赤血球上の抗体誘導性補体活性化の定量的検出のための方法

Summary

ここでは、赤血球に対する抗体により誘導される補体活性化を測定するための2つのアッセイを記載する。現在のアッセイ以上の主要な利点は、それらの定量的かつ簡単に解釈する性質である。

Abstract

赤血球（RBC）に対する抗体は、活性化の肝臓における補受容体を介して加速されたクリアランス（血管外溶血）を生じるか、RBCの血管内溶解をもたらすを補完する可能性があります。補体活性化につながる赤血球抗原に対する同種抗体（ 例えば ABO）または自己抗体（自己免疫性溶血性貧血、AIHAに見られるように）潜在的に有害であるとすることができます-血管内溶解をもたらす場合は特に-致命的な^1。現在、原因のRBC ON（自動） -抗体に補体活性化は、RBCまたはRBC溶解^1-4を反映した非定量溶血アッセイによる補体沈着を反映したクームス試験を使用することにより、in vitroで評価される。しかしながら、補体阻害剤の有効性を評価するためには、定量的な技術を有することが必須である。ここでは、そのような2つの手法を説明します。まず、患者の血清中の抗体により誘導される赤血球上C3及びC4沈着を検出するためのアッセイは、プレsented。このために、FACS分析を蛍光標識した抗C3または抗C4抗体とともに使用される。次に、定量的溶血アッセイが記載されている。このアッセイでは、患者血清により誘導される補体媒介性溶血が放出されたヘモグロビンの分光光度検出を利用して測定される。これらのアッセイの両方が抗体誘導性の補体活性化の研究を容易にする、非常に再現性および定量的である。

Introduction

赤血球（RBC）に対する抗体は、レシピエント赤血球上に存在しない抗原を発現する赤血球の輸血によって誘導することができる。これらのアロ抗体は、以下の輸血⁵時に補体活性化に起因する重篤な急性溶血性輸血反応を引き起こす可能性があります。自己免疫性溶血性貧血（AIHA）において、患者は、自分自身の赤血球に対する自己抗体を有する。これは、脾臓および/ ​​または肝臓^6,7における補体受容体を介して補体を活性化することが自己抗体の場合には食細胞上のFcγ受容体と赤血球に結合したIgGの相互作用を介して細胞の加速クリアランスにつながる。血管内溶血をもたらし劇補体活性化は、稀ではあるが、多くの場合致命的である。加速、急性貧血ので、潜在的に致命的な組織低酸素のいずれかで同種もしくは自己抗体の結果によって誘導された媒介赤血球の破壊を補完します。 AIHAにおける自己抗体はdependin、暖かいと冷たい抗体に分類されている彼らは赤血球（それぞれ37℃以下）に結合し、最適な温度にグラム。暖かい抗体は、IgGアイソタイプおよびIgMアイソタイプ^8,9の寒抗体の通常です。 AIHAは例えば lymphoprolyferative疾患、結合組織疾患、固形腫瘍、感染症や薬物への二次的であり得るが、症例の50％においてAIHAは特発⁹です。

γグロブリン（ 例えば、。のIgGまたはI....

Protocol

1。ブロメライン処理した赤血球の準備

1. 1X PBS（2-5分間664×gの遠心分離）で3回0に型指定された赤血球を洗浄します。
2. 37℃で10分間、0.5％ブロメライン溶液を2倍量のパックされたRBCの1の体積をインキュベート
3. 細胞は1×PBSで3回洗浄します。
4. 細胞は、少なくとも1週間1×PBS中で4℃で3％の溶液として保存することができる。

2。 FACSによる赤血球上のC3、C4の堆積分析

1. 56℃で30分間サンプルを加熱することによって患者の血清（または他の抗RBC抗体源）の必要量を、熱不活性化
2. ブロメライン処理した赤血球のVBG 3回洗浄する^{。 -} （5mMのベロナール、150mMのNaCl、0.05％ゼラチン液pH7.4）およびVBG ^{+ +（VBG -} + 2mMのMgCl ₂ + 10mMのCaCl _2）に再懸濁し得0.5％溶液。
3. ガラスパール（fで丸底プレートには、次のコンポーネントをピペットまたは適切な混合）：25μlの0.5％赤血球、37.5μlの新鮮なAB血清（補体源）と37.5μL200μg/ mlの抗C5。抗C5は高価であり、入手が困難な場合があります。一つはC5-/C6-/C7-またはC8-欠損血清の代わりに、AB血清およ....

Results

図2Aは、赤血球のための代表的な散布図を示しています。 FSC-プロット（P1） - シングル赤血球に適しゲーティングはデFSC-Wで見ることができます。通常、RBCの約95％がこのP1のゲート（単セル）内に入るが、患者血清中の高い割合が使用される場合、これは、抗IgMのRBCは、患者血清中に存在する場合は特に、70〜80％に低下することができる。

C4沈着にAIHA患者血清の効果についての代表的な結果を図2B及び図2CにおけるC3沈着に示されている。これらの図から分かるように、より多くの患者の血清は予想されるように、より多くの補体沈着をもたらす。不思議なことに、補体の堆積は、2つの異なる正のピークで発生します。赤血球は、単一のドナーから採取されたので、これはおそらく、赤血球集団の不均一性が原因ではありません。我々はまだこの現象の原因を調べている。 図2D及び2Eの demonstraC4（ 図.......

Discussion

上記のアッセイは、再現性と堅牢である。それらは、実施が容易であり、それは（96ウェルプレート）で同時に多数のサンプルを用いてそれらを行うことができる。したがって、このアプローチはまた、ELISAロボットシステム、例えば 、完全に自動化されたシステムに適しているであろう。現在使用される技術とは対照的に、これらのアッセイは定量的であり、これは、補体阻害剤の効果の研究において、例えばを助ける。さらに、解釈は、現在使用されたアッセイを改良したもので客観的である。

両アッセイは、1重要なステップがあります。これらは1イベントとしてカウントされますので、凝集したRBCは、人為的に高いシグナルを与えるので、FACS分析において重要なのは、単一の赤血球にゲートにある。低濃度は依然として良好なシグナルを与えるので、それは、低い患者の血清中濃度を用いて凝集を防止するためにも優れている。溶血アッセイでは、慎重に上清aを転送するために重要である新しいプレートにFTERのインキュベーションは、RBCのキャリーオーバーするので（意志の気泡のような）信頼性の低い信号につながる.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	フレゼニウス・カビ
BSA	シグマ	B-4287
バルビタール	ファグロン	0261	この化学物質は薬物規制の対象となります。
ナトリウムバルビタール	ファグロン	0263	化学物質は、薬物規制の対象となります。
ゼラチン	メルク	1.0470.0500
塩化ナトリウム	メルク	1.06404.1000
塩化マグネシウム	メルク	1.05833.0250
塩化カルシウム	メルク	1.0238.0500
ダイライト488アミン反応性染料	ピアス	46402
ダイライト650アミン反応性染料	ピアス	62265
&アルファ;C5(エクリズマブ)	アレクシオンファーマシューティカルズ
FACS(Canto)	BD		適切なレーザーを搭載したFACSであれば、どのようなものでも使用することができます。
分光光度計(例:ムルチスカンスペクトル)	Thermo Labsystems	1500-193	適切な波長範囲の任意の分光光度計を使用可能
BD FACSDiva software v 6.1.2	BD	643629	互換性のある FACS 解析ソフトウェアを使用可能
Bromelain	サンキン	K1121