マウスのリンパ管内免疫療法やワクチン

サマリー

予防的および治療的ワクチン接種は、多くの場合、週のリンパ節へのワクチンの排水および免疫細胞の関与の結果として、乏しいによる強力な免疫応答を刺激することができない。リンパ節へのワクチンの直接注射することによって、いわゆるリンパ内注射は、ワクチンの有効性を強く改善することができ、ワクチン用量を低減することができる。

要約

ワクチンは、典型的には、免疫応答の刺激のために、皮下または筋肉内に注射する。これが成功するかどうかは、抗原提示細胞が欲しかった免疫応答を生成するためのリンパ球と対話することができ、リンパ節へのワクチンの効率的な排液を必要とします。強さと誘導される免疫応答のタイプは、密度や周波数の相互作用ならびに微小環境、サイトカインの、特に内容によって異なります。末梢注入されたワクチンの分画のみがリンパ節に到達すると、マウスおよびヒトのワクチン接種、 すなわちリンパ内注射、鼠径リンパ節へのワクチンの直接注射により実施した。男性では、手順は、超音波によって導かれる。マウスでは、小さな（5〜10 mm）の切開が、リンパ節の局在化及び鉗子で固定化されているが、麻酔した動物の鼠径部に形成されており、ワクチンの10〜50μlの容量を視覚的制御下に注入される。切開部を外科用縫合糸を使用して、シングルステッチで閉じられる。マウスを、プラスミドDNA、RNA、ペプチド、タンパク質、粒子、および細菌ならびにアジュバントでワクチン接種し、ワクチンのすべてのタイプに対する免疫応答の強力な改善が観察された。ワクチン接種のリンパ管内方法は、従来のワクチン接種が不十分な免疫または利用可能な場合、ワクチンの量が限られているが生成状況では特に適しています。

概要

ワクチンは、典型的には、免疫応答の刺激のために、皮下または筋肉内に注射する。この方法の成功は、抗原提示細胞は、T-およびB細胞応答の生成のためにリンパ球と相互作用することができるリンパ節へのワクチンの効率的な排水を必要とする。また、強​​度と誘導される免疫応答のタイプも密度や周波数などの相互作用ならびに微小環境自体、サイトカイン、特に内容によって異なります。末梢組織に注入されたワクチンのごく一部は、リンパ節に到達すると、リンパ節へのワクチンの直接注射によりマウスおよびヒトのワクチン接種は、免疫応答部位が生成された、行われている。ヒトにおいて、手順は、超音波、また、リンパ系における可視化および診断のための造影剤の投与のために使用した手順によって案内される。マウスでは、手順が侵襲的である。ここでは、小さな（5〜10 mm）のincisioN麻酔した動物¹の鼠径部で行われ、リンパ節はローカライズやピンセットで固定化して、ワクチンの10〜20μLの容量は、視覚的な制御の下で注入されて、10μlを最初の注射のために使用され、若いマウスでは小リンパ節、20μlの大きなリンパ節を有するより古いか、すでにプライミングしたマウスのリンパ節に注入することができる一方。切開は、外科用縫合糸を使用して、シングルステッチで閉鎖することができる。この方法によって、マウスをプラスミドDNA ^2,3、メッセンジャーRNA ^4、1,3,5,6ペプチド、タンパク質^{7-10、11粒子} 、細菌¹²ならびにアジュバント^7,13、および免疫の強力な改善でワクチン接種されているワクチンは、すべての種類に対する応答が観察されている。ワクチン接種のリンパ管内方法は、従来のワクチン接種が不十分な免疫を生産するか、利用可能なワクチンの量が限られていたり、バージョンである状況では特に適しています高価なY。人間では、予防接種のリンパ管内の方法は、アレルギー患者^14,15にまたは癌^16〜21の患者に適用されている。現在の概念はリンパ管内の方法は、筋肉内および皮下注射などの他の注射方法より侵襲的であるということですが、痛みの知覚は、静脈穿刺¹⁵後よりも高いではありません。これは、リンパ内ワクチン接種は、予防および特に治療予防接種の他の方法に代わる、または補完になることが期待されている。この記事では、リンパ管内ワクチン接種の手順は、マウスで実行する方法を詳細に説明します。記載されているすべての手順は、チューリッヒ州立獣医庁によって承認され、スイス連邦のガイドラインおよび科学的目的のために使用される動物の保護に関する指令を実施した。

プロトコル

1。マウスの麻酔

1. 緩衝生理食塩水でケタミン（解離性麻酔薬）およびキシラジン（鎮静および鎮痛）を混合することにより、麻酔薬を準備します。最終溶液中のケタミン及びキシラジンの濃度は、それぞれ、12.5および2 mg / mlのです。
2. 25〜30gの針で注射器を用いて腹腔内投与によりマウスに麻酔薬を注入する。体重10gあたり0.1mLを使用してください。
3. 角膜の乾燥を防ぐために、マウスの目に眼軟膏を適用します。
4. マウスが十分にピンセットでその足やつま先をつまんで麻酔されていることを保証する。マウスがピンチに反射神経と反応しない場合は、手術に進みます。マウスは反射神経や筋肉の収縮とピンチに反応する場合は、1〜2分待ってからピンチテストを繰り返します。それでもマウスが反応した場合は、新しい動物とマウスを交換し、以降の手順1.2から手順を繰り返してください。

2。私は外科マウスの鼠径部のncision

1. 仰向けにマウスを置きます。
2. 消毒エタノール（70％）で1鼠径部を濡らす。より良好な消毒を提供するため、鼠径部をエタノールで消毒前のファーを除去するために剃られてもよい。
3. 後ろ足を取り、股関節の約90°の角度を生成する股関節を曲げる。
4. 湾曲したmicrodissecting鉗子を使用して、股関節を曲げた鼠径部でのマウス皮膚を取り、少し湿らせた肌を引き上げます。
5. 鉗子で皮膚を保持しながら、外科はさみを使って皮膚を介して小切開（<5 mm）をカット。
6. 切開部に閉じたハサミの先端を配置し、さらに、切開の中にそれを保持しながら、はさみを開くことによって、切開を開きます。これは、皮膚が破れの原因になり、10mm未満の直径を生成しなければならない。注：可撓性光ガイドを有する冷光源は、可視性を改善するために使用することができる。古い中マウス、特に男性、リンパ節の同定は、鼠径部における多くの脂肪組織に困難である。

3。リンパ内注射

1. 28〜30 Gの皮下注射針と注射器（0.5ミリリットル以下）を調製、短い斜面は長くベベルすることが好ましい場合がある。ワクチンの吸引除去10μlを注入し、注射器は、空気を含まないことを保証する。
2. 湾曲した鉗子と、閉じたハサミの先端の助けを借りて、鼠径リンパ節を局所化。リンパ節は、より白っぽい脂肪組織内で灰色表示され、さらに入力し、リンパ節を残して求心性と遠心性毛細血管を介して同定することができる。
3. 湾曲鉗子の枝の間に保持することにより、リンパ節を固定する。
4. シリンジを取り、上に向けベベルとリンパ節に針を挿入し、全体のかさがリンパ節に入ることを確認すること。
5. ワクチン（10μl）を注入する。もしリンパNODeは（爆破）腫れている、注入が成功したと仮定することができます。針がリンパ節に深く十分に配置されていない場合、一部または全体のワクチンが漏れやリンパ節に入らないことがあります。針が深すぎる挿入されている場合は、注入されたワクチンは、皮下リンパ節の下にリリースされます。後者の例では、注入を繰り返したり、新しい未処理のマウスでマウスを交換します。

4。縫合することによって切開を閉じる

1. 無菌手術用縫合糸のパックを開きます。
2. 針本体の先端部に針ホルダとの縫合針をつかむ。第1ラチェットキャッチまでそれを絞ることによって針ホルダを締めます。
3. （歯又は非歯付き鉗子または皮膚のフックを使用することができる、外科医の好みに応じて）鉗子を用いて切開部の片側に皮膚のホールドを取る。針CAを挿入2-3ミリ切開部の端から、皮膚の外部から侵入。
4. ロース鉗子で皮膚のホールドENとピンセットで切開の反対側を把握する。針CAを挿入2-3ミリ切開部の端から、肌の内側から侵入。
5. 針ホルダを緩め、ピンセットで針先を把握する。数匹のマウスを治療する場合は、短い方の端を残して（最初の針挿入点の外にトレッドの便利な長さを残して、皮膚を​​通してトレッド針を引いて、5月10日のマウスは1縫合針を操作でき/）トレッド。
6. 標準外科医プロトコルによる好ましい結び目を作る。切開部が10mm以下である場合に一針で十分である。大きな切開のために、第二のステッチを作る。

5。ポストの運用トリートメント

1. ケージにマウスを置き、暖かい保つために組織にカバーしています。複数のマウスを治療する場合、暖かく保つために互いに近接して配置します。彼らは目覚めまで、または、暖かいパッドの上にマウスを置くアップ。
2. 彼らが目を覚ますまで、マウスを観察します。
3. 癒しだけでなく、創傷感染症などの他の臨床症状を巻かに関しては毎日マウスを観察します。傷は通常、十分に2日以内に閉鎖し、手順の7日以内に癒されます。

結果

マウスではリンパ管内注射の手順は、外科的な性質にもかかわらず、まっすぐ進むと、比較的高速である。訓練を受けた人は3〜4分で手続きを行うことができます。一針で閉じられ切開は、典型的には2日以内に治癒する（ 図1）

リンパ内ワクチン接種またはimmunizationがmRNAと行ったプラスミドDNA、ペプチドタンパク質ウイルスおよび細菌2タンパク質ホスホリパーゼA2（PLA2）、メジャー蜂毒アレルゲンによる免疫後、抗体の製造を説明Figure。 CBAマウスに、0.01、0.1、又は皮下（sc）またはリンパ内（ILN）注射により水酸化アルミニウムに吸着した10μgのPLA2で0日、14日、および28日に免疫した。 PLA2-特異的抗体（IgG2aの）は、8週間後に血液で測定し、その結果を時uの10μgのPLA2が必要としながら、0.01μgのPLA2は、強力な抗体応答を刺激するのに十分であったことを明らかにした皮下経路^9を歌う。

ディスカッション

リンパ管内免疫化および免疫療法は、抗体応答およびT細胞応答の両方を刺激するため適切であることが示されている。このビデオの記事で示されているように、ワクチン接種のリンパ管内の手順は、マウスにおいて強力な免疫応答を刺激するための迅速かつ簡単な方法です。訓練された外科医は、3〜4分の間に手続きを行うことができます。セッションも1は、一般的に麻酔や縫合をしていると第二外科医は切開や注射をしている2の外科医の間で共有することができます。手続きの効率は、外科医は、まだ十分に訓練を受けていない場合は特に、他の予防接種法よりも演算子に依存しています。しかし、経験豊かなオペレータが、免疫応答解析により定量的にモニターし、実験結果を再現することができる。方法の変形は、脾臓^1,2にワクチンを注入することである。準備はリンパ管内注入のそれと似ていますが、目切開の電子サイズが典型的に大きく、2針は、それを閉じるために行われる。針挿入または注入によるリンパ節の損傷が伴うだろうが、このような脾臓内免疫化の主な利点は、脾臓は、より大きな注射体積およびより頻繁な注射を適用することができる見つけ、リンパ節よりもヒットすることが容易であることであり、そ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケタミン(Ketasol-100)	Graeub AG、スイス		麻酔薬
キシラジン(ロンプン)	バイエル、ドイツ		麻酔薬
Viscotears Eye-Gel	Novartis、スイス		麻酔中に目が乾燥するのを防ぐため。
BD Micro-Fine 0.5 ml	BD Medical, France		29 G インスリン注射器、永久針付き
6-0 Dermalon Monofilament Nylon	Covidien, MA, USA		縫合糸用 (0.7 メートル法、18 G、45 cm、青)
湾曲した鉗子、4.5 in	Polymed, Switzerland		節の切開と保持用
ストレート手術用ハサミ、4.5 in	Polymed, Switzerland		切開用
ニードルホルダー、5.5インチ	Polymed, Switzerland		合糸で切開を閉じるには

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