神経電位電極の体系的電気化学的および電気生理学的評価方法

サマリー

異なる電極コーティングは、電気化学的、化学的および機械的特性の変化を介して神経記録性能に影響を与える。 in vitroでの電極の比較は、しかし、生体内反応の比較は、通常、電極/神経距離と動物間の変動によって複雑に、比較的簡単です。この記事では、神経記録電極を比較する堅牢な方法を提供する。

要約

神経インプラントのための新素材とデザインは、一般的にパフォーマンスのデモではなく、他のインプラントの特性を参照することなく、別々に試験されています。これは、最も重要な性能パラメータに基づいて、特定のアプリケーション及び新材料の開発のための最適なように、特定のインプラントの合理的な選択を妨げる。この記事では、in vitroおよび神経記録電極のin vivo試験のためのプロトコルを開発しています。電気化学的および電気生理学的検査のための推奨パラメータが議論の重要なステップと潜在的な問題に文書化されています。この方法は、in vivo試験パラダイムが簡単に存在する多くの系統誤差、電極/ニューロン距離および動物モデルの間で、特に変動の影響を排除または低減します。結果は、 インビトロおよびそのようなインピーダンスおよびSiなどのインビボ応答において重要なの間には強い相関であるgnal対雑音比。このプロトコルは、簡単に他の電極材料および設計をテストするように適合させることができる。 インビトロ技術は、さらに、重要な性能指標を決定するために、任意の他の非破壊的方法に拡張することができる。聴覚路内の外科的アプローチのために使用される原理は、他​​の領域の神経または組織に改変することができる。

概要

ニューラルインプラントは、補綴ならびにパーキンソン病、てんかん、および感覚喪失^1,2障害の治療を制御する、研究のためにますます使用されている。測定および/または脳の化学的および電気的成分の両方を制御することは、すべての神経インプラントの基礎となっている。しかしながら、神経組織、副作用^を減少させるために³異常な状態にあるときにのみ治療を投与することが重要である。例えば、てんかんの治療のための脳深部刺激装置は、発作時の脳への電気パルスを適用する必要があります。いくつかの副作用は、ジストニア、記憶喪失、見当識障害、認知機能障害、幻覚誘発され、又はうつ病の抗うつ^3,4であってもよい。多くのデバイスでは、閉ループシステムは、電気的活動を記録し、異常状態が検出されたときに刺激を誘発することが必要である。記録電極は、プロ制御するために使用されstheticデバイス。これは、最も正確なトリガデバイス制御を達成するために、可能な限り高い信号対雑音比で標的神経活動を記録することが重要である。より信頼性の高いデータがより少ない必要な試験被験者において得られた、得ることができるように、大きな信号対雑音比は、また、研究用途のために非常に望ましい。これはまた、神経刺激と記録に関与する機構および経路をより深く理解できるようになります。

神経移植片は脳内に配置された後、免疫応答は^、5,6トリガされる。応答の時間経過は、一般に、各々が異なる生物学的プロセス⁷からなる、急性および慢性のフェーズに分割される。免疫応答は、そのようなインプラント材料⁸のグリア性瘢痕または化学的分解のカプセル化による標的ニューロンからの電極の単離などのインプラントの性能に劇的な影響を有することができる。これは、記録電極の信号対雑音比と、刺激電極の電力出力を低減し、故障^9、電極につながることができる。インプラントの設計および材料の注意深い選択は​​、インプラントの寿命にわたって失敗を防止する必要がある。

異なる材料およびインプラントの設計の多くは、神経記録用の信号対雑音比およびインプラントの安定性を改善するために開発されている。電極材料は、白金、イリジウム、タングステン、酸化イリジウム、酸化タンタル、グラフェン、カーボンナノチューブ、導電性ポリマードープされ、最近のヒドロゲルを含んでいた。試験された基板材料は、シリコン、酸化ケイ素、窒化ケイ素、絹、テフロン（登録商標）、ポリイミド、及びシリコーンを含む。様々な電極の修飾はまた、ラミニン、ニューロトロフィン、または電気化学的、プラズマと光学技術を用いた自己組織化単分子膜や治療などのコーティングを使用して、研究されてきた。インプラントデザイン一般に、絶縁プローブの先端または電極を貫通するか、皮質表面インプラントのための2次元配列のためのシャンクの端部に沿って又は電極を備えた3次元 - 、2 - sは1であってもよい。関係なく、電極設計や材料の、以前の文献は通常、他のインプラントの構造を参照することなく、新たなインプラントの性能を実証しています。これは彼らの特性の体系的な評価を防ぐことができます。

このプロトコルは、分析的および電気生理学的手法の範囲を介して、異なる電極材料を比較するための方法を提供する。これは、最近発表された（硫酸塩（SO _4）またはパラ -トルエンスルホン酸（PTS）がドープされたポリピロール（のPpy）とポリ-3,4 -エチレンジオキシチオフェン（PEDOT））ポリマーコーティングを4つの異なる導電性のドープされた比較物品と4に基づいている異なるコーティングは^、10を厚さ。この記事では、45秒の堆積時間で1材料、PEDOT-PTSを見つけました最小のバックグラウンドノイズと最も高い信号対雑音比とスパイクカウントを有し、これらのパラメータは、電極のインピーダンスに依存していたこと。 PEDOT-PTSは、他のドープ導電性ポリマーと裸イリジウム電極と比較して、優れた急性生体安定性を示した。プロトコルは、信号対雑音比および安定性を制御する重要なパラメータを決定し、さらに、神経記録電極の性能を改善するために使用されることを可能にする。

プロトコル

プロトコルは、ラ·トローブ大学（09-28P）、RMIT大学動物倫理委員会（1315年）によって承認されている。

1。電極の調製と予備的in vitro試験

1. 電極コーティング堆積溶液を調製し、例えば10 mMのは、3,4 -エチレンジオキシチオフェン（EDOT）および0.1 Mナトリウム、パラ -トルエンスルホン酸（ナトリウム₂点）は、ポリ-3 -3,4 -エチレンジ-PTS（PEDOT-PTS）を形成する。
2. ポテンショスタットに電極アレイを接続します。
3. 慎重に堆積溶液に電極アレイを配置し、所定の位置に固定します。
4. 堆積溶液中に白金メッシュ対向電極およびAg / AgCl参照電極を配置し、ポテンシオスタットに接続している。
5. 希望の電極上にポテンショスタット、預金コーティングを使用。堆積条件（電位、電流及び時間）は、所望のコーティングに依存して変化する。 PEDOT-PTSコーティングのため、適用されるポテ15、30、45、または60秒間のV 1 ntialが使用されている。アレイ上の4つの電極が互い違い（ 図1）でコーティングで被覆されるべきである。
6. 析出溶液から電極アレイを削除して、静かに、脱イオン水ですすいでください。
7. 必要に応じて他の材料とコーティング手順を繰り返します。
8. インビトロ試験溶液（脱イオン水中0.3 M二リン酸ナトリウムせ（Na ₂ HPO _4））を調製する。
9. ポテンショスタットに電極アレイを接続します。
10. 慎重にテスト溶液中に電極アレイを配置し、所定の位置に固定します。
11. 試験溶液に白金メッシュ対向電極およびAg / AgCl参照電極を配置し、ポテンシオスタットに接続している。
12. ポテンシオスタットを用いて、逐次電気化学的インピーダンス分光法（EIS）を行い、サイクリックボルタンメトリー（1サイクルは、電位範囲0（電位がV 0、振幅が10mV、周波数範囲10〜100,000 Hzのオフセット）0.8-0.8Vに、スキャン速度は100mV /全ての電極にSEC）。テストされていない電極は、開回路電位に保持され、1秒の静止時間を、各試験の間に使用される。すべての32の電極は、1時間の全試験セッションのための溶液と接触している。
13. テスト溶液から電極アレイを削除して、静かに、脱イオン水ですすいでください。
14. このような光学顕微鏡のような他の任意の所望の分析を行う。
15. 電極表面の損傷や劣化を防止するための乾燥防止の容器に保管してプローブ。

2。電極注入

1. ラットを秤量する。
2. nonrecovery麻酔用ウレタン（20％W / V蒸留水に、1.3グラム/ kgのIP）を注入する。
3. つま先のピンチ引っ込め反射のためにテストすることによって麻酔発症を確認してください。麻酔が十分でない場合、ウレタンの補助的な用量は、（は0.3g /腹腔内）投与すべきである。
4. 目の潤滑剤を塗布した後、ANの頭を剃る位側。
5. 恒温プレート上腹臥位で動物を置き、直腸プローブ（37.5°C）を挿入します。
6. 定位フレーム内で約予想される最終位置に1耳のバーを配置してから、外耳道にある耳のバーを配置するために動物を調整します。
7. 対側外耳内に第2の耳バーを合わせます。歯ホルダーと整合するように、耳バーで動物をシフト。
8. ラット歯鉗子を使用して、動物の顎を開き、歯ホルダーの上に上顎をフックし、所定の位置に鼻をクランプします。
9. 正中線の右側に10ミリ吻側からラムダの10ミリメートルの尾側へ約1ミリメートル、頭部の皮膚の切開部を作成します。
10. 20％過酸化水素溶液及びガーゼパッドを使用し、壁間の頭頂骨を露出させる切開部から横方向に皮膚および筋肉を引っ込め、露出した骨の表面をスクラブ。
11. 約穴を開ける3ミリメートルできるだけラムダや正中線に近い壁間の骨に²と骨プラグを取り外します。滅菌生理食塩水を使用して、電極に損傷を与える可能性のある骨のほこりや断片を除去するための穴をフラッシュします。
12. ブラント鈍いはさみを使用して、首筋の下に解剖し、空洞を作成します。 、脱脂綿で銀/塩化銀ワイヤーをラップ生理食塩水で、それを飽和させた後、空洞の中に参照電極を挿入します。
13. 針の先端を使って矢状面上の硬膜の切開を行います。
14. 電極マニピュレータに電極アレイを取り付け、19℃の吻側 - 尾角の開口部にその位置を調整します。手動下丘に向かって脳に電極を約2ミリメートルを挿入します。
15. 左耳中空バーにスピーカーを取り付けます。
16. アンプがオンになっていることを確認してください。その後、記録チャンバーを密閉する前に、動物の麻酔を確認します。

3。in vivo試験

1. ホワイトノイズバースト、（ガウス分布雑音、1から44 kHzの、10ミリ秒立ち上がり立下り時間）を実現し、各電極でのアクティビティを監視します。バーストが配信されるべき最大レートは1バースト毎に200ミリ秒である。
2. 電動マイクロドライブを使用して、音響的に駆動する活動は、各シャンクに3最先端の電極上に記録されるまで、徐々に（活動の記録電極の数と位置は電極配置や電極設計と異なる場合があります）電極アレイを挿入します。
3. 50ミリ秒ホワイトノイズバースト（ガウス分布雑音、1〜44 kHzの、10ミリ秒の立上り立下り時間）の300回繰り返し用いた音響刺激プロトコルを実行する70デシベルで1秒の繰り返し率を有する、および（各電極でのマルチユニット活動を記録する24.4 kHzのサンプリングレート）。
4. ゆっくりと目からより遠位の電極とほぼ同じ位置に各電極を配置するためにICに電極アレイを別の200μmを挿入するE初期記録位置。
5. 音響刺激と神経記録プロトコルを繰り返します。
6. 200μMステップで電極アレイを挿入し、すべての電極は、少なくとも3つの位置（全体的な一般的に8月12日の電極位置）から音響的に駆動アクティビティを記録したまでは音響刺激と神経記録プロトコルを実行し続ける。
7. 200μmを段階的に電極アレイを後退させると、初期電極アレイ位置が達成されるまで、音響刺激および神経記録プロトコルの実行を継続。
8. 丁寧に手作業で電極アレイを撤回。
9. 動物を安楽死させるために、ペントバルビタールナトリウム（200 mg / kgのIP Lethobarb）の過剰摂取を注入する。
10. 優しく蒸留水で電極アレイをすすぐ。そして、電極表面の損傷や劣化を防止するために、乾燥保護容器内にプローブを保管してください。

4。 VITにおける移植後ROのテスト

1. 穏やかに汚染を除去するために蒸留水で電極アレイをすすぐ。
2. ポテンショスタットに電極アレイを接続します。
3. 慎重にテスト溶液中に電極アレイを配置し、所定の位置に固定します。
4. 試験溶液に白金メッシュ対向電極およびAg / AgCl参照電極を配置し、ポテンシオスタットに接続している。
5. ポテンショスタットを使用して、連続的な電気化学インピーダンス分光法（EIS）を行う（可能性は振幅、0 Vオフセットは10mV、周波数範囲10〜100,000 Hz）とし、サイクリックボルタンメトリー（1サイクル、電位範囲0.8-0.8Vに、スキャン速度は100mV /秒）は、すべての電極上。テストされていない電極は、開回路電位に保持され、1秒の静止時間を、各試験の間に使用される。すべての32の電極は、1時間の全試験セッションのための溶液と接触している。
6. テスト溶液から電極アレイを削除して、静かに、脱イオン水ですすいでください。
7. P24時間酵素洗浄液に電極アレイレース。
8. 溶液から電極アレイを削除し、蒸留水ですすいでください。
9. ポテンショスタットに電極アレイを接続します。
10. 慎重にテスト溶液中に電極アレイを配置し、所定の位置に固定します。
11. 試験溶液に白金メッシュ対向電極およびAg / AgCl参照電極を配置し、ポテンシオスタットに接続している。
12. ポテンショスタットを使用して、連続的な電気化学インピーダンス分光法（EIS）を行う（可能性は振幅、0 Vオフセットは10mV、周波数範囲10〜100,000 Hz）とし、サイクリックボルタンメトリー（1サイクル、電位範囲0.8-0.8Vに、スキャン速度は100mV /秒）は、すべての電極上。テストされていない電極は、開回路電位に保持され、1秒の静止時間を、各試験の間に使用される。すべての32の電極は、1時間の全試験セッションのための溶液と接触している。
13. テスト溶液から電極アレイを削除し、優しく脱イオン水ですすいでください。
14. 電極表面の損傷や劣化を防止するための乾燥防止の容器に保管してプローブ。

結果

この実験プロトコルのために使用される典型的な電極アレイは、 図1に示されている。 413μm ^2に 、名目幾何学的面積および200μMピッチで4シャンク32イリジウム電極があります。アレイ上の各第2の電極は、標識された1〜4つの異なる電極被膜、のいずれかで被覆されている。コー​​ティング材料は、慎重にそれらの化学的、機械的および電気化学的特性のために選択されている。 ¹⁰先に述べたように、より大きな電流または電位を印加しながら、増加した堆積時間は、電極面積及び被覆の厚さが増加する、また反応はそれが堆積プロセスに影響を生じ得る競合する、堆積速度を増加させることができる。堆積プロトコルは再現可能なコーティングが達成されていることを確認するために、この特定の導電性高分子のために、以前に最適化されているので、それを電極に限定されている（ すなわち adjaceに広がらないNT電極^）10。

電極アレイは、変更された後、光学および電気化学的分...

ディスカッション

このプロトコルは、1動物内の神経記録電極コーティングを比較するための方法を提供する。使用される電極の設計は、同様の規模の大きさで、ラット下丘（IC）への移植に最適です。長いシャンクと電極との間のより大きなピッチがシャンクのヒントは頭蓋底に接触するリスクを増加させながら、このようなシャンクの間に多くのスペースとしてこの電極の変形は、同時にラットのICにいるすべてのシャンクを妨げる挿入中。小さい方の電極ピッチは隣接する電極に接触する一方の電極からのコーティングのリスクを増大させる。電極面積は、神経記録レスポンスに影響するため、実験間で一貫している必要があります。選択されたエリアは、可変電極 - ニューロン距離がより一貫性のあるデータで、その結果、マルチユニット活性を測定するのに最適です。同じコーティングで4電極を使用すると、統計分析fを可能にする一匹十分なデータ内のROMは2つの異なる電極アレイ（各品目のサンプルサイズ8）で2匹の動物から得ることができる。電極コーティングは、基部の先端からシャンク幅の変化から実験や電界効果かけて電極アレイを挿入しながら、このような神経細胞死などのエラーを最小限にするために、各シャンクにずらされている。これら...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プログラマブルアッテネーター	TDT	PA5	周波数にわたる音響信号の振幅を制御
静電スピーカードライバー	TDT	ED1	静電スピーカー (EC1) を駆動
結合型静電スピーカー	TDT	EC1	動物に音を届ける
プロセッシング基地局	TDT	RZ2	電極アレイからの神経活動の記録(PZ2プリアンプを使用)
プリアンプ	TDT	PZ2-256	256チャンネル高インピーダンスプリアンプ
プロセッサ	TDT	RX6	刺激を生成するために使用されますマルチ
チャネル電極	NeuroNexus Technologies	A4 × 8–5mm-200-200-413	4シャンク32チャンネル電極アレイ
ポテンショスタット	CH機器	CHI660B	堆積電極コーティングを行い、サイクリックボルタンメトリーとEIS(CHI684で使用)
マルチプレクサ	CH機器	CHI684	テンショスタット上の電極間でスイッチ
二ナトリウム	Fluka	71644
3,4-で使用エチレンジオキシチオフェン(EDOT)	シグマアルドリッチ	483028	電極コーティング材
パラトルエンスルホン酸(Na2pTS)	シグマアルドリッチ	152536	電極コーティング材
ウレタン	シグマアルドリッチ	U2500	麻酔に使用
銀/塩化銀電極	CHインスツル	CH111	電極in vitroplatinum電極の試験に使用
	CHインスツルメンツ	MW4130	電極in vitro電動マイクロドライブの試験に使用
	サッターインスツルメンツ	DR1000	手術中の電極アレイ位置の制御に
酵素クリーナー	アドバンスドメディカルオプティクス	ウルトラザイム	移植後に電極アレイからタンパク質を洗浄します
音響エンクロージャ	TMC Ametek	83-501	動物を音響および電気ノイズから隔離します
固定装置フレーム	David Kopf Instruments	1430	動物を固定して配置
温度コントローラー	ワールド精密機器	ATC1000	動物の温度を制御します
骨ドリル	KaVo Dental	K5Plus	頭蓋切除術を行うために使用されます
アスピレーター	Flaem	Suction pro	頭蓋切除術を行うために使用されます