方法論記事

細胞毒性活性を測定するための細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ

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DOI：

10.3791/51105

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2013年12月17日

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1Vaccine and Gene Therapy Institute of Florida

この記事について

サマリー

このプロトコルは、高感度の細胞ベースの細胞毒性アッセイについて説明しています。このアッセイは、エフェクターCD8+ T細胞の数が増加している場合の生標的CD4+ T細胞の頻度の減少を列挙することにより、抗原特異的CD8+ T細胞の細胞溶解活性の直接的な評価を可能にします。

要約

CD8+ T細胞の細胞溶解活性はめったに評価されません。ここでは、抗原特異的なCD8+ T細胞が同族ペプチドをロードしたCD4+ T細胞を殺す能力を測定するための新しい細胞ベースのアッセイについて説明します。標的CD4+ T細胞は2つの集団に分割され、2つの異なる濃度のCFSEで標識されます。一方の集団には目的のペプチドがパルス化され(CFSE-low)、もう一方の集団はパルス化されない(CFSE-high)こと。パルスCD4+ T細胞と非パルスCD4+ T細胞を同じ比率で混合し、精製したCD8+ T細胞の数を増やしてインキュベートします。ペプチド/MHCIテトラマー染色によって検出された抗原特異的エフェクターCD8+ T細胞を含むCD8+ T細胞との共培養後、自己標的CD4+ T細胞の特異的死滅をフローサイトメトリーで解析します。異なるエフェクター対ターゲット比で測定されたターゲットCD4+ T細胞の特異的溶解により、溶解単位であるLU30/106細胞の計算が可能になります。このシンプルでわかりやすいアッセイにより、CD8+ T細胞が標的CD4+ T細胞を殺傷する固有の能力を正確に測定できます。

概要

細胞溶解活性はCD8+ T細胞の主要な機能ですが、この目的で使用されるアッセイは煩雑で標準化が困難であるため、まだほとんど測定されていません。この機能の正確な測定は、CD8+ T細胞のエフェクター機能を特徴付ける際に最も重要であり、有効な細胞媒介性細胞毒性の信頼できる予測因子はまだ記載されていません1,2。ここでは、抗原特異的CD8+ T細胞の標的CD4+ T細胞上の細胞傷害活性を測定するための新しい機能アッセイを提案します。ゴールドスタンダードであるクロム放出アッセイの代替手段を提供するために、いくつかのアプローチが開発されています。ここでは、生きた標的細胞の死を測定する際の殺傷の全過程を明らかにする細胞ベースのアッセイを紹介します。この方法は、マウス4,5およびヒト6のin vitroでのフローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイのプロトコルから導き出されました。このプロトコルでは、全CD8+ T細胞集団に含まれる抗原特異的CD8+ T細胞をエフェクター細胞として使用し、自家CD4+ T細胞を標的細胞として使用します。目的のエフェクターCD8+ T細胞をMHCI/ペプチド四量体7を用いて列挙する。標的細胞の死は、ペプチドをロード/ノンロードしたCD4+ T細胞の比率によって計算されます。我々は以前に、この方法が再現性があり、感度が高く、特異的であり、全CD8+ T細胞集団内のエフェクター細胞の数に依存しないことを示しました8。共培養アッセイにおけるエフェクター細胞と標的細胞の両方の数を列挙することにより、標的細胞を殺傷するCD8+ T細胞の内在的能力を計算し、溶解単位9で発現することができる。

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プロトコル

1. エフェクターCD8+ T細胞の調製

  1. 凍結凍結保存された自家PBMC(50 x 106細胞の2-3バイアル)を、液体窒素から37°Cの水浴に移すことにより解凍します。
  2. チューブを完全RPMI(4 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリンおよびストレプトマイシン、10% FBSを添加)で50 mLに充填して細胞を洗浄します。PBMCをカウントし、完全RPMIで細胞を5 x 106/mlの濃度で再懸濁します。
  3. 特異的ペプチド(5 μg/ml)およびIL-2(10 ng/ml)をPBMCに添加します。
  4. 96ディープウェルプレートで培養をセットし、各ウェルに1 mLの細胞懸濁液を播種します。
  5. 3日間の培養後、細胞培養培地の半分を新鮮で完全なRPMIと交換します。
  6. 6日間の培養後、マルチチャンネルピペットですべてのPBMCを回収し、無菌リザーバーに細胞を移します。
  7. PBMCを5 x 107/mlで14 mL丸底チューブの推奨分離バッファーでカウント、洗浄、再懸濁します。ヒトCD8+ T細胞濃縮カクテルを50 μl/ml細胞で添加します。混合し、室温で10分間インキュベートします。磁性粒子を150 μl/mLで添加し、5分間インキュベートします。
  8. 分離バッファーを添加して、細胞懸濁液を最大7 mLにします。チューブを磁石に入れることにより、手つかずのCD8+ T細胞の免疫磁気分離に進みます。5分後、チューブを磁石に入れたまま、目的の細胞を新しい15 mLの円錐形チューブに注ぎます。少量のアリコートを取り、CD3およびCD8に対する抗体で細胞を1X PBS-2% FBSで4°Cで30分間染色します。その後、CD8+ T細胞の純度は、フローサイトメトリーを介して95%以上の期待純度で測定できます。
  9. CD8+ T細胞を450 μlに再懸濁し、完全RPMIで再懸濁します。
  10. 225 μlの完全RPMIを5本のスクリューキャップチューブに加えます。
  11. 225 μlのCD8+を次のチューブに移して、段階希釈液(1:2から1:32)を調製します(図1上部パネルを参照)。

2. 標的CD4+ T細胞の調製

  1. クライオバイアルを液体窒素から37°Cのウォーターバスに移すことにより、自家凍結保存されたPBMC(50 x 106細胞の1バイアル)を解凍します。
  2. 細胞懸濁液を、10 mLのRPMIを含む50 mLの円錐形チューブに移します。
  3. 細胞を洗浄し、PBMCを5 x 107 / mlで再懸濁し、分離バッファーを14 mLの丸底チューブに入れます。ヒトCD4+ T細胞濃縮カクテルを50 μl/ml細胞で添加します。混合し、室温で10分間インキュベートします。磁性粒子を100 μl/mlで添加し、室温で5分間インキュベー
    4. トします。
  4. 分離バッファーを添加して、細胞懸濁液を最大7 mLにします。チューブを磁石に入れて、CD4+ T細胞の単離に進みます。5分後、チューブを磁石内に残したまま、目的の細胞を新しい15mlの円錐形チューブに注ぎます。少量のアリコートを取り、CD3およびCD4に対する抗体で細胞を1x PBS-2% FBSで4°Cで30分間染色します。その後、CD4+ T細胞の純度は、フローサイトメトリーを介して95%以上の期待純度で測定できます。
  5. CD4+ T細胞をカウントし、それらを2本の15 mLコニカルチューブに分割し、温かい1x PBSで洗浄します。
  6. 温かいPBS中に0.4 μM CFSE高の作業溶液を調製します。
  7. 10x CFSE高作業溶液の一部を温かいPBSで希釈することにより、0.04 μM CFSE低作業溶液を調製します。
  8. 細胞を 20 x 106/mL の PBS で再懸濁し(CD4+ T 細胞の数が 10 x 106/ml 未満の場合は、0.5 mL の PBS に細胞を再懸濁します)、0.4 μM CFSE 高ワーキング溶液 (最終濃度 0.2 μM) を等量 1 個加えて CD4+ T 細胞の半分を染色します。例えば、1 mLの細胞に対して、1 mLのCFSEワーキング溶液を添加します。CD4+の残りの半分を、等量の0.04 μM CFSE低作動溶液(最終濃度0.02 μM)を1つ加えて染色します。細胞を37°C、5%CO2雰囲気中で15分間染色します。
  9. インキュベーション後、細胞を1,500 rpmで5分間ペレット化し、1 mLの温かい完全RPMIに再懸濁して標識反応をクエンチします。
  10. 目的のペプチドを最終濃度5 μg/mlで完全RPMIに添加してCFSE低CD4+ T細胞をパルスし、5% CO2雰囲気、37°Cで45分間インキュベートします。
  11. CFSE高およびCFSE低CD4+ T細胞を完全RPMIで洗浄します。合計2回の洗浄を繰り返します。完全RPMI中に2×105細胞/mLの濃度で再懸濁します。
  12. 2つのターゲット集団を1:1の比率(CFSE-High:CFSE-Low)で混合します(図1下のパネルを参照)。

3. コカルチャー

  1. CD8+ T細胞を希釈するごとに、100 μlを二重に播種し、丸底の96ウェルプレートに播種します。
  2. 混合ターゲットCD4+ T細胞(100 μl)をエフェクター細胞の各希釈液に加え、最終容量を200 μlにします。
  3. 基礎アポトーシスを測定するには、標的細胞のみで3つのウェルを播種します。
  4. 共培養を5%CO2雰囲気中、37°Cで6時間インキュベートします。

4. フローサイトメトリーの染色と取得

  1. 細胞をV底96ウェルプレートに移し、PE標識pMHC四量体で37°Cの5%CO2雰囲気中で15分間染色します。
  2. 1x PBS-2% FBSで洗浄し、Far Red LIVE/DEAD固定死細胞、αCD3-Alexa700、αCD8-Percp、αCD4-Brilliant Violet 650で細胞を4°Cで30分間染色し、光から保護します。
  3. 細胞を1x PBS-2% FBSで一度洗浄し、1x PBSに2%ホルムアルデヒドを入れた100 μlに再懸濁します。
  4. フローサイトメーターで細胞を採取します。

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結果

図1の概略図に本アッセイのまとめを示します。精製したCD8+ T細胞（エフェクター細胞）を450 µlの完全RPMIで再懸濁し、225 µlのCD8+ T細胞を225 µlの培地を含む次のチューブに加えることで段階希釈を行いました（上段）。精製したCD4+ T細胞（標的細胞）をカウントして2本のチューブに分け、プロトコルに従って2つの異なる濃度のCFSE（高濃度および低濃度）で染色しました。CFSE-low CD4+ T細胞には目的のペプチドをパルスし、CFSE-high CD4+ T細胞はコントロールとして未負荷のままにしました。CFSE-highおよびCFSE-low CD4+ T細胞を2 x 105/mlで再懸濁し、1:1の比率で混合しました（下段）。混合したCD4+ T細胞を各ウェルに100 µlずつ播種しました。混合CD4+ T細胞を含む3つのウェルを、CD4+ T細胞単独のトリプリケート（赤色のウェル）として使用しました。残りの混合CD4+ T細胞を含むウェルに、各濃度のCD8+ T細胞希釈液100 µlをデュプリケートで添加しました（緑色のウェル）。6時間の共培養後、...

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ディスカッション

ここで説明するアッセイにより、CD8+ T細胞の主要な機能である細胞溶解活性の定量化が可能になります。以前の研究では、この機能と抗原特異的CD8 + T細胞のサイトカイン分泌との間の不一致が報告されているため、CD8 + T細胞のエフェクター機能を特徴付ける際には、この機能の正確な測定が最も重要です10,11。共培養インキュベーション時間が短く(6時間)、自家標的細胞を使用しているため、標的細胞の非特異的死滅率が低い。したがって、このアッセイは非常に特異的で信頼性があります。このアッセイは、さまざまな細胞サブセットを分析するために簡単に変更することもできます。エフェクターCD8+ T細胞は、 in vivo キリングアッセイ12で最近記載されたCD4+ T細胞などの他の細胞型に置き換えることができる。標的CD4+ T細胞は、標的細胞として自己B細胞を使用することについて以前に説明したように、他の細胞型に置き換えることもできます8。このシステムでは、抗原の起源も置き換えることができます。たとえば、標的細胞はペプチドでパルス化する代わりにウイルスに感染する可...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業は、フロリダ州観光貿易経済開発局の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
EasySep ヒト CD4+ T 細胞濃縮キット幹細胞19052
EasySep ヒト CD8+ T 細胞濃縮キット幹細胞19053
CellTrace CFSE 細胞増殖キット - フローサイトメトリー用InvitrogenC34554
遠赤色 LIVE/DEAD 固定可能な死細胞InvitrogenL10120
Alexa Fluor 700 マウス 抗ヒト CD3BD
ブリリアント バイオレット 650 抗ヒト CD4 抗体バイオレジェン317435
PerCP 抗ヒト CD8 抗体バイオレジェン344707
RPMI 1640 ミディアム 1xVWR10-040-CV
ペニシリン - ストレプトマイシン 100x 溶液Invitrogen15070063
ウシ胎児血清 - 金、熱不活性化PAAA15-252
96ウェルプレート;扱わ;Uボトム;蓋付きBD Falcon353077
25 ml 滅菌ポリスチレン、個別包装リザーバーUSA Scientific2321-2230
96 ウェル U 底、滅菌 2 ml ディープウェルプレートThermo Scientific275743
Human IL-2 (v126)、研究グレードMiltenyi Biotec130-093-096
RoboSep バッファー、分離バッファー幹細胞20104
15 ml ポリプロピレン コニカル チューブBD ファルコン352097
14 ml 丸底チューブ、ポリプロピレンBD ファルコン352059
ビッグ イージー イージーセップ マグネット幹細胞18001
PBS 1xVWR21-040-CV
96-well;蓋付きV底プレートFisher12-565-481
ホルムアルデヒド溶液、ACS 試薬、37 wt % in H2OSigma-Aldrich252549-500ML
1.5 ml スクリューキャップ マイクロチューブ、円錐形Sarstedt72.692.005
557943ド ド

参考文献

  1. Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).
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