精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

サマリー

単離および位相コントラストおよび蛍光顕微鏡によって撮像するためのショウジョウバエ精巣サンプル（ライブおよび固定）の製造方法は、本明細書に記載されている。

要約

キイロショウジョウバエは、広く様々な生物学的プロセスを解明するために使用されている強力なモデル系である。例えば、 ショウジョウバエの雌雄生殖系の両方の研究は、現在の減数分裂の理解だけでなく、幹細胞生物学に大きく貢献しています。優れたプロトコルは、 ショウジョウバエの卵巣と精巣^3月12日の単離およびイメージングのための文献で ​​利用可能です。ここでは、顕微鏡分析のための切開およびショウジョウバエ精巣の調製方法は、添付のデモビデオで説明されています。成人男性の腹部から精巣を単離し、蛍光顕微鏡による分析のために精巣を固定し、免疫染色のために位相差顕微鏡ならびにプロトコルによる分析のために生きている組織のスライドを調製するためのプロトコルが提示される。これらの技術は、dは示すショウジョウバエの変異体の特徴付けにも適用することができる精子形成においてだけでなく、タンパク質の細胞内局在を可視化する中efects。

概要

ショウジョウバエの精巣は、幹細胞の調節、減数分裂および精子の開発^13-18を含む多くの生物学的プロセスの研究のための理想的なモデル系である。精母細胞とその減数分裂のスピンドルは精子形成の間に大規模なので、細胞学的分析のための便利な、リラックスした細胞周期チェックポイントである細胞周期遺伝子の変異の研究を促進する。異なる細胞型は、精巣の長さに沿って順序付けられた進行において観察することができ、精子形成を中断させるが、この全体的な配置に変化をもたらすことができる。 ショウジョウバエの遺伝学的ツールと組み合わせ、これらの機能は、精子形成^21〜23の変異解析を容易にした。

ショウジョウバエの精子形成の段階は明確に定義されています。嚢胞内で同期開発の生殖系列細胞は精巣の長さに沿って精子形成の段階を経て順次進行する。 BOの間に雄の生殖細胞の有糸分裂と減数分裂番目、細胞質分裂が娘細胞がリング運河（ 図1）として知られている細胞質の橋で接続されたままである不完全な発生します。精巣の先端チップは、一次精母細胞の16細胞嚢胞を生成するために、不完全な細胞質分裂で4糸分裂を経る精原細胞に生じる生殖細胞系列幹細胞の集団が含まれています。減数分裂前S期の後、一次精母細胞はG2、〜25倍〜90時間の間に細胞容積の増加に長期の成長期に入る。二次精母細胞とそれぞれ半数体精....

プロトコル

1。精巣の解剖

1. CO ₂のストリームを使用して、ボトルまたはバイアル中のハエを麻酔し、フライパッドに移す。
2. 並べ小さな絵筆を使って解剖顕微鏡下で飛んで、目的の遺伝子型のショウジョウバエの雄の（実験に応じて）適切な数を収集します。 （2-5日齢）少し古い男性は、細胞を検査するための理想的であるのに対し（0-2日齢）の若い男性は、精子形成の初期段階を通じて細胞を検査するための理想的な（ 例えば 、精原細胞、精母細胞、早期減数分裂後の精子細胞）精子形成の最終段階にある（特に、成熟精子）。
3. 各（解剖時に液体中に浮遊するからハエを防ぐために）飛んでから翼を削除するために鉗子を使用してください。
4. 上のシリコーン被覆解剖皿に降下;〜リン酸緩衝生理食塩水（PBS 130mMのNaClを、7のNa ₂ HPO _4、3mMののNaH ₂ PO _4）を500mlの追加黒の背景。他の水溶液が正常精巣解剖³のために使用されている。
5. ポイントは、その場の前の方に鉗子、胸部でそれを把握し、PBSドロップでそれを浸す。解剖顕微鏡を通して見ながら、それが腹部から外れるまで後方に外性器（腹側腹部の後端に位置ダークブラウン構造）を把握し、引っ張​​って鉗子の別のペアを使用しています。ほとんどの場合、精巣、精嚢、....

結果

ショウジョウバエの雄性生殖器官の解剖正しくペアの例は、 図2Aに示されている。成人男性のハエの腹部から削除精巣は通常、射精管（茶色、 図2A '）と付属腺（緑、 図2Aのペア'精嚢（青、 図2A '）の対を介して）に接続されている。添付体細胞組織のほとんどから精巣を分離するために、射精管および付属腺は切り離され、このような唯一の精巣対および精嚢ことを破棄しなければならない（ 図2Bおよび2B '）のまま。精嚢は、さらに処理されるだけ精巣対を残して、除去することができる。

精巣郭清のために選択された成人男性の年齢は重要な検討事項である。若い男性（羽化​​後0-2日間）で、精嚢は小さいとほぼ空、および精巣（ 図2のように）その最大直径である。若い男性を使用すると、生殖.......

ディスカッション

野生型のハエの精巣は、容易に、それらの黄色（これとは対照的に、隣接する白の組織）に識別することができますが、 白の変異型ハエの精巣は白であり、従って、時折、腸と混同することができます。 P-エレメントで見つかったミニ白遺伝子が精巣内の色素蓄積を促進しないので、 白の背景に、典型的には、ほとんどのトランスジェニック株は、、また白い精巣を持っています。 ショウジョウバエの精巣は、色で区別できない場合には、他の容易に認識可能な特徴は、対¹²での螺旋パターンと出現が含まれています。一部の労働者はそれが簡単に精巣^12を隔離するために代わりに鉗子の解剖針を使用することを見つけることに注意してください。

このプロトコルの重要なステップは、潰れ精巣の調製である。一つの有用なアプローチは、数ミリように精巣を含むカバースリップの上にスライドを置くことで、表面TEカバースリップ上のPBS nsionは、スライドに向けた組織を含むカバースリップを持ち上げる。この方法は、嚢胞.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シルガード	ワールド精密機器	SYLG184	Kimaxペトリ皿からシリコーンコーティング解剖皿を作るための2液型シリコンエラストマー
PAPペン	フィッシャーサイエンティフィック	NC9888126	テッドペラ #22309
クリアネイルプロテクター	ウェットアンドワイルド	7780235001
プロロングゴールド 退色防止剤 DAPI	Life Technologies	P36931
マウス抗γ-tubulin抗体(クローンGTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG	ジャクソン・イムノリサーチ	115-165-003
トリトン X-100	フィッシャー・サイエンティフィ	BP151-100
エタノール	フィッシャー・サイエンティフィ	AC61511-0040
メタノール	フィッシャー・サイエンティフィ	A412-4
16% ホルムアルデヒド	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック	28908
シグマコート	シグマ・アルドリッチ	SL2	メーカーの指示に従って、カバースリップ
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9542	0.5 mg/ml in 75% ethanol; -20 > 保存してください。C
NaCl	リサーチプロダクツインターナショナル株式会社	S23020
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9763
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
Kimwipes 繊細なタスクワイパー	Fisher Scientific	S47299
BSA	Research Products International Corp.	A30075	分子生物学グレードの
ガラスCoplin染色ジャー、スクリューキャップ	電子顕微鏡科学	70315
単一のつや消し顕微鏡スライドコー	ニング	2948-75X25
ポリ-L-リジンコーティング顕微鏡スライド	Polysciences、Inc.	22247-1	オプション (未処理の顕微鏡スライドを交換するため)
角型カバーガラス	コーニング	2865-22
カミソリの刃	フィッシャーサイエンティフィック	12-640
キマックス ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィック	S31473	キンブル #23060 10015 EMD
鉗子	デュモン	52100-51S	パターン 5 INOX
ステミ 2000-CS ステレオスコープ	カールツァイス
エクリプス 80i	ニコン
プラン-フルーア 40X 対物レンズ	ニコン
アクシオフォット	カールツァイス
プラン-ネオフルアー Ph2 40X 対物レンズ	カールツァイス

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