尿中エキソソームを単離するために、修正沈殿法

Summary

この原稿は、修正沈殿技術を使用してヒトの尿からエクソソームを分離するためのプロトコルを説明しています。

Abstract

尿や血漿中の腎臓病の早期発見を可能にするバイオマーカーの同定は、数年前から活発な関心を集めてきた分野です。サイズが40〜100 nmの尿中エキソソーム小胞は、すべてのネフロンセグメントからの細胞によって通常の条件下で尿中に放出され、それらの起源の細胞タイプを代表するタンパク質、mRNA、およびマイクロRNAを含んでいてもよい。腎機能障害や損傷の条件下では、エクソソームにはこれらの成分の割合が変化している可能性があり、これが疾患のバイオマーカーとして機能する可能性があります。現在、尿中エクソソームの単離にはいくつかの方法がありますが、これまでに、超遠心法に基づく3つの方法、ナノ膜限外ろ過濃縮器を使用する方法、市販の沈殿試薬を使用する方法、および研究室で開発したExoQuick試薬を使用した沈殿法の修正を使用する方法など、それぞれのアプローチを実験的に比較しました。その結果、改変沈法はエキソソーム粒子、miRNA、mRNAの収量が最も高くなることを発見し、このアプローチはその後のRNAプロファイリングのためのエキソソームの単離に適していることがわかりました。我々は、修正されたエキソソーム沈殿法が、尿からのエキソソームの単離のための迅速でスケーラブルかつ効果的な代替手段を提供すると結論付けています。本報告では、ヒト尿からエクソソームを単離するためのExoQuick試薬を用いた改変沈殿法について述べる。

Introduction

尿中エキソソームは、miRNAの¹のために濃縮されるように見える尿排水システムをライニング糸球体足細胞、尿細管細胞と細胞を含む尿空間での正常および病的条件下での全ての細胞型から派生多胞体（MVB）の100nmの小さな内部小胞である^-2。多くの研究者が明確な健康な個体の尿から単離されたエキソソーム中のタンパク質だけでなく、腎臓および/ ​​または体系的疾患^3-5のものを検出した。エキソソームは、超遠心^8-9、または沈殿^10-11にナノ膜フィルターを組み合わせ、スクロース^6-7の有無にかかわらずそのような二段階の差動超遠心分離などの異なる方法を用いて単離することができる。我々は最近、尿中エキソソームを分離し、miRNAおよびタンパク質バイオマーカー^11を検出するための、簡単、迅速、スケーラブルで効果的な方法を開発した。バイオマーカーは、異なる生物学的流体の様々な検出可能であるが、ウルナインは、比較的非侵襲的な方法で大量に得ることができるため、腎臓および尿路の疾患を有する患者のために最も便利な選択である。

尿中エキソソーム^6-11を単離するためのいくつかの方法があるが、最も一般的に使用される手順は、30％ショ糖クッションで差超遠心分離に依存する。この方法は効率的であり、この手順を用いて単離し、得られたエキソソームの品質が高レベルである間は、技術自体は、熟練者を必要とし、時間がかかり、いくつかの超遠心分離工程を必要である。例えば濾過、沈殿などの他の方法は、独自の沈殿試薬を使用するものを含む、エキソソームの単離のために開発されている（ すなわち 、ExoQuick-TC：システムBiosciences社;マウンテンビュー、CA）。この試薬を用いて降水量は、高速かつ比較的容易であるが、分離エキソソームの純度は超遠心メタに比べて低いOD。我々は最近、我々の研究室で開発された¹¹ ExoQuick-TCを使用して沈殿法の修正を含む尿中エキソソームの単離のための6つのメソッドを、比較した。我々は、この修正された沈殿法は、タンパク質に、miRNA、およびmRNAのより高い量を得た手順自体は速く、超遠心分離法よりも実装が簡単であることがわかった。ここでは、段階的に私たちの修正された沈殿法の実験的なプロトコルを記述し、エキソソーム単離の他の方法と比較して、この技術の利点と欠点の議論が含まれています。修正された沈殿法は、エキソソームのタンパク質と相関し、そして尿からエキソソーム収率が低下することが知られているタム - ホースフォールタンパク質を除去することによりエキソソーム粒子の初期析出を伴う。我々は、これらの修正が尿からエキソソーム調製物の収率および純度を増加させることを見出した。

Protocol

注：変更された沈殿法を用いて尿中エキソソームの単離に含まれるステップは、 図1に示されている最初のステップは、遠心分離によって大きな死細胞を除去し、細胞破片を含む。その後の各工程から回収した上清から得られた最終ペレットは、タンパク質、RNA、およびDNAのさらなる抽出の分離溶液に溶解させたエキソソームに対応する。

尿の1.コレクション

1. 尿採取の前に、製造業者の説明書に従って、プロテアーゼ阻害剤カクテルを調製し、空の無菌容器にこのカクテルの3.125ミリリットルを加える。プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むチューブは、その後、尿収集ボランティアに配布することができる。
   NOTE：プロテアーゼ阻害剤を添加する理由は、尿試料中のタンパク質分解を最小にすることである。我々は、特にからプロテアーゼ阻害剤カクテルを使用しましたがシグマ、他の市販のプロテアーゼ阻害剤を置換することができる。
2. 最初のボイド尿の約10ミリリットルを収集します。ストレージまたは冷蔵せずにすぐに収集した後に尿を処理します。修正された沈殿法を用いて、二重に尿中エキソソームを分離。他の尿エキソソーム粒子の定量化のためであるが、重複の一つは、DNA、全RNAおよびタンパク質抽出のためにある。
   注：24時間の尿サンプルを4℃で保存することによってエキソソームの単離のために収集することができる。

細胞の破片とタム·ホースフォールタンパク質（THP）の2の除去

1. 15ミリリットル遠心管に尿サンプルを転送します。遠心分離機37℃で10分間17000×gで尿10mlの細胞および細胞破片（ 図1）を除去する。
2. ピペットを使用して、さらなる処理のために上清を新しいチューブに移す。分離溶液500μlでペレットを再懸濁（250mMのスクロース、10mMの害しよ最終濃度200 mg / ml）で37℃で：DL-ジチオスレイトール（DTTと10分間インキュベートし、続いてエタノールアミン、pHは7.6）。
   NOTE：DTT歩留まりの低下につながる、エキソソームを捕捉THPを分解するために添加される。上澄みの転送中に邪魔されずにペレットを残すように注意してください、そして上清をペレットの明確であることを確認する。
3. 渦ペレットサンプル毎に2分間、ペレットが完全に溶解するまで。その後、溶解したペレットに分離溶液500μlを追加します。
4. 直ちに、ペレットに分離液を加えた後、37℃で10分間17000×gで遠心する。ピペットで上清およびそれ以前回収した上清と組み合わせること。
5. SDS-PAGE分析のために分離液50μl中にペレットを再懸濁する。
   注：PBSまたはTBS、ペレットを再懸濁し、代わり分離溶液を使用することができる。

エキソソームペレットの3.絶縁

1. 収集されたsupernの11ミリリットルにatant、ExoQuick-TC試薬の3.3ミリリットルを追加し、少なくとも12時間、4℃でインキュベートする。
   NOTE：ExoQuick-TC試薬に対する上清の体積の比は、エキソソーム収量を増加または減少させるように調整することができる。私たちは、追加された試薬の少ないボリュームがエキソソームの小さい収量を生産することを観察した。
2. インキュベーション後、25℃で30分間遠心分離を10,000×gでのサンプル/ ExoQuick-TCミックスを。
3. SDS-PAGE分析のために上清を新しいチューブに移す。
4. エキソソームペレットを、DNA、RNAおよびタンパク質抽出及びCD9 ELISA ^11を用いて、エキソソーム粒子の定量化のために-80℃で保存することができる。
   NOTE：エキソソームペレットが限ら凍結融解による1年間-80℃で保存することができる。

エキソソームペレットの4バイオマーカーの検出と解析

1. 下流の分析のために、DNA / RNA /タンパク質の単離キットおよびRNA単離キを使用してエキソソームペレットからDNA、RNAおよびタンパク質を抽出製造業者の説明書に従ってトン。試料を2μlの260での吸光度と280nmのを測定することにより、ナノドロップ分光光度計を用いて濃度を決定する。
2. のTaqManマイクロRNAアッセイを用いて定量的リアルタイムRT-PCR（定量PCR）を実行するか、miRNA特異的プライマー（我々の場合、我々は、ヒトのmiR-192及びmiR-1207-5p特異的アッセイを使用）。
3. SDS-PAGE分析のために、一次元電気泳動により4〜12％Bis-Trisゲルおよび別個のタンパク質サンプルを使用する。製造業者の説明書に従って銀染色キットを用いてゲルを可視化する。
4. 製造業者の指示に従ってPVDF膜を用いたウエスタンブロット分析を行う。ウェスタンブロット検出で101のタンパク質またはTSG101腫瘍感受性遺伝子とタンパク質XまたはALIXとマウスモノクローナル抗体相互作用、アポトーシスに連結された遺伝子-2に対するウサギポリクローナル抗体を使用する。オープンアクセスNIH ImageJソフトウェア（http://rsbweb.nih.gov/ij/）によるバンドの密度を定量化するか、同様のプログラム。
5. 製造業者の指示に従ってCD9 ELISAキットを用いて得られた尿中エキソソーム粒子の数を定量化する。

Results

尿中エキソソームは、腎上皮細胞から分泌されるタンパク質に、miRNAとmRNAのバイオマーカーを運ぶ。これらのエキソソームの単離および検出は、糖尿病性腎症などの腎疾患の早期検出に有用な診断ツールを提供してもよい。ヒト被験者から採取した尿サンプルからエキソソームを単離するためのいくつかの方法がある。我々は以前、尿エキソソーム分離の6つのメソッドを比較し、タンパク質、mRNA、およびmiRNAレベル^11を結果として調査した。ここに私たちの目的は、詳細に我々は尿中エキソソームの効率的な分離のために開発した修正された沈殿法を記述することでした。

図1は、修正された沈殿法を用いて、尿中エキソソームの単離に関与する様々なステップの概略的な代表的なフローチャートを記述する。重複エキソソームのOne得られたペレットは、エキソソーム...

Discussion

尿からエキソソームの沈殿を含むほとんどのメソッドは、タム - ホースフォールタンパク質（THP）によって形成されたポリマーネットワークの除去に取り組んでいない。このタンパク質は、推定上のトラップが初期低速遠心分離中エキソソーム尿中に多量に存在する。私たちの修正された方法では、エキソソーム降水前にDTTを使用してTHPを減少させた。 図2に示すように、THPのより高い量は、タンパク質の除去を示し、最後の上清およびエキソソームペレットでないTHPで、未処理の尿及びペレットで観察された。ペレット中のタンパク質の定量は、6倍高い収率を示し、そしてペレットのCD9 ELISA定量には、尿1mlあたりエキソソームの収率が（結果は^11には示されていない）未修飾の沈殿法の5倍高かった観察された。バイオマーカーアリックス⁶とTSG101 ^8はエキソソームペレットで検出された。我々は唯一の集中を使ってこれらのタンパク質を検出することができた未修飾の沈殿法のサンプル。我々はまた、修正された沈殿法^11を使用したmiRNA（ すなわち...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
コーニング 15 ml 遠心分離チューブ	コーニング (シグマ アルドリッチ)	CLS430791
プロテアーゼ阻害剤カクテル	シグマ アルドリッチ	P8340
遠心分離機	ソルバル
DL-ジチオスレイトール	シグマ アルドリッチ	D9779	濃度 200 mg/ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE システム (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well	Invitrogen	NP0321BOX	SDS-PAGE解析用
ECL Advance ウェスタンブロッティング検出キット	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	バイオマーカーのウェスタンブロット検出用
Exoquick-TC Reagent	System Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	エキソソーム単離用
Exosome CD9 ELISA Complete Kit	System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	エクソソーム定量用
AllPrep DNA/RNA/Protein ミニキット	Qiagen	80004	DNA、RNA、タンパク質単離用
Rneasy MinElute クリーンアップキット	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis 分光光度計	Thermo Scientific		タンパク質定量
ProteoSilver Sliver Stain キット	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	SDS-PAGE
ゲルの染色用Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Life Technologies		SDS-PAGEゲルの運転に対応
TaqMan microRNAアッセイ	Life Technologies		RT-PCRアッセイに対応
qBasePlus v1.5ソフトウェア	Biogazelle NV		RT-PCRアッセイデータの解析に
Millipore		に対するウサギポリクローナル抗体	バイオマーカーのウェスタンブロット検出に対応
TSG101	Abcam		バイオマーカーのウェスタンブロット検出用