離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

Summary

心疾患の細胞に基づく現在の知識は、ほとんどの動物モデルの研究に依存しています。ここでは、説明し、人間の心室心筋の小さな外科的サンプルから単実行可能な心筋細胞を得るための新しい方法を検証する。ヒト心室筋細胞は、電気生理学的研究および薬物試験のために使用することができる。

Abstract

疾患のある心臓の心筋細胞は、細胞構造、励起収縮連関および膜イオン電流の変化を伴う複雑なリモデリングプロセスに供される。これらの変更は増加催不整脈リスクと心臓病患者における収縮期および拡張機能障害につながる収縮の変化の原因であると思われる。しかし、心疾患における心筋細胞機能の変化は上のほとんどの情報は、動物モデルから来ている。

ここでは、説明し、心臓手術操作を受けている患者からの心室の心筋の小さな外科的サンプルから実行可能な筋細胞を単離するためのプロトコルを検証する。プロトコルが詳細に記載されている。電気生理学的および細胞内カルシウムの測定は、この方法で得られたヒト心室心筋細胞における単一細胞の測定数の実現可能性を実証することが報告されている。

プロトコルは、彼を報告した再様々な心臓疾患の存在下で、人間の心臓の機能的変化の細胞および分子基盤の将来の調査のために役立ちます。また、この方法は、細胞レベルで新規な治療標的を同定するために、ダイレクト並進値と、ヒト心筋細胞に新規化合物の有効性を試験するために使用することができる。

Introduction

心筋の電気生理学的特性の解剖は、単一の心筋細胞を単離するための技術の開発の後に顕著に進んでいる。心臓の興奮収縮連関（ECカップリング）の理解における最近の進歩はまた、完全な組織の全ての生理学的特性を保持している実行可能な単一の心筋細胞を単離する能力によって可能になってきた。パッチクランプ法は日常的機能および心臓筋細胞膜のイオン電流の薬理学的調節を研究するために使用される。のCa ^{2 +}感受性色素と細胞内カルシウム動態の記録はまた、定期的に、ECカップリングの生理学上だけでなく、細胞内Ca ^{2 +}の病理学的変化に重要なデータを提供し、健康で病気の様々なモデルから単一の心筋細胞上で実行される機械的な障害や心疾患増加催不整脈の負担につながる恒常性。情これらの研究からのTiONは、臨床現場における薬物の電気生理学的および機械的な影響を理解するために重要です。しかし、貫通電流および心臓の活動電位と心臓力学の特定の機能を占め、ECカップリングタンパク質における種特異的な違いがあります。非ヒト哺乳動物から単離した筋細胞の研究は、生物物理学的特性および特定の膜貫通イオンチャネルおよびEC結合タンパク質の生理的役割を解明しつつ、それらは必ずしも人間の心筋細胞の関連のモデルを提供していません。人間の心筋からの実行可能な筋細胞の単離は、完全に心疾患の病態生理を理解し、新たな治療アプローチを検証することが不可欠である。

心耳は、多くの場合、外科的手技中に破....

Protocol

（; 2009年5月リニューアル2006/0024713）、ヒトの組織についての実験プロトコルがCareggi大学病院の倫理委員会によって承認された。各患者は、書面によるインフォームドコンセントを与えた。

1。ソリューションと設備の準備

溶液は、表1に記載されている。細胞単離手順の簡略化したフローチャートを図1に見出される。

ソリューション		CP	DB	KB	TB	PS	EB1	EB2
試薬（MM）	KH 2 PO 4	50
	硫酸マグネシウム	8	1.2	5		<....

Results

非障害の非肥大手術患者²¹と比較して、上述の方法は、心筋切除術の手術を受けた肥大型心筋症（HCM）を有する患者の心室中隔から単離された心筋細胞の機能異常を特徴づけるために用いた。このセクションに含まれている結果は、ワーク²¹から誘導され、この技術は、心臓の疾患状態における心筋細胞機能の変化を特徴付けるために使用することができる方法の例として示されている。

HCMを有する患者からの代表的な外科的試料は、 図2Aに示されている。外科的試料は、心内膜線維ストリークの大きさおよび厚さの点で非常に可変であった。我々はHCMサンプルから各単離操作に使用する心筋組織の量は1グラムぐらいでした。その代わりに、対照サンプルに使用組織の量は、（100〜500ミリグラム。）小さかった、ロウによるR組織の可用性。対照試料は、組織内の生存可能な心筋細胞の相対量はHCM心筋において減少し、心内膜心筋線維症が^22に増加するためか、HCMに対して処理した場合に収率が有意に高かった。これらの観​​察結果から、我々は.......

Discussion

私たちは、説明され、人間の心室の心筋の外科サンプルから実行可能な筋細胞を単離するための方法を検証しています。首尾よく心房外科試料から単離した細胞に使用されていた以前に記載されたプロトコルから始めて、病気の心室の心筋から単一の実行可能な筋細胞の分離を可能にする技術が開発され、微調整した。初期の報告では、冠灌流を介してバッファを含む酵素の配信が遅延整流を損なわなかったのに対し、心房および心室組織の塊から単一心筋細胞の単離は、選択的、生理的刺激^8,24に変更された電気生理学的特性および応答で、その結果、カリウム電流を再分極減損ことを示した分離株の細胞²⁵の電流。残念ながら、心室心筋の手術標本からのヒト心室筋細胞の単離は、冠状動脈枝の整合以来冠灌流によって実行することはできません外植心と分散で、失われます。本手法を用いて、心筋のチャンクから分離した心筋細胞は、ペーシング周波数の変化に応じて、活動電位持続時間の明確な適応を表示したり、アドレナリン刺激をβに。そのような応答が発生するためには、遅延整流カリウムチャネルの完全性は、これらのチャネルの全体的な完全性は、我々の分離法によって損なわれない示唆し

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
リン酸カリウム一塩基性(KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Mg sulfate heptahydrate（MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
アデノシン	・シグマ・アルドリッチ	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
マンニトール	シグマ-アルドリッチ	M4125
タウリン	Sigma-Aldrich	T0625
水酸化カリウム (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
塩化ナトリウム (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
塩化カリウム(KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
リン酸二塩基性ナトリウム (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
重炭酸ナトリウム (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
重炭酸カリウム (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
ビン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-ブタンジオン一基	Sigma-Aldrich	B0753
水酸化ナトリウム(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-グルタミン酸一カリウム塩一水和物	Sigma-Aldrich	49601
ピルビン酸	Sigma-Aldrich	107360
3-ヒドロキシ酪酸	Sigma-Aldrich	166898
アデノシン5′-三リン酸二カリウム塩二水和物 (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
クレアチン	Sigma-Aldrich	C0780
コハク酸	Sigma-Aldrich	S3674
エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-四酢酸(EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
ウシ血清からのアルブミン	Sigma-Aldrich	A0281
塩化マグネシウム (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
塩化カルシウム溶液, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
塩化カルシウム0.1 M溶液	Sigma-Aldrich	53704
タンスルホン酸カリウム	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte 試薬	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B 可溶化	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B パッチクランプアンプ	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	分子デバイス
消化装置	カスタム	カスタム	この装置は、プラスチックチューブ、キャストシルガード、モーターを使用して当研究室でカスタムメイドされたもので、図1C-1Dと図7に詳細に説明されています。ご要望があれば、詳細をお知らせいたします。
消化装置のブラシ用シリコーンエラストマー	ダウ・コーニング・	シルガード® 184
消化装置用可変速回転モーター	Crouzet	Crouzet 178-4765
ブラシ鋳造用モールド	N.A.	N.A.	金型は、標準的なPTFE直径2.5cmのロッドからカスタムメイドされています。