまでピペットをさらに進めます。ピコスプリッツァーを使用して、染色液を10〜20psiの圧力で1秒間注入します。単一または複数の場所を注入の対象とすることができます(図 2B)。ピコスプリッツァーが利用できない場合は、10 mlシリンジを使用して、注射用の正圧を供給することができます。
5. 注入した組織を10分間インキュベートします。インキュベーション中、注入された組織は落射蛍光照明下で観察できます。
6. 標識後、調製物を顕微鏡に持って行き、イメージングすることができます。インサートをガラス底培養皿に移し、網膜を下にして置きます(図1C)。
7. HEPES溶液を一滴加えて、標本を湿らせます。
8. プラスチックリングの周囲に2〜3スポットの真空グリースを配置して、インサートを培養皿の底にしっかりと固定します。
9. 皿を顕微鏡ステージに移します。

4. パラホルムアルデヒドとカルボジイミドの固定

1. インサートを固定剤に15分間移してサンプルを固定します。アプリケーションに応じて、より長いまたはより短い固定時間を使用することができます。どちらの固定剤も、GFP、イソレクチン、または蛍光Alexaヒドラジドの固定に効果的に使用できます(例:パッチクランプ記録の細胞充填に使用)
   注:固定には、4%カルボジイミドまたは4%パラホルムアルデヒド溶液のいずれかを使用できます。接着を維持するために、固定は組織がすでにメンブレンに付着した後に行う必要があります。組織は、マウント直後、または生理学的記録および/またはボーラス注射後に固定することができます。
2. 組織をリン酸緩衝液(PB)で30分間すすぎます。この後、組織をホールマウントとして処理するか(ステップ5)、または垂直切片に切断してから処理します(ステップ6および7)。

5. レチナールホールマウントの免疫染色

1. 24ウェルディッシュ(図1D)で、染色溶液中で1時間、メンブレン上の網膜片をブロックします。
2. マウス抗PSD-95一次抗体を染色液で1:300に希釈し、暗所で室温で48時間適用します。各ウェルに~100-150 μlの抗体溶液を組織とともに加えます。乾燥を防ぐために、未使用の井戸に蒸留水を入れてください。
3. PBで20分間、3回すすぎます。
4. 染色液に1:500溶解したロバ抗マウスAlexa 568二次抗体に24時間インキュベー
トします。
5. PBで20分間、3回すすぎます。
6. 染色した組織を入れたインサートを、PB溶液で満たされた標準的な3cmのシャーレに入れます。小さなハサミで、網膜を含む膜の部分をリングから切り取ります。
7. メンブレン上の網膜をスライド網膜上に移します。PBを取り外し、封入剤を追加します。割れたカバースリップガラスの小片をスライドガラスとカバースリップガラスの間に置き、網膜への広範な圧迫や損傷を防ぎます。カバースリップを置きます。
8. カバースリップをマニキュアで所定の位置に密封します。スライドは暗闇の冷蔵庫に保管してください。

6. 膜装着組織の垂直切片化

1. 固定後、メンブレン上の組織をショ糖勾配10%、20%、30%スクロース勾配溶液にそれぞれ30分、1時間、一晩浸します。一晩のステップは冷蔵庫で4°Cで実行され、他のすべてのステップは室温で実行されます。
2. はさみを使用して、プラスチックインサートリングからティッシュの入ったメンブレンを取り外します。
3. 網膜を上にして、切り取ったメンブレンをパラフィルムに置き、キムワイプでできるだけ多くの溶液を取り除きます。
4. 組織と一緒にパラフィルムをクライオスタットチャンバーに入れ、OCT培地を一滴加えます。急速冷凍装置を使用して凍結を加速します。
5. 凍結したサンプルを取り外し、裏返します。
6. 余分な凍結OCTをカットし、サンプルの周囲に3つの側面で約2 mmを残し、ホルダーに取り付けられる側から5〜6 mmを残します。
7. 露出した網膜側(膜側)をOCTで覆い、付着領域を空けておきます。
8. 網膜組織で膜を凍結します。これで、サンプルをカッティングホルダーに置く準備が整いました。
9. OCTをコールドホルダーリングに一滴垂らします。凍結したサンプルをすぐにドロップに挿入します。
10. 切片を厚さ10〜20 μmに切断し、クライオスタット温度を-19°Cに設定し、温かい(室温の)ポリサイン接着スライドを使用します。セクションが取り付けられたスライドを、暗い場所で2~3分(41°C)加熱プラットフォームに放置して、セクションがしっかりと接着するようにします。
11. スライドを収納ボックスに入れ、使用するまで-20°Cに保ちます。

7. 網膜切片の免疫染色

1. セクションのあるスライドを冷凍庫から取り出します。室温で1分間放置して、凝縮液を取り除きます。
2. 切片を液体ブロッカーで囲み、さらなるインキュベーションのためのバリアを作ります。
3. スライドをインキュベーションボックスに入れます。抗体溶液の蒸発を防ぐために、箱の底を水で覆います。
4. PBで5分間すすぎます。
5. 同じ染色液を調製し、ステップ5の手順に従います。一次抗体とのインキュベーションは一晩、二次抗体とのインキュベーションは1時間です。カバーガラスとスライドの間に割れたガラスを使用しないでください。

結果

ここでは、染色手順中に全網膜をサポートするために親水性PTFEメンブレンを使用することで恩恵を受ける2つの代表的な実験を示します。最初の実験は、複数の網膜層にまたがる血管の精巧なネットワークである網膜血管系の迅速かつ簡単な特性評価の方法を示しています(図2)。このアプローチは、イソレクチンのボーラスローディングとSRHによる浸漬標識を組み合わせたものです。これは、生体組織を標識する効率的な方法であり、ほぼ即座に視覚化およびスキャンできます。網膜では、血管を表層から深層まで標識できます(図2E)。比較的拡散性の高いSRHとは対照的に、イソレクチンは内限膜(ILM)を十分に透過しません。この制限は、ILMの下にイソレクチンを含む溶液をガラスピペットで注入することで克服できます。SRH血管のラベリングでは、インサートに装着する前に組織を染色することをお勧めします。SRHは生体組織のみを染色し、パラホルムアルデヒドまたはカルボジイミドのいずれかで固定すると標識が消失します。

2番目の実験(図3

ディスカッション

親水性PTFE膜の高い生体適合性と溶液の透明性は、生体組織を扱う場合に有利です。この調製は、光応答^8〜10のパッチクランプ記録のための以前の研究で成功裏に使用されています。ここでは、このアプローチを網膜全体の構造解析にどのように採用できるかを示します。

ボーラスローディング技術は、生体組織の標識に効果的に使用できます。この技術は、メンブレンインサートの構造的サポートによって支援されます。アプリケーションには、カルシウム指示薬⁹のローディング、蛍光^{マーカー11}による組織の染色、または標識リガンド¹²が含まれます。

固定組織処理も、支持膜の使用から恩恵を受けることができます。シナプス後密度タンパク質の外観の違いは、固定時間と固定剤の性質によって異なります⁵.固定時間が長いほど、組織の保存は優れていますが、固定剤によって架橋されたシナプスタンパク質の抗体認識は不十分です。固定時間が短いと、組織の保存は不十分になりますが、点状...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ミリセル細胞培養インサート、12 mm、 親水性PTFE(バイオポア)、0.4 μm	ミリポア	PICM01250
インスリン注射器、1 ml	ベクトン ディキンソン	309659
はさみ	ファイン サイエンス ツール	15003-08	解剖
鉗子、デュモン #55、イノックス	ファイン サイエンス ツール	11255-20	解剖
クライオスタット	ライカ	各種
共焦点顕微鏡システム	ニコン	様々な
毛細管ガラス	ワールド精密機器	1B150F-4
P-97 フレーミング/ブラウン マイクロピペット プーラー	サッター機器
ピコスプリッツァーIII	パーカーハネフィン
ガラス底文化皿MatTek	株式会社	P35G-0-14-C
ペトリ皿	ファルコン	1008
目盛り付きトランスファーピペットVWR16001-180
マルチウェルプレート、24ウェル	ベクトンディキンソン	351147
カバーガラス、#1	電子顕微鏡科学	72200-30
ポリサイン接着スライド	電子顕微鏡科学	63412-01
顕微鏡スライド	グローブ	1301
液体ブロッカー	電子顕微鏡科学	71312
VECTASHIELD実装媒体	ベクトル研究所	H-1000
OCT中	さくら	4583
パラフィルム 実験室用フィルム	フィッシャー	13-374-10
ダウ コーニング 高真空グリース	シグマ・アルドリッチ	Z273554
マウス 抗PSD95	ミリポア	MABN68	抗体
ロバ アンチマウス アレクサ 568	Invitrogen	A10037	抗体
イソレクチン アレクサ 488	Invitrogen	I21411
Chemiblocker	Chemicon	2170S
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
スルフォロダミン	Sigma-Aldrich	341738
Carbodiimide	Thermo Scientific	22980	EDC
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	P6148