方法論記事

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

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DOI：

10.3791/51058

⸱

2014年1月20日

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

この記事について

サマリー

単離および位相コントラストおよび蛍光顕微鏡によって撮像するためのショウジョウバエ精巣サンプル（ライブおよび固定）の製造方法は、本明細書に記載されている。

要約

キイロショウジョウバエは、広く様々な生物学的プロセスを解明するために使用されている強力なモデル系である。例えば、 ショウジョウバエの雌雄生殖系の両方の研究は、現在の減数分裂の理解だけでなく、幹細胞生物学に大きく貢献しています。優れたプロトコルは、 ショウジョウバエの卵巣と精巣3月12日の単離およびイメージングのための文献で ​​利用可能です。ここでは、顕微鏡分析のための切開およびショウジョウバエ精巣の調製方法は、添付のデモビデオで説明されています。成人男性の腹部から精巣を単離し、蛍光顕微鏡による分析のために精巣を固定し、免疫染色のために位相差顕微鏡ならびにプロトコルによる分析のために生きている組織のスライドを調製するためのプロトコルが提示される。これらの技術は、dは示すショウジョウバエの変異体の特徴付けにも適用することができる精子形成においてだけでなく、タンパク質の細胞内局在を可視化する中efects。

概要

ショウジョウバエの精巣は、幹細胞の調節、減数分裂および精子の開発13-18を含む多くの生物学的プロセスの研究のための理想的なモデル系である。精母細胞とその減数分裂のスピンドルは精子形成の間に大規模なので、細胞学的分析のための便利な、リラックスした細胞周期チェックポイントである細胞周期遺伝子の変異の研究を促進する。異なる細胞型は、精巣の長さに沿って順序付けられた進行において観察することができ、精子形成を中断させるが、この全体的な配置に変化をもたらすことができる。 ショウジョウバエの遺伝学的ツールと組み合わせ、これらの機能は、精子形成21〜23の変異解析を容易にした。

ショウジョウバエの精子形成の段階は明確に定義されています。嚢胞内で同期開発の生殖系列細胞は精巣の長さに沿って精子形成の段階を経て順次進行する。 BOの間に雄の生殖細胞の有糸分裂と減数分裂番目、細胞質分裂が娘細胞がリング運河（ 図1）として知られている細胞質の橋で接続されたままである不完全な発生します。精巣の先端チップは、一次精母細胞の16細胞嚢胞を生成するために、不完全な細胞質分裂で4糸分裂を経る精原細胞に生じる生殖細胞系列幹細胞の集団が含まれています。減数分裂前S期の後、一次精母細胞はG2、〜25倍〜90時間の間に細胞容積の増加に長期の成長期に入る。二次精母細胞とそれぞれ半数体精子細胞の64細胞嚢胞の32細胞嚢胞の形成における減数分裂Iおよび減数分裂IIの結果を通じて進行。未熟、円形精子が成熟精子を形成するために、広範な細胞リモデリングを受ける。減数分裂後の細胞は、伸長のバンドルと成熟した精子細胞、特に、精巣の容積の大部分を占める。

T女性のハエに対する機能精子の彼の成功の輸送は、いくつかの対になった構造（精巣、精嚢、および付属腺）および単一射精管で構成されている男性生殖器系、（ 図2）の異なる部分間の調整が必要になります。精子は、精巣内で生産され、交尾24まで精嚢内に格納されます。付属腺は、精液を生産分泌細胞が含まれています。精嚢からの移行精子精嚢および付属腺の両方に接続されて射精管、内の精液と混合される。精子と精液のこの混合物は、最終的には雄雌の腹部25の後方端部に配置射精バルブを介してフライの膣内に雄から排出される。精液中のタンパク質は、REPにspermathecaの複数形と呼ばれる特殊な器官内で精子の長期保管のために必須であるショウジョウバエのメス26のroductiveトラクト。

ショウジョウバエの精巣の単離および精子形成の様々な段階での細胞の可視化のための優れた方法は、科学文献3月12日で利用できます。私たちは、ここに添付のビデオデモで、これらのプロトコルの例を提示することによって、知識のボディに追加します。位相差顕微鏡のための生精巣試料の調製のためのプロトコールは、以前に記載された方法27に基づいている。ホルムアルデヒド固定および精巣の免疫染色のためのプロトコルは、先に説明した方法28に基づいています。本明細書に記載されるアプローチは、 ショウジョウバエの精子形成（例えば、ダイニンの役割を評価するために、 ショウジョウバエの精子形成中のマイナス端指向性微小管モーター）の多くの研究で使用されてきた。

基本的なプロトコルに加え、提案がvaryinために提供されG解剖精原細胞、精母細胞、または成熟精子を濃縮するようになっている。嚢胞がそのまま残るか、必要に応じて破壊さどちらように精巣を処理するための異なる方法が記載されている。モデル系としてショウジョウバエ精巣を使用する利点は、 ショウジョウバエの卵母細胞および胚と比較して、抗体および色素が容易に精巣からの分散次の細胞に浸透することができ、より少ない洗浄ステップが必要とされる、ということであるため、プロトコルは、比較的に行うことができる短い時間。

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プロトコル

1。精巣の解剖

  1. CO 2のストリームを使用して、ボトルまたはバイアル中のハエを麻酔し、フライパッドに移す。
  2. 並べ小さな絵筆を使って解剖顕微鏡下で飛んで、目的の遺伝子型のショウジョウバエの雄の（実験に応じて）適切な数を収集します。 （2-5日齢）少し古い男性は、細胞を検査するための理想的であるのに対し（0-2日齢）の若い男性は、精子形成の初期段階を通じて細胞を検査するための理想的な（ 例えば 、精原細胞、精母細胞、早期減数分裂後の精子細胞）精子形成の最終段階にある（特に、成熟精子）。
  3. 各（解剖時に液体中に浮遊するからハエを防ぐために）飛んでから翼を削除するために鉗子を使用してください。
  4. 上のシリコーン被覆解剖皿に降下;〜リン酸緩衝生理食塩水（PBS 130mMのNaClを、7のNa 2 HPO 4、3mMののNaH 2 PO 4）を500mlの追加黒の背景。他の水溶液が正常精巣解剖3のために使用されている。
  5. ポイントは、その場の前の方に鉗子、胸部でそれを把握し、PBSドロップでそれを浸す。解剖顕微鏡を通して見ながら、それが腹部から外れるまで後方に外性器（腹側腹部の後端に位置ダークブラウン構造）を把握し、引っ張​​って鉗子の別のペアを使用しています。ほとんどの場合、精巣、精嚢、および付属腺は外性器と腹部に沿ってから削除される、そうでない場合には、腹部に鉗子の単一の対を挿入し、精巣を引き出す。
  6. PBS降下の二対の鉗子（ 図2）を用いて付属腺および外性器から分離睾丸。野生型の精巣は、簡単に自分の黄色い色で隣接白の組織とは区別される。 2すぐにステップ進みます。
  7. pharate男性（ 私から精巣を単離するために。。電子蛹のケース内に囲まれている）、追加のステップは、第蛹ケースからハエを除去することを含むことを行う必要があります。この手順は、以前に別の場所で31記載されている。ステップ1.2から始まる大人の精巣の場合と解剖を進める。
  8. 幼虫男性から精巣を単離するために、 ショウジョウバエの幼虫の卵巣32を単離するためのプロトコルの変更を行う。簡単に言うと、オスの幼虫は脂肪体の後部3分の1に埋め込まれた大規模な、明確な、楕円形の構造（幼虫精巣）のペアが存在することによって、女性の幼虫と区別することができる。幼虫の精巣を単離するために、部分的にフレイ幼虫卵巣の単離のために説明したように腹部から精巣と周囲の脂肪体を分離するために男性の幼虫を開きます。本明細書に記載されたプロトコルのステップ2に直ちに進む。精巣は、後述する直前卵巣32について記載したように（2.3又は3.14〜ステップ）に取り付け脂肪体から除去することができる。

2。サンプル調製とライブイメージング

  1. 優しく角のガラスカバースリップ上のPBSで4-5 mLの低下で精巣の2〜3ペアを配置するためにピンセットを使用してください。少なすぎる液体は時に押しつぶされ、細胞が破裂する原因となりますのに対し、あまりにも多くの液体が押しつぶされた場合に適切に広がるから細胞を防ぐことができます：PBSボリュームに精巣数の比を調整する必要があることに注意してください。オプション：使用シリコン処理カバーがステップ3.2でのスリップをカバーするために、組織の接着を最小限にするためにスリップ。
  2. 押しつぶし中のスライド上に引き裂か領域からその精巣の内容が主になり、出力に注意（調製において所望の生殖系列細胞型の存在を最大にするように適切な位置に各精巣オープン引き裂くためにピンセットを使用しステップ）精原細胞および精母細胞を濃縮するため、その先端チップ（レベル1、 図2B）に隣接して精巣を開き涙。精母細胞および精子細胞を濃縮するため、涙は、POSでの精巣を開くレベル1（レベル2、 図2B）に少し基礎ition。より成熟した生殖細胞系細胞を濃縮するために、涙は曲率が（レベル3、 図2B）を開始する場所に近い精巣を開きます。
  3. 優しく睾丸をつぶすためにカバースリップの上にガラス顕微鏡スライドを配置し、一人でカバースリップの重量が適切に押しつぶさ試料を得るために十分であるように手動で圧​​力を加えないでください。気泡をトラップ避けるようにしてください。オプション：使用したポリ-L-リジンコーティングした顕微鏡は、ステップ3.2にスライドする組織の付着を促進するためにスライドする。
  4. 位相差顕微鏡による生きた細胞を観察するために（理想的には準備の15分以内）すぐに準備を使用してください。精巣内の蛍光タグ付きタンパク質の発現を有するトランスジェニックハエのために、生きている細胞は、この段階で、蛍光顕微鏡で検査することができる。代わりに、固定と抗体染色（プロトコル3）に進む。
  5. 優しくクリーニングWを使用してカバーガラスの下から余分な液体を吸い上げる生殖細胞に焦点が明らかになるまでIPEは、調製物の平坦化を可能にする。

3。ホルムアルデヒド固定および抗体染色

  1. スナップ（液体窒素バブリングを停止するまで）、液体窒素中で簡単にそれを浸漬金属トングのペアを使用して（プロトコル2）から押しつぶさ精巣を含む各スライドを凍結する。
  2. すぐにカミソリの刃を使用して、カバーガラスを取り外します。
  3. 氷冷95％エタノール（分光光度グレード、メタノールを含まない）で満たされた予冷したガラススライドラックにスライドを転送するために、金属トングを使用する。 10分間-20℃で保存。
  4. PBS +0.1％トリトンX-100（PBS-T）中の4％ホルムアルデヒドを充填したガラススライドラックにスライドを転送するために、金属トングを使用する。 7分間室温で保管してください。
  5. PBSで満たしたガラススライドラックにスライドを転送するために金属製トングを使用してください。室温で5分間、PBSでスライドを洗浄する。 1Xを繰り返します。 （ガラススライドラックでソリューションを破棄することにより、すべての洗浄を行うつまり。それを注ぐ）と新鮮な溶液に置き換えて。
  6. PBSを捨て、細胞膜を透過性にするために、室温で30分間、PBS-Tでスライドを浸す。
  7. 室温で5分間、PBSでスライドを洗浄する。 2Xを繰り返します。
  8. ステップ（オプション）ブロッキング：室温で45分間、PBS中のスライドプラス1％BSAを浸します。
  9. （ステップ3.9および3.11で追加）抗体溶液を閉じ込めるために（目で見えやすい）押しつぶされた組織の周囲にスライド上に円を描くように、疎水性のバリアペンを使用してください。免疫染色を行いながら組織を常に湿った保たれるべきである。
  10. 円内の組織に（抗体によっては、1時50分にPBS-T、1:400で希釈）一次抗体の30〜40 mLを加え。ブロッキングを実行した場合、PBS-T +1％BSA中で一次抗体を希釈する。 （ 図4における中心体の染色のため）、抗-γ-チューブリン抗体を1:100に希釈した。 例えば （湿った、暗い室内でインキュベートする。閉じたプラスチックの箱室温または4℃で一晩2時間湿ったペーパータオル）と
  11. 洗浄は室温の3倍で5分間、PBS中でスライドする。ブロッキングを実行した場合、PBS-Tで二回洗浄し、PBSで一回（室温で各5分）。
  12. 組織に蛍光団結合二次抗体（PBS中1:400希釈）の30〜40 mlを加え、室温で1〜2時間、暗所でインキュベートする。
  13. 室温で5分間、PBSでスライドを洗浄する。 2Xを繰り返します。
  14. 円内の組織にDAPI溶液（PBS中0.2 mg / ml）を30〜40 mLを加え。
  15. 優しく、気泡を捕捉しないように注意しながら、組織の上のガラスカバースリップを配置。気泡が表示された場合は、気泡がカバースリップの側面から脱出するまで、スカッシュを破壊することなく、カバーガラスの周りに慎重に移動します。
  16. クリーニングに使用したスライドの端から余分なDAPI​​ブロットする拭き取ります。
  17. 明確なマニキュアを使用してスライドにカバースリップをシール。
  18. この準備を使用する蛍光顕微鏡による免疫染色した細胞を表示するには、次の3〜4時間以内で。 （少なくとも数週間まで）スライドの長期的な保存のため、DAPIでメディアをマウントグリセロールベースの​​ハードを使用し、-20˚Cで店舗スライド
  19. 別の方法として、（抗原によって異なる）メタノールの代わりに、ホルムアルデヒドのサンプルを固定します。ステップ3.2を通してプロトコル全体を完了した後、-20℃で10分間メタノールに押しつぶさ精巣のスライドを浸す以降のステップ3.5に進みます。

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結果

ショウジョウバエの雄性生殖器官の解剖正しくペアの例は、 図2Aに示されている。成人男性のハエの腹部から削除精巣は通常、射精管（茶色、 図2A '）と付属腺（緑、 図2Aのペア'精嚢（青、 図2A '）の対を介して）に接続されている。添付体細胞組織のほとんどから精巣を分離するために、射精管および付属腺は切り離され、このような唯一の精巣対および精嚢ことを破棄しなければならない（ 図2Bおよび2B '）のまま。精嚢は、さらに処理されるだけ精巣対を残して、除去することができる。

精巣郭清のために選択された成人男性の年齢は重要な検討事項である。若い男性（羽化​​後0-2日間）で、精嚢は小さいとほぼ空、および精巣（ 図2のように）その最大直径である。若い男性を使用すると、生殖...

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ディスカッション

野生型のハエの精巣は、容易に、それらの黄色（これとは対照的に、隣接する白の組織）に識別することができますが、 白の変異型ハエの精巣は白であり、従って、時折、腸と混同することができます。 P-エレメントで見つかったミニ白遺伝子が精巣内の色素蓄積を促進しないので、 白の背景に、典型的には、ほとんどのトランスジェニック株は、、また白い精巣を持っています。 ショウジョウバエの精巣は、色で区別できない場合には、他の容易に認識可能な特徴は、対12での螺旋パターンと出現が含まれています。一部の労働者はそれが簡単に精巣12を隔離するために代わりに鉗子の解剖針を使用することを見つけることに注意してください。

このプロトコルの重要なステップは、潰れ精巣の調製である。一つの有用なアプローチは、数ミリように精巣を含むカバースリップの上にスライドを置くことで、表面TEカバースリップ上のPBS nsionは、スライドに向けた組織を含むカバースリップを持ち上げる。この方法は、嚢胞...

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

著者らは、リー·ラボでカレンヘイルズから専門家の助言で精子形成を研究するため、これらの受け入れ方法を確立するために、マイケル·アンダーソンに感謝したいと思います。 H·小田とY秋山-ODAは、寛大に、γ-チューブリン-GFPは株式を飛ぶ提供。この作品は、LAL（GM074044）にNIHのR01の助成金によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
シルガードワールド精密機器SYLG184Kimaxペトリ皿からシリコーンコーティング解剖皿を作るための2液型シリコンエラストマー
PAPペンフィッシャーサイエンティフィックNC9888126テッドペラ #22309
クリアネイルプロテクターウェットアンドワイルド7780235001
プロロングゴールド 退色防止剤 DAPILife TechnologiesP36931
マウス抗γ-tubulin抗体(クローンGTU-88)Sigma-AldrichT6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG ジャクソン・イムノリサーチ115-165-003
トリトン X-100フィッシャー・サイエンティフィBP151-100
エタノールフィッシャー・サイエンティフィAC61511-0040
メタノールフィッシャー・サイエンティフィA412-4
16% ホルムアルデヒドサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック28908
シグマコートシグマ・アルドリッチSL2メーカーの指示に従って、カバースリップ
DAPISigma-AldrichD-95420.5 mg/ml in 75% ethanol; -20 > 保存してください。C
NaClリサーチプロダクツインターナショナル株式会社S23020
Na2HPO4Sigma-AldrichS9763
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
Kimwipes 繊細なタスクワイパーFisher ScientificS47299
BSAResearch Products International Corp.A30075分子生物学グレードの
ガラスCoplin染色ジャー、スクリューキャップ電子顕微鏡科学70315
単一のつや消し顕微鏡スライドコーニング2948-75X25
ポリ-L-リジンコーティング顕微鏡スライドPolysciences、Inc.22247-1オプション (未処理の顕微鏡スライドを交換するため)
角型カバーガラスコーニング2865-22
カミソリの刃フィッシャーサイエンティフィック12-640
キマックス ペトリ皿フィッシャーサイエンティフィックS31473キンブル #23060 10015 EMD
鉗子デュモン52100-51Sパターン 5 INOX
ステミ 2000-CS ステレオスコープカールツァイス
エクリプス 80iニコン
プラン-フルーア 40X 対物レンズニコン
アクシオフォットカールツァイス
プラン-ネオフルアー Ph2 40X 対物レンズカールツァイス
ック ック ック

参考文献

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