ライブ培養神経細胞の抗体供給した後細胞表面および内在化タンパク質の異なる標識化

Summary

我々は、細胞外のエピトープに特異的なポリクローナル抗体を用いてニューロンを生体の表面上のタンパク質を標識するための方法を記載している。タンパク質、細胞表面上の抗体によって結合され、その後、エンドサイトーシスを介して内在化は、上の残りのタンパク質から区別、又はインキュベーション中に表面に輸送することができる。

Abstract

培養ニューロンにおける推定膜貫通受容体の細胞表面局在化を実証するために、我々は、タンパク質の細胞外部分に対して産生された特異的な一次抗体と生ニューロンの表面上のタンパク質を標識した。細胞を固定後、透過処理された場合の受容表面との間で売買されていることを考えると、両方の細胞表面と内部のタンパク質は、同じ標識された二次抗体によって検出される。ここでは、いずれかが細胞表面上に残存し、又は、この期間中に表面に輸送された抗体インキュベーション工程およびタンパク質の間にエンドサイトーシスによって内在化された標識タンパク質を示差的にするために、タンパク質輸送（「抗体送り」）を研究するために使用される方法を適合さ。タンパク質のこれらの2プールを区別する能力は、初期incubatio後、高濃度の非標識二次抗体と一晩ブロッキングステップを組み込むことによって可能になった蛍光標識された二次抗体と非透過ニューロンのN。異なる蛍光体で標識した蛍光二次抗体を用いて内部化プールの検出を可能にしたニューロンのブロッキング工程、透過処理の後に。我々はそれがあったことを明らかにし、この推定受容体の細胞内局在についての重要な情報を得ることができたこの技術を使用して、実際に、神経細胞における細胞表面に人身売買。この技術は、細胞外エピトープに適切な抗体を提供することが可能で、細胞型および細胞表面タンパク質の範囲に広く適用可能である。

Introduction

新たに同定されたタンパク質の機能を確立する上で、問題のタンパク質の細胞内局在や人身売買の調査は蛋白質^の1,2の可能性のある役割/ Sについての重要な手がかりを提供することができます。開発新皮質³のトランスクリプトームのバイオインフォマティクス解析は、マウス脳corticogenesis中に変更発現を示す遺伝子のリストを提供してくれました。次に、これらの遺伝子のうちの1つ、sez6によってコードされるタンパク質は、ニューロンの発達に重要な役割を有することを確認するために遺伝子ノックアウトアプローチを採用した。私たちは、発作関連遺伝子6、またはSez6、タンパク質は樹状突起の開発に位置しており、また、樹状突起棘、受信して興奮シグナルを統合し、樹状突起上の特殊な構造中に存在していることを観察した。このタンパク質が不足している場合にさらに、樹状突起および興奮性シナプスが正しく^4を形成することができない。タンパク質の考えが支配的アイソフォームはtransmembranの機能を備えていますE受容体は、免疫標識タンパク質の細胞内分布はほとんど共焦点顕微鏡によって、または免疫電子顕微鏡で調べたところ、が、全てではないが、信号の原形質膜上でラベルはほとんど、あるいは全く、タンパク質と細胞体のコンパートメントに小さな小胞に関連する登場細胞表面で。

明確に予測された大きな細胞外ドメインを有するこの推定上の受容体は原....

Protocol

1。解離した海馬ニューロンの文化

1. カバースリップ（ホウケイ酸ガラス）を準備します。
   1. 100％エタノールで洗浄します。
   2. UV照射下で空気乾燥。
   3. ポリ-D-リジン（4℃で一晩、0.15Mホウ酸緩衝液中で0.5 mg / mlの、）でコーティング。
   4. 次の日（培養日）に対するラミニンでコーティング次いでPBSで3回洗浄し（2.5μgの個/ ml、天然マウスラミニン）で2時間、PBS中に希釈+ 5％（v / v）の熱不活化ウシ胎児血清（FCS） 37℃
2. 胎生18日（E18）ラット海馬を解剖し、カルシウムやマグネシウム、氷上で冷却を含むPBS中に収集します。注：動物に関連するすべての実験プロトコルは、メルボルン大学の動物倫理委員会によって承認された。
3. メーカーの指示に従ってパパイン解離キットからパパインとのDNase I溶液を調製する。
   1. 1ミリリットルパパイン溶液に50μLのDNase I溶液を追加します。
   2. 注：一度まず調製し、パパイン溶液およびDNase I溶液は別々に（それぞれ、パパインおよびDNase I 0.5 mlの25μlのアリコート）を一定分量に分注し、必要になるまで-20℃で保存してもよい。
4. 可能な限り、PBSを削除し、15〜20分間、37℃で1ミリリットルのパパイン/ DNアーゼI溶液（胚1リットルから）....

Results

ここで提示二色蛍光免疫染色技術は、（ 図1に概略的に示されている）生細胞における膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを標識するのに有用である。インキュベーション期間の間に、免疫グロブリンは、アクセス可能なエピトープに結合し、一緒に結合した抗体とタンパク質分子の集団の割合は、エンドサイトーシスされる。また、新たに合成されたタンパク質は、順方向トラフィッキングを介して細胞表面に到達してもよいし、リサイクルタンパク質分子は、形質膜¹⁰に戻されてもよい。

この方法は、研究下のタンパク質に特異的な同一の一次抗体を用いて、2つの異なるタンパク質プールの検出のために最適化された細胞表面と内在化されている。透過処理の前に固定された細胞一つの蛍光タグ付き二次抗体を適用することにより、定着時に細胞表面に局在タンパク質を検出することができる。トールの取り込み初期、二次抗体が結合したされていない残りの蛋白質の一次抗体表面複合体の任意の結合を禁止するステップをブロックウワーッインキュベーション中にエンドサイトーシスされたタンパク質 - 抗体複合体の（異なる.......

Discussion

ここに記載の技術は、（Arancibia-Càrcamo らによって検討）細胞表面ビオチン化¹²のものと相補的であり、それは内在化タンパク質の細胞内局在についての情報を保存するための選択方法であり、好適には一次抗体を設け細胞外エピトープは入手可能です。また、経時的なタンパク質輸送/内在化の定量は、タンパク質抽出物を調製する必要なく、（一次抗体と生細胞のインキュベーションを通して異なる時間にカバーガラスを固定して）行うことができる。

（たとえば、異なる条件下で測定し、比較することができる共焦点画像内の関心領域（錐体神経細胞の細胞体の例については、頂端領域または細胞体からの設定距離に近位先端樹状突起）に強度または数や涙点の大きさを染色、基礎レベルに対する刺激され^8,9）。内部化受容体SIG内部強度は、表面受容体のものに正規化することができる。代替的に、この技術は、以前に内在化、抗体結合タンパク質は、に戻ることができるように培養した細胞表面から残存する抗体を除去するストリッピング工程を含むことを通って細胞表.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS with Ca and Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	PDS
ウシ血清アルブミン	シグマアルドリッチオーストラリア	A9418
ハンク'カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを含まないバランスの取れた塩溶液	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015	分注する前に氷上で解凍
シ胎児血清 HyClone	サーモフィッシャー
フルオロデオキシウリジン	Sigma Aldrichオーストラリア	F0503
Uridine	Sigma Aldrich オーストラリア	U3003
18 mm 丸型ガラスカバースリップ	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD 水性封入剤	Vector Laboratories	H1400
ロバ 抗ウサギ Dylight 649	ジャクソン免疫研究所	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
パラホルムアルデヒド	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - ヒュームフードのハンドル
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody	Invitrogen - Molecular Probes	A21206