マウス心筋細胞の単離と生理解析

サマリー

野生型および突然変異マウスの個々の心筋細胞を心臓から分離し、その収縮性とカルシウム過渡性を研究することができます。これにより、細胞機能障害が何らかの原因から心臓機能障害に寄与していることを特徴付けることができます。

要約

心臓の主力細胞である心筋細胞は、血液を送り出すために使用される収縮力を生成する、精巧に組織化された細胞骨格および収縮要素を含んでいます。個々の心筋細胞は、心筋の生理機能と構造をよりよく研究するために、40年以上前に最初に分離されました。技術は急速に進歩し、冠動脈灌流による酵素消化を含むようになりました。最近では、単離された筋細胞の収縮性とカルシウムフラックスの分析が、心不全の細胞および細胞内分析において重要なツールを提供しています。心エコー検査と心電図は、臓器レベルでのみ心臓に関する情報を提供します。心筋細胞の培養系は存在しますが、細胞には、心臓内での筋細胞機能に必要な組織化されたサルコメアやt尿細管などの生理学的に不可欠な構造が欠けています。ここで紹介するプロトコルでは、心筋細胞はランゲンドルフ灌流によって単離されます。心臓をマウスから取り出し、大動脈を介してカニューレにマウントし、消化酵素で灌流し、細胞にカルシウム濃度の増加を導入します。エッジおよびサルコメア検出ソフトウェアを使用して収縮性を分析し、カルシウム結合蛍光色素を使用して電気的にペースの速い心筋細胞のカルシウム過渡現象を視覚化します。細胞の変化が心機能障害に果たす役割についての理解が深まっています。従来、心筋細胞に対する薬物効果の試験に使用されてきましたが、このシステムを使用して、WTマウスと拡張型心筋症を引き起こす突然変異を持つマウスの筋細胞を比較しています。このプロトコールは、既知の心臓機能と既知の遺伝学を持つマウスの生細胞の比較においてユニークです。遺伝子操作や環境操作、感染、薬物治療など、多くの実験条件が確実に比較されます。生理学的データだけでなく、単離された心筋細胞は、細胞骨格要素を簡単に固定し、染色することができます。灌流による心筋細胞の単離は、非常に汎用性の高い方法であり、さまざまな実験条件で心不全に伴う、または心不全につながる細胞の変化を研究するのに役立ちます。

概要

心筋細胞は心臓に収縮力を提供します。各筋細胞には、収縮に不可欠な組織化された細胞骨格要素と収縮要素が含まれています。心臓には心筋細胞だけでなく、線維芽細胞、結合組織、プルキンエ線維などの改変筋細胞も含まれています。これらの細胞タイプのいずれかまたはすべての変化は、心不全で見られるため、心機能障害の最終的な原因を特定することは困難です。機能不全の心臓の心室収縮性の低下は、さまざまな程度の線維性組織の蓄積と心筋細胞の肥大および機能不全によって先行します¹。不整脈は、伝導細胞^{の機能不全2}、心伝導を中断する線維症³、または心筋細胞のイオンチャネルの発現の変化によって引き起こされる可能性があります^1,4。実際、これらの問題はしばしば複雑に共存しています。

心筋細胞を分離し、研究することで、個々の筋細胞の収縮性および電気的機能障害を全体的な心機能の文脈で調べることができます。個々の心筋細胞を単離する技術は、この心臓の「働き者」細胞の生理機能をよりよく研究するために、40年以上前に開発されました。単離技術は、1970年に初めて行われた大動脈のカニューレ挿入による冠状動脈灌流の重要な開発により、細胞の収量と品質を向上させるために改善され^{てきました5。}この記事では、心筋細胞の単離と、レシオメトリック蛍光および細胞寸法データ収集ソフトウェアを使用した収縮性とカルシウム過渡現象の測定について説明します。心臓病の遺伝的モデルと環境モデルの両方で、このプロトコルを利用すると、細胞収縮性、肉腫収縮性とリラクゼーション、カルシウム過渡性、および細胞骨格破壊に関する重要な情報が得られます。このシステムは、単離された心筋細胞に対する薬物の影響をテストするためによく使用されます^6,7。このシステムを使用して、野生型マウスと拡張型心筋症につながる突然変異を持つマウスとの間で、心筋細胞の収縮性とカルシウム過渡性を比較します。

個々の心筋細胞を研究することは、心臓の解剖学や生理学を研究するために一般的に使用される他の方法に比べて多くの利点があります。心エコー検査と心電図検査は、心臓全体の収縮機能と電気伝導に関する情報を提供します。これらの方法のいずれも、臓器全体のレベルより下の機能障害の原因や性質を説明するものではありません。エッジ検出アルゴリズムとサルコメア長アルゴリズムを使用して個々の心筋細胞の収縮性を測定することで、心臓の収縮細胞内の変化が全体的な心機能障害内に存在することを実証できます。カルシウム過渡現象を測定すると、細胞レベルでのイオンフラックスの変化が収縮性機能障害や不整脈に及ぼす影響が明らかになりました。

このプロトコルは、全臓器の研究を補完するだけでなく、細胞内成分について容易に染色できる細胞を提供します。心臓全体の組織切片を染色することにより、細胞骨格の変化を見ることができます。ただし、セルの断面を視覚化することしかできません。心筋細胞全体は一般的な組織切片よりも厚く、心筋細胞の配置と長さを考えると、1つの切片で全細胞を見ることは困難です。単離された心筋細胞は、すぐに固定し、さまざまな細胞骨格要素やイオンチャネルを染色することができます。共焦点画像は、細胞の全厚zスタックにまとめることができます。さらに、単離された心筋細胞を染色することで、t尿細管として知られる膜陥入など、切片では可視化できない成分の染色が可能になります。

心筋細胞の培養細胞株は存在し、その一部は心筋細胞と同様の転写プロファイルと表現型の特徴を持っています。HL-1細胞株のように、一部の細胞は、いくらかの肉腫的な組織と初歩的な収縮能力さえ保持しています⁸。これらの特性にもかかわらず、培養細胞は心筋細胞の「ボックスカー」形状とt尿細管構造を欠いており、肉腫的な組織化が少なくなります。これらの成分は、生体内での心筋細胞の機能に必須です。また、培養細胞を用いることで遺伝子操作は可能ですが、生体内での生理学的操作はできません。単離された心筋細胞は、研究するのに十分な期間細胞組織を保持しますが、それでも容易に画像化され、形質導入さえされます⁹。

単離された心筋細胞は非常に汎用性が高く、さまざまな実験条件からの細胞を同一に分析するための基質を提供します。筋細胞の単離および生理学的分析は、薬物^6,7または低分子¹⁰、環境ストレッ^サー11、感染¹²、疾患¹³、または遺伝子変異^14,15の収縮性および/またはカルシウム過渡性に対する効果の研究、および心筋細胞^15-17内の収縮性およびカルシウム放出の調節の研究を含む、さまざまな実験のために無数の研究室によって使用されてきた.これらのストレッサーのいずれかを適用すると、心機能の変化は、心筋細胞自体の変化と、瘢痕化、伝導性の変化、細胞外マトリックスの変化などの心臓の周辺環境の変化の任意の組み合わせによるものである可能性があります。これは、あらゆる原因による心不全の状況で個々の筋細胞の構造と機能に関する研究の質問に答えるための理想的なプロトコルです。

他の技術に比べて数え切れないほどの利点を持っていますが、孤立した心筋細胞の生理学的分析は、すべての研究課題にとって理想的ではありません。単離は末期的な手順であるため、心筋細胞はマウスの生涯で一度にしか評価できません。これは、コホートを使用して個々のマウスを病気の発症過程に沿って犠牲にするか、マウスをモニタリングして分離前に臨床的に重大な心不全があるかどうかを判断することで部分的に克服できます。このプロトコルは、心筋細胞の機能障害が発生したかどうかを判断できますが、追加の実験情報がなければ、この機能障害が心不全の根本原因であるという結論を導き出すことはできません。心筋細胞の機能障害自体が、心臓の他の変化に続発している可能性があります。これらの課題にもかかわらず、心筋細胞の研究は、特に他の実験と組み合わせた場合に、心臓の機能障害の性質を決定するための貴重な情報を提供します。

次のプロトコルは、ヴァンダービルト大学のチー・リム博士によって提供されたものから採用されています。収縮性とカルシウムフラックスのデータは再現性が高く、遺伝子操作や環境操作と心臓を比較するのに有用ですが、単離自体は依然として技術に依存するプロトコルであり、最適化が必要です。マウスから心臓を摘出してから大動脈カニューレ挿入によって心臓を灌流するまでの時間を最小限に抑えることは、質の高い消化に不可欠です。さらに、消化時間と酵素濃度を最適化して、最高品質の筋細胞を作製することができます。最適化が必要な可能性が高い手順と、最適化の提案を以下に示します。

プロトコル

動物に関わるすべての手続きが適切な動物を使用することによって承認されていることを確認し、ボディケア。

1事前に証券バッファを準備します

1. 2Lの株式のCa ^{2 +}フリーのタイロード（ 表1）を準備します。 NaOHでpHを7.4に調整する。
2. 2Lの株式1.2のCa ^{2 +}タイロード（ 表2）を準備します。 NaOHでpHを7.4に調整する。

実験の日に2。、灌流、転送、および消化緩衝液を準備する

1. のCa ^{2 +}フリーのタイロード（ 表3）に150ミリリットルの灌流液を準備し、0.2μmのフィルターを通して濾過する。
2. 35ミリリットルを準備のCa ^{2 +}の無料送迎「バッファーA」「緩衝液B」（ 表5）を含む（ 表4）と25ミリリットルのCa ^{2 +。} 0.2μmのフィルターを介してそれぞれをフィルタリングします。
3. 0の溶液を調製緩衝液Aおよび表6あたりBを混合することにより0.06、0.24、0.6、および1.2のCa ^{2 +。}
4. マウスの体重（BW）に基づいて、25ミリリットルの灌流液（ 表7）に消化酵素を溶解させて25ミリリットルの消化緩衝液を調製する。使用前に0.2μmのフィルターを通してろ過する。

3実験のセットアップ

1. 市販または3ミリリットルの流量を可能にするために蠕動ポンプ、配管、熱交換器コイルを用いて、定流量ランゲンドルフ装置を組み立てる/ 37°Cに加熱した灌流液の分。簡単な概略図がベルら ¹⁸によって2011件に設けられている。
2. カニューレから流出が3ml /分の流速で37°Cになるようにランゲンドルフ装置の水浴温度（〜47℃）を循環させる設定。
3. 超高純度のI型水100ml、続いて15分間灌流システムを介して70％エタノールを実行する。本稿では、Webを介して実行灌流液5分間のm個の気泡を排除しつつ。
4. 目的のメソッドを持つすべての手術器具を滅菌する。
5. 23 Gルアースタブアダプターの先端に、PE-50チューブの短い断片（約3mm）を取り付けることにより、カニューレを作成します。チューブの熱先端が大動脈が配置され、その上リップを作成します。

4心筋細胞の単離

1. 腹腔内注射を介して、0.2ミリリットルのヘパリン溶液（千IU / ml）でマウスを注入する。
2. 5分後、イソフルランでマウスを麻酔。 （強い足のピンチに応答なし）完全に麻酔をかけたときに、70％エタノールで胸をスプレー。胸を開き、すぐに心臓を切除、大動脈、および4℃の灌流液内の場所を傷つけないように注意しながら。把握し、心の下で持ち上げるように湾曲した鉗子を使用してください。これは細かいハサミで心の後ろに添付ファイルをトリミングする領域を作成します。
3. 優しく細かい鉗子2対の大動脈の端をつかんで慎重にopeniを引っ張ることにより、心臓にカニューレを挿入カニューレのリップの上大動脈のngの。これは冠状動脈を介して心臓の灌流を阻害するように、カニューレの先端が大動脈弁を過ぎおよび心室にないことを確認してください。
4. すぐにカニューレのリップの上行大動脈の周囲に5-0絹縫合糸のループを接続することによりカニューレに大動脈を固定します。
5. 注：4.4を通じて4.2可能な限り迅速に、最高品質の消化のために完了する必要があります手順。
6. 注：心はすでに灌流液を流しながらランゲンドルフ装置に取り付けられたカニューレに直接掛けることができます。しかし、解剖顕微鏡下で灌流液の小さなシリンジに取り付けられたカニューレに心臓をぶら下げ最も成功したことが見出されている。これは、冠状動脈のクリアを監視し、心臓が確実にカニューレに取り付けられ、確実に、灌流液の少量を介してプッシュされることを可能にする。カニューレは、その後、灌流液を流水でランゲンドルフに掛けている。
7. 灌流2-3分間3ミリリットル/分の流量でのCa ^{2 +}フリーの灌流バッファーで心。
8. 消化緩衝液酵素および7-10分間灌流するスイッチ、心は色が柔らかく、軽くなります。
9. 注：消化時間は、酵素活性及び心臓の大きさに基づいて調整することができる。
10. 心臓が触知弛緩すると、緩衝液A（CA ^{2 +}の無料転送バッファ）で無菌のp60皿にカニューレと場所から心臓を取り出します。
11. 心房および大血管を削除します。必要に応じて、右心室を削除します。鉗子を使用すると、小さな断片に心室を分ける。さらに、細胞を分散させるための無菌の5mlホールピペットとピペットを数回。
12. 250μmのナイロンメッシュフィルターに通した50mlコニカルチューブに細胞懸濁液をフィルタリングする。
13. 懸濁液は約10分間ペレット化するようにします。
14. 0.06のCa ^{2 +}溶液中にペレットを転送します。細胞を10分間ペレット化するようにします。ほとんどの死細胞が浮遊しながら健康な細胞は、ペレットにします。
15. 上清を吸引し、0.24のCa ^{2 +}の溶液にペレットを移す。
16. 10分間のインキュベーションを繰り返し、吸引し、細胞を1.2 mM溶液になるまで、残りの二つのCa ^{2 +}ソリューションを通じて転送します。この時点で、細胞の大部分は、棒状筋細胞である必要があります。

5。収縮およびカルシウムトランジェントを測定する

1. 注：収縮性とカルシウムトランジェントの両方を同時に測定することができる。
2. を1μg/μlの濃度に無水DMSOに再懸濁することにより、フラ-2 AM溶液を調製する。フラ-2 AM溶液を、-20℃でデシケーター中に保存することができる。
3. 負荷1μlのフラ-2 AMで懸濁した細胞の1ミリリットル。細胞は、上清を吸引した後、暗い10分で静置する。細胞は洗浄の間に、10分間、暗所でペレット化することができ、カルシウム^{2 +}タイロード溶液で2回洗浄する。
4. 加熱されたPEを可能にする段階文書にカバーガラスを置きrfusion /吸引し、筋細胞フィールド刺激をペーシング電極。倒立顕微鏡に置き、ステージインサートは、油浸対物レンズを使用している場合、レンズへのオイルの滴を追加して、蛍光測定用に設定。
5. 1.2のCa ^{2 +}タイロード液で加熱された重力の灌流を設定し、ステージ上の溶液を37℃に達するようにします。真空吸引を取り付けます。電極を取り付けます。
6. 顕微鏡システムの電源を入れ、レシオメトリック蛍光およびセル寸法データ収集ソフトウェアを開きます。
7. 瞬間的に灌流の遮断が健康な細胞を沈降させるために、ステージインサートにフラ-2 AM負荷細胞の数滴を追加します。
8. の所望の細胞を配置する対物レンズ40倍を使用してください。健康な細胞は棒状ではなく、自発的に収縮するである必要があります。それは、目に見えて、均一に契約セルは5〜20 Vでペーシングされるべきとき
9. 注意：生理解析は、高品質の消化を必要とします。それは健康的に見えますが、PAをしない細胞を有することが可能である生理学的な解析のためにうまくCE。消化プロトコルは、高品質、健康的な筋細胞を得るために洗練が必要な場合があります。さらに、変異体​​または疾患の心は、プロトコルへの変更が必要な場合があります。
10. レンズ回転を調整し、所望のセルが画面上に水平に並んで背景が表示されていないされて開口部を変更してください。
11. 筋細胞の両端にエッジ検出棒の位置を合わせ、しきい値を調整。均一な筋節での細胞の一部に筋節検出を合わせます。もはやあなたは、このバーを作ることができ、筋節の長さのより正確な数学的モデルは、それが筋節の2集団ではないので、となります。
12. 記録前2 Hzから10〜15秒5-20 Vでペース細胞。
13. 録音のトレース。周囲の光が最高のカルシウムトランジェント記録用に最小化されるべきである。

6。分析

1. レシオメトリック蛍光および細胞寸法データ収集ソフトウェアを使用してトレースを分析します。

タイトル "> 7。さらなる研究

1. 固定および免疫染色、直接的な薬物の効果を評価する、短期文化、原子間力顕微鏡：このプロトコルは、を含む他の実験さまざまな目的で使用することができ、過剰な細胞を提供する。

結果

（ 図2）の収縮性と過渡追跡が収集されると、データは容易に適切なソフトウェアを用いて分析される。全体トレースまたはその一部（ 図3）を平均化することができる。収縮性は、さまざまな方法で分析することができる。収縮機能のために、人はショートニングピークまでの時間、および収縮速度を短縮率と収縮の大きさ、または収縮の速度を評価することができます。拡張機能は、50％の短縮及び緩和速度と時間と同様に分析することができる。カルシウム過渡応答のために、同様のデータは、ベースラインとピークのFura-2比と時間ピークまでのベースライン（ 表8）を含む、比較することができます。これらの分析は、類似の全器官の機能不全と心に変化させることができたこれらのいずれも収縮期および拡張期の細胞収縮機能上のWT及びKOの心だけでなく、カルシウム流からの比較可能なデータを提供する。さらに、同じアイソレーションからの細胞をすることができますプロトコールに記載されているように免疫組織化学的染色（ 図4）を含む、他の実験のために使用される。 ...

ディスカッション

質の高い心筋細胞の単離は、練習と最適化のいくつかのレベルが必要です。このプロトコルは、大幅に消化の結果に影響を与えることができます重要なステップが含まれています。プロトコルを実行すると、トラブルシューティングの際にこれらを慎重に検討する必要があります。カニューレ挿入および灌流に対する心臓の除去からの時間は、理想的には5分未満、最小化されるべきである。氷冷緩衝液で心臓をマウスから除去し、解剖してカニューレ挿入した後、氷冷潅流バッファにすぐに心をすすぎは、品質消化の可能性を高めるでしょう。カニュレーション自体は重要なステップです。これは冠状動脈の灌流を防ぐことができますようにカニューレの先端は、大動脈の最初の枝の下ではなく、大動脈弁を通して心室に配置する必要があります。冠灌流は品質消化に不可欠です。この研究室では、カニューレは、灌流緩衝液で充填されたシリンジに取り付けられている。ゆっくりSmalのを注入する血液の明確な冠状動脈を取り付け、見た後、灌流液lの量がカニュレーションの妥当性をテストすることができます。

このプロトコルのトラブルシューティングを慎重に、前述の重要なステップを評価...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NaCl	RPI	S23020
KCl	Σ	P-3911
MgCl2	Sigma	M-8266
HEPES	EM Science	S320
NaH2PO4	Σ	S5011
CaCl2·2H2O	フィッシャー	C79
D-(+)-グルコース		Σ G7528
2,3-ブタンジオン-モノキシム (BDM)	シグマ	B-0753
タウリン	シグマ	T-0625
ウシ血清アルブミン (BSA)	シグマ	A-7030
コラゲナーゼ B	ロシュ ダイアグノスティック	1-088-823
コラゲナーゼ D	ロシュ ダイアグノスティック	1-088-882
プロテアーゼ XIV	シグマ	P-5147
ヘパリン	APP ファーマシューティカルズ	LLC 401586D
イソフルオラン	バトラー シャイン	11695-6776-2
フラ-2 AM	テフラブ	103
DMSO – 無水シ	グマ	276855
IonOptix 細胞ペーシングおよび蛍光分析システム	IonOptix
250 μmのナイロン網	フィルターSefarアメリカ	ラボのPak 03-250/50
23 Gのルアー切株アダプター	ベクトン・ディッキンソン	1482619E
PE-50の管	ベクトン・ディッキンソン	427410

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