心筋内細胞送達：マウスハーツの観測

サマリー

例えば、高血圧または心筋梗塞などの心血管疾患のマウスモデルにおける心筋細胞送達は、回生広く研究において、異なる細胞型の治療可能性を試験するために使用される。そのため、詳細な説明およびこの外科処置の明確な可視化は、小型げっ歯類の心血管細胞治療の分析の限界と利点を定義するのに役立ちます。

要約

以前の研究は、細胞送達は、サイトカインおよび心臓組織の血管再生および細胞生存を増加させる因子の放出によって心機能改善を促進することが示された。また、さらなる観察は、例えば、心臓幹細胞、間葉系幹細胞およびcardiospheresなどの特定の幹細胞は、心筋細胞、平滑筋細胞および内皮細胞に分化することによって周囲の心筋層内に統合する能力を有していることが明らかになった。

ここでは、確実に免疫枯渇マウ​​スの左心室壁への非収縮細胞を送達するための材料および方法を提示する。この顕微手順の顕著なステップは、麻酔および鎮痛注射、気管内挿管、胸を開いて、無菌の30ゲージの針、精密マイクロリットル注射器で細胞の心と配信を露出させるために、切開を伴う。

心臓収穫、embeddiからなる組織処理NG、切片および組織学的染色は、心筋内細胞注入は、小さな心外地域の被害だけでなく、心室壁にを生成することを示した。非収縮細胞は、免疫不全マウスの心筋壁に保持され、心臓の圧力と機械的負荷から保護する可能性線維性組織の層に囲まれた。

概要

様々な細胞送達プロトコルは、ヒト患者におけるこの実験手順の効率を翻訳し、有効性及び安全性を目的とした心血管疾患のマウスおよびラットモデルにおいて試験されている。ラット心臓順行³と逆行⁴冠動脈内の細胞注入でも使用することができるのに対し、小型のげっ歯類の心の中で、心筋内細胞送達は、細胞送達^1,2の最も実現可能な方法である。どちらの方法も限界と利点を持っている。冠動脈内経路を介して細胞送達は、グローバルセル³普及^を促進する上で直接的な筋肉内注射の理論上の利点を有するが、それはまた、冠動脈塞栓^3,5を引き起こす危険性を有している。心筋内配達の制限事項は、機械的な損傷、急性炎症、および心筋障害^6,7に関連している。ヒトでは、心臓の修復のための細胞は、心内膜または外科心外膜を通して心筋内注射によって送達されるアプローチまたは冠動脈内動脈ルート⁸による。経血管経路による注射は、急性心筋梗塞および再灌流心筋症患者に適しているが、完全閉塞や影響領土⁹の血管内であまり流れの場合にはできないことがあります。経心または経心外膜注入による心室壁への直接注入は、患者の健康状態に応じて技術的に可能である。実際、経心外膜注射用開胸手術が必要であり、経心ための実行可能な虚血または心筋瘢痕⁹の部位を区別するために必要とされる各患者の電気生理学的マッピングに近づくが、この技術は^、10,11安全であることが示されている。

重要なのは、細胞治療の研究に移植するための最良のセルの選択は、調査中です。短期分析（4週間）は、心臓幹細胞の注入がcardiospheresとして定義することを示した 12または骨髄から¹³サイドポピュレーション細胞瘢痕の大きさおよび細胞死を減少させることによって、心筋梗塞のマウス¹⁴及び¹⁵のモデルラットにおける心機能回復を誘導した。免疫抑制なしのラットの心筋梗塞モデルにおけるcardiospheresの同種移植は、心臓の再生を促進し、安全であることが判明し、内因性の修復機構¹⁵の刺激により心機能を改善しました。心の中Lin-/c-kit +大人の前駆細胞は、in vitroおよびin vivoで自己再生、クローン原性、および多能であることが示され、虚血性ラットの心臓に注射した場合には、障害を受けた心筋壁¹⁶の大部分を再構成していたた導電性の中間サイズの冠状動脈^17を形成する能力。これらの有望なデータがフェーズを煽っIおよびヒトにおけるII臨床試験：自己および同種間葉系幹細胞^（MSC）18の注入は^、19を cardiospheresまたはc-Kitの陽性心臓幹細胞（CSC）虚血性心臓におけるヒト20それぞれは、長期試験において、心機能に有益な効果を示した。それにもかかわらず、大規模な長期追跡及び遡及的メタ分析は、幹細胞療法はなく、予測不可能な結果²¹の範囲内の他、一部の患者に有意な利益を提供することを実証した。それは、これらの制限は、各個人や各疾患のための細胞送達の特定のプロトコルの設計を必要とする可能性があります。

マウスおよびラットモデルにおいて、長期的な研究は、細胞注射は、さらに（12ヶ月）の心機能を改善しなかったことを明らかにした。実際に、ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞（hESCの-CM）の移植片は主として線維性組織^22,23の層によって宿主心筋から単離した。同様の結果は、梗塞マウス²⁴の中心部に骨格筋芽細胞の心筋内移植後に観察されている。 FurthermoRE、梗塞中心部に機能を維持するために、同種のMSCの長期的な能力は、分化²⁵の後に免疫特権の免疫原性状態への遷移によって制限されてきた。

考察上記で概説した課題と展望を考慮して、我々は、マウスの心筋内注射することによって細胞を送達する方法をここに表示されます。我々は心筋細胞収縮特性のない細胞を宿主の心筋に接続されており、薄い線維性バリアで凝集塊を形成していないことを確認します。いくつかのケースでは、この結果が有利であり得るが、以下の分析は、細胞移植は、同様に機能的に接続された心筋の構造を生成するために変調することができる方法を理解するのに有用であり得る。

プロトコル

すべての動物実験は、国際（欧州議会の指令2010/63/EU）と国家（英国内務省、アクト1986）規制に準拠して行った。本明細書に記載の手順は、英国のライセンス当局の下での作業の我々の計画の一部であり、記録の目的のために行われていない。

1。細胞の調製

このプロトコルは、デモ用の特定の細胞株（ヒト胎児腎臓HEK293細胞）の調製を記載する。細胞特異的なプロトコルは、成長して、最終的には、特定の細胞系統に分化多能性または成体幹細胞を区別するために使用されなければならない。

1. DMEM培地（高グルコース、4,500ミリグラム/ L）中の細胞を、1％ピルビン酸ナトリウム、2mMグルタミン、1％の抗生物質ペニシリン/ストレプトマイシン及び10％ウシ胎児血清（FBS）を含有する成長する。一つの10cmプレートは通常、午前1時03分で分割されるべきであり、メディアは2日ごとに新鮮な補足。
2. trypsで穏やかに細胞を処理1：01に記載されるようにDMEM培地で1×に再懸濁した。
3. 血球計数器チャンバー内の細胞をカウントし、別のチューブに3×10 ^6個の細胞を収集します。
4. 5分間100グラムで、スイングバケットローターで遠心分離する。
5. 上澄み液を捨て、滅菌したリン酸緩衝液2倍で細胞ペレットを洗浄する。
6. 免疫除去したマウスの左心室に注入するための10 50分の⁶ ULの濃度でPBS 1X中に再懸濁します。

2。手術前の条件

1. 各手術前に、温度制御されたアイソレータ（ 表1 22℃）で、滅菌食物ペレットと水で免疫除去マウス（NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD）を維持する。
2. 層流フードの下免疫除去したマウスの手術を行う。 70％エタノールで作業領域をきれいにし、手術器具（鉗子やハサミ）をオートクレーブ。
3. 手術と回復のための加熱パッドをオンにします。加熱パッドは重要です中に発生した体温の低下および術後を遮断する。
4. リカバリー·加熱パッド上にきれいにし、オートクレーブケージを置きます。
5. 無菌オートクレーブ処理袋に手術室にアイソレータから元のケージでマウスを輸送する。
6. マウスを秤量し、体重に従って注入皮下（sc）投与メデトミジンおよびマウスを麻酔するために0.9％滅菌生理食塩液で希釈した塩酸ケタミンを含有する溶液、ならびに（筋肉組織を緩和するメデトミジン1 mg / kgを、塩酸ケタミン75 mg / kgで）。
7. 完全に麻酔をかけたときに（刺激した後、1〜2分以内にごつま先ピンチ反射を）ケージからマウスを削除しない
8. 胸の左側にある脱毛クリームとスロート面積が適用されます。適切な時間（約2〜5分）した後、水に濡れたティッシュで緩い毛を乾いた布で拭き取ってください。
9. 仰臥位での手術パネル上にマウスを置きます。から外科医の視点位置は、テールダウンヘッドアップ垂直である。
10. 後肢皮下に無菌生理食塩水（ブプレノルフィン）で希釈した0.1〜0.2μgの/ gで鎮痛ソリューションを注入し、綿棒を使用して無菌性溶液のポビドンヨードで剃毛面積をカバーしています。
11. スロート面積に顕微鏡（2.5X目標を）集中する。

3。外科的条件

1. 鈍ハサミで少し輪状軟骨の下に約0.5〜cm長さの正中線腹部皮膚切開を行います。唾液腺を視覚化するために結合組織から皮膚を分離する。
2. 同時に鉗子と磁気胸のリトラクターで各パーツの方に引いて、自然の中線部門での唾液腺を分割し、気管を公開します。
3. 喉頭を公開する側にゆっくりと舌を引っ張る。慎重に気管内に挿管チューブをスライドさせます。チューブの先端が表示されたLを通して見えるarynxと気管。チューブには、しかしはっきりと見えない場合に重要なことに、それは、食道内にある。それを削除して、管の先端の位置を変更してください。
4. 通風機にチューブを接続します。 200μLおよび150ストローク/分で拍出量を設定します。テープで手術パネルの通気チューブを固定します。
5. 鈍ハサミとピンセットで、ヘッド1に垂直尾翼を作る - 左胸部領域の上1.5センチ、長皮膚切開する。
6. 切開を加えずに、結合組織/筋肉層から皮膚やメジャーとマイナーの胸の筋肉を緩めます。
7. 以下のように第三及び第四肋骨の間開胸を行います。
   1. つまんで小さくて丸みを帯びたピンセットで引っ掻いて肋間筋層を穿孔。
   2. 肋間筋層が穿孔された後、最大限に胸腔を開くために胸のリトラクターを配置。その上層の耳介（心房）と左心室（LV）の上部及び中央部である今見える。
8. 細胞を用いた高精度のシリンジを準備します。注射器は、それぞれの注射のために10のULの容積の量を送達することができるはずです。注射器の先端に30ゲージ針をキャスト。
9. 針の開口先端を含む露出のみ1ミリメートルを残して、テープで針上（introcan-W 20 Gから）小さなプラスチック製のカニューレを固定します。これは全体の左心室壁を穿孔し、左心室腔に細胞を注入し、針を防ぐことができます。
10. 5Xの目的の助けを借りて、この倍率で左心室を視覚化し、5つの異なる場所（各注入注入106個、合計10 ULをお届けします）での左心室壁に細胞を注入します。注入が成功した場合は、白い領域と、細胞の主要な逆流がないことは、（注入が成功しなかった場合、動物は、機能分析から除外されます）表示されます。
11. 開創器を取り外します。胸壁Bを閉じます6-0絹縫合糸の2針を持つ2つの別々のリブを囲むY。
12. PBS 1Xでびっしょり綿棒で胸筋と皮膚に潤いと静かにピンセットで元の位置に筋肉を置く。
13. 6-0絹縫合糸の縫い目3-4で皮膚を閉じます。肌を閉じるには、2〜3ステッチと喉の切開を縫合。
14. 麻酔の効果を元に戻すアチパメゾール（1 mg / kgの最終濃度）を注入。
15. とすぐにマウスが自律的に呼吸を開始すると、気管からチューブを取り出して、その右側にマウスを置く。マウスを数分以内に回復すると予想されています。
16. マウスを回して歩いて、時間暖かい回復ケージ（クローズドフィルタートップと小さなIVCケージ）に入れて起動すると。
17. 制御加熱箱（37℃）中で一晩、動物を残す。
18. 手術後の最初の2日間は、回復を支援するために水とペレット食物と一緒にお皿を埋める。

4。手術後の分析

次のように細胞と10コントロール注入されていない心を注入十心臓は組織学的に分析されています。

1. 1週間の注入（ 図1、図3）の後に移植された細胞の分析を実行します。
   1. イソフルランの過剰投与により安楽死させた後、組織を固定し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）20mlで心臓を灌流。 （百分の70から100）のエタノールの割合を増加させるのに固定された組織を脱水し、パラフィンブロックに埋め込む。
   2. 形態素解析のためにヘマトキシリン​​およびエオシンで5ミクロンとシミにミクロトームでパラフィンセクションの心を。
   3. マッソントリクローム染色を使用して結合組織を可視化する。
   4. スライドスキャナ顕微鏡像（ 図1A、2A、3A、3B、および3C）を分析し、デジタルスライドスキャナ顕微鏡を用いて短軸像で心臓全体を視覚化する（ ふぃぎゅ解像度1Bおよび1C）。
2. 以下の上記の分析の後、キシレン中に心臓組織を脱パラフィン、（100％の水）エタノールの割合を減少させるに試験片を浸漬することによって再水和すると、走査電子顕微鏡のための処理（SEM）として：
   1. 1時間、0.1 Mリン酸緩衝液中の1％のタンニン酸で脱パラフィンブロックをインキュベートする。
   2. （25から100まで%）エタノールの割合を増やすことで標本を脱水。
   3. HMDS（ヘキサメチルジシラザン）で乾燥したサンプル。
   4. アチソンシルバーダグと金 - パラジウムでコーティングしてとスタッブス上の標本をマウントします。
   5. 分析走査型電子顕微鏡（ 図2B）のビューのサンプル。

結果

我々は、細長い心筋細胞（ 図1A）と比較して、玉石状に、それらの異なる形態（ 図1）により心臓の細胞から区別可能であるHEK293細胞を注射した。 HEK293細胞は、それらの増加、核コンテンツ（ 図1A）の可能性が高い心筋細胞（ピンク色）と比較して、ヘマトキシリン色素（青色）に、より反応性であった。さらに、宿主組織から注入された細胞を区別するために、HEK293細胞を、注射前にDAPIで2時間標識した。 図1Eに示すように、標識された細胞は、心筋組織に見られた。対照偽手術マウスは、心臓全体（ 図1C）、および組織（ 図1D）の整合性には損傷は認められなかった。

心の全体の短軸像では、注入された細胞は、注射の面積（ 図1B）において均一グループとして見ることができた。グループ化されたCのエルは、トリクローム染色（ 図2A）

ディスカッション

本稿では、我々は、マウスの心の中の細胞の心筋内注入を実行する方法が示されている。この方法論の証明として、我々は、HEK293細胞を使用している。これは、HEK293細胞は任意の細胞治療研究では使用しないので、この原稿の知見は治療的アプローチへの直接変換のための適切ではないことを強調することが重要である。しかしながら、HEK293細胞は収縮性細胞ではなく、他の細胞型に分化転換しないという事実は、例えば、送達される細胞の性質および送達経路のような技術的側面に着目した。

これは、冠動脈内経路は、損傷部位でのより均一な分布を提供することができ、一方、心筋内経路は、心臓組織^24,26内に埋め込 ​​まれた細胞クラスターを引き起こす傾向があることが報告されている。心筋細胞の交換のために、理想的なドナー細胞は、電気生理学的、構造的、収縮propertiを示すべきである心筋細胞のエスとは、移植前に使用されるべき細胞分化プログラムの必要性を示唆し、宿主組織への構造的および機能的に統合することができるべきである。

次のように...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アイソ	レーターPfiシステム		見積もりが必要
加熱パッド獣	医テックソリューション	HE006	動物用
メデトミジン	国立獣医サービス		獣医の処方箋が必要です
ケタミン塩酸塩	国立獣医サービス		獣医の処方箋が必要です
アチパメゾール	国立獣医院		獣医処方が必要
脱毛クリーム	商業店
ブプレノルフィン	NVS		獣医処方が必要
ライカ MZFLIII顕微鏡	ライカ	モデル S6E	スイングアームスタンド付 TS0
浜松 ナノズーマー デジタルスライドスキャナー	浜松	RSシリーズ
走査型電子顕微鏡	Jeol	JSM-6610
鈍いハサミ	FST	14084-09
Minivent	ハーバード装置	73-0043	小型Yアダプター(73-0027)と挿管カニューレ(73-2844)を含む
鉗子	FST	11052-10
引き込みシステム	FST	18200-20	200gまでの動物用キット
30 G 12 mm; ½ インチ	BBraun	A210	ファイン イエロー
マイクロリットル シリンジ	ESSLAB	81201	また、ハミルトン リピーティング ディスペンサー PB 600-1 カタログ番号 83700
6-0 シルク縫合	Ethicon	W1614T

小糸 も含まれています