中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する C.虫胚

サマリー

このプロトコルは、画像に線虫（Caenorhabditis elegans）の胚における組織内の細胞を分割する方法について説明します。いくつかのプロトコルは、初期胚の画像細胞分裂に、このプロトコルはどのように中期後期胚形成の間に開発し、組織内の細胞分裂像に説明して方法について説明している。

要約

このプロトコルは、 線虫（Caenorhabditis elegans）の胚の開発内のセルを分割するイメージに蛍光顕微鏡の使用が記載されている。特に、このプロトコルは、表皮細胞の下に見られ、表皮の形態形成に重要であり得る神経芽細胞を、割るどの画像に焦点を当てています。組織形成は、後生動物の開発のために重要であると、隣接する組織から外部の手がかりに依存しています。 で虫顕微鏡を通して勉強するために、その組織が ​​容易、、その透明性とシンプルな組織に生体内で組織の形態形成を研究するための優れたモデル生物である。腹側筐体は、胚の腹側表面は、上皮細胞の単層によって覆われているプロセスである。このイベントは、上に横たわる上皮細胞の遊走を媒介する化学的な指導の手がかりを提供する基礎となる神経芽細胞によって促進されると考えられている。しかし、神経芽細胞は、高度に増殖性であり、また働くことができる腹側表皮細胞のための機械的な基質として。この実験プロトコルを用いた研究は、組織形成の間に細胞間コミュニケーションの重要性を明らかにでき、現像組織内の細胞分裂に関与する遺伝子の役割を明らかにするために使用することができる。

概要

初期のC言語で画像細胞分裂する方法を記述したプロトコルがありますが虫胚 、このプロトコルは、どのように中期胚発生の間に組織内の画像細胞分裂に説明します。開発中に生物を画像化における主要な課題の一つは、光毒性に対する感受性となっている。しかし、回転ディスク共焦点顕微鏡または掃引視野顕微鏡へのアクセシビリティの向上は、より広範な画像処理アプリケーションを可能にした。両方のシステムは、生物体が曝露されるUVのレベルを制限する、固体レーザ散乱光を使用する。しかし、広視野スタンドはまだ彼らは、高感度（ 例えば EMCCD）、絞り制御や調光（ 例えば LEDまたは調整可能な水銀灯）を搭載したカメラも完備されています場合は特に、 生体内での画像化に使用することができます。このプロトコルは、C.を開発内の画像、細胞分裂に共焦点ベースのシステムや広視野システムのいずれかを使用する方法について説明します虫</ em>の胚。一例として、我々はどのように画像神経芽細胞分裂に説明します。神経芽細胞は、上にある表皮細胞に化学的または機械的な手がかりを提供することにより、表皮の形態形成を促進し、及び組織の形成において細胞間コミュニケーションの重要性の優れた例を提供してもよい。

線虫（Caenorhabditis elegans）は、その透明性とシンプルな組織体制¹による顕微鏡観察に基づく研究のための理想的なモデル生物である。さらに、C.エレガンスは、遺伝的方法およびRNAiに適しており、その遺伝子の多くは、ヒト相同体を有するので、組織形成のために保存された^2-5のメカニズムを同定するために用いることができる。 Cでエレガンスは 、表皮の形成は胚が> 300個の細胞を有する場合、中間胚形成の間に起こる。表皮の形態形成は、胚が収縮、表皮細胞の層で囲み、EMBRを変換するために拡張されている間、いくつかの主要な段階で構成されていワーム⁶の細長い形状に卵形のフォームからよ。腹側表皮細胞が胚（ 図1）の腹側表面を覆うように腹側正中線に向かって移動する際、腹側の筐体には、これらの形態形成のイベントのいずれかを説明します。まず、前方に位置する前縁細胞の2組は、その反対側の隣人⁶と腹彼らが付着正中線、ヒューズに向かって移動。これは、腹のポケット^6-7を作成する図形のようなくさびを形成し、後方に位置するポケット細胞の遊走が続いている。ポケットを閉じメカニズムはよく分かっていない。一つの可能性は、細胞レベル以上のアクチンミオシン収縮構造は⁸創傷^治癒と同様に、ファッションのような巾着で一緒にポケット細胞を結びつけることです。興味深いことに、ポケットセルの一部の移行はepidermiの下に発見され、基礎となる神経芽細胞の特定のサブセット^9（神経前駆細胞によって媒介される秒; 図1B）。

以前の研究は、神経芽細胞が腹側表皮細胞遊走および腹側筐体を調節することを示したVAB-1（エフリン受容体）およびVAB-2（エフリンリガンド）は高度に神経芽細胞で発現させ、互いから前方および後方の神経芽細胞の選別を容易にし、及びVAB-1の突然変異またはVAB-2腹エンクロージャーの表現型の原因^10月13日 。しかしながら、プロモーターレスキュー実験はVAB-1はまた、神経芽細胞によって分泌される他の指導の手がかりのため覆う腹側表皮細胞及び受容体は、腹側表皮細胞において発現される⁹で必要とされることを示した。これらの受容体のいずれかにおける突然変異は腹側筐体表現型を引き起こすが、欠陥がガイダンスに応答する神経芽細胞による位置決めにおける問題に起因又は腹側表皮細胞の障害を発生した場合、それは明らかではない¹⁴頭出し。神経芽細胞のWIの区分を変更すること指導の手がかりを分泌する能力に影響を与えるthout神経芽細胞の役割と表皮の形態形成の間に機械的な入力を提供する能力に光を当てることができます。最近では、細胞分裂遺伝子、 挙-1（anillin）は高度に神経芽細胞（ 図2A）で発現され、その枯渇は神経芽細胞分裂の欠陥を引き起こすことが見出された。興味深いことに、これらの胚は、腹側の筐体の表現型（Fotopoulos、WernikeとPiekny、未発表の観察）を表示します。

Anillinは、細胞分裂に必要であり、特に母細胞が物理的つの娘細胞に分割する方法を記載して細胞質分裂のためされる。細胞質分裂はきつく、それが適切に姉妹染色分体の分離と連結されることを保証するために空間及び時間的に制御する必要がアクトミオシン収縮環の形成により駆動される。後生動物細胞質分裂のマスターレギュレータはRhoAの（C.エレガンスにおけるRho-1）であり、低分子量GTPaseであるそのGTP結合型でのctive。 GEF Ect2/ECT-2はRhoAの-GTPが収縮環を形成し、その侵入^15を仲介する下流のエフェクターと相互作用した後、RhoAのをアクティブにします。 Anillinは、そのC末端を介して、そのN末端を介して、アクチンとミオシンとのRhoAに特異的に結合するマルチドメインタンパク質である。 Anillinは、哺乳類やショウジョウバエS2細胞¹⁶における収縮環の位置を安定させるために必要とされている。 Anillin枯渇は、横振動を受けるように収縮環を引き起こし、最終的に細胞質分裂が多核細胞を^17〜19を形成する失敗。興味深いことに、C.ものの虫ANI-1は、細胞質分裂に必須ではない、初期胚でアクトミオシンの収縮を調整します。しかし、上述したように、ANI-1は半ば胚発生（Fotopoulos、WernikeとPiekny、未発表の観察）の間、神経芽細胞質分裂に必要です。細胞質分裂の失敗は、神経芽細胞の数や位置を変更するであろうし、LOCに影響を与える可能性が化学的な指導の手がかりのATION、またはそれは、組織の機械的特性を変化させることができる。両モデルとも腹エンクロージャの神経芽細胞の非自律的役割、及び胚発生時の組織組織コミュニケーションの重要性を強調している。

この実験プロトコルは、C.の間にどのように画像細胞分裂に説明します蛍光顕微鏡を用いて、中間胚形成エレガンス 。細胞分裂のメカニズムを研究する実験の大部分は限られた数の細胞（ 例えば、C.一細胞胚、 アフリカツメガエル 、または棘皮動物エレガンスで培養皿（ 例 。HeLa細胞またはS2細胞）内の単一細胞または初期胚において行った胚）。しかし、分割面のタイミングおよび配置に影響を与えることができる外部の手がかりが存在するように、また組織内で細胞分裂を研究することが重要である。さらに、細胞が隣接する組織の発達に影響を与えるために化学的または機械的な手がかりを提供することができるS、それは細胞間の通信は、開発中に形成するために組織をどのように役立つかを理解することが重要です。

プロトコル

1。ワーム株を維持し、RNAiを実行するためのプレートの作製

1. 線虫の成長培地プレート
   1. プレート
      1. ワーム株を維持し、遺伝的交雑を実行するために線虫増殖培地（NGM）プレートを準備します。 2 Lのフラスコに1Lの蒸留水で3のNaCl、17グラム寒天および2.5グラムバクトペプトンを組み合わせて、金属撹拌棒を加える。
      2. 寒天を溶解するとメディアを殺菌するために、フラスコをオートクレーブ。その後、撹拌プレート上でフラスコを置き、攪拌しながらメディアを冷却します。
      3. 媒体を冷却し（45〜50℃）をタッチすることがやや温かいはあり一旦1 mlの1 MのCaCl _2、1 mlの1 MのMgSO _4、5 mg / mlのコレステロール溶液1mlおよび25 mlの1 Mを追加リン酸カリウム緩衝液（PPB、試薬/材料のテーブルのレシピ、フィルタは保存溶液を殺菌）し、すぐに60ミリメートルのX 15ミリメートル（小ペトリ皿にメディアを入れ、上部または13ミリリットル/プレートに食器〜3月4日を埋めるUSI）自動化されたディスペンサーをngの。注：いくつかの株をテトラサイクリンの長期維持のための細菌RNアーゼIII遺伝子のトランスポゾンTn10の不活性化を可能にするためにプレート（12.5μg/ ml）を添加することができる。
      4. メディアは、室温で一晩固化してみましょう。注：プレートは、生物学的フード内または汚染を受けにくい実験室の領域で維持されるべきである。また、真菌の汚染を制限するために（ティッシュペーパーで例えばクリーン）蓋上に蓄積している任意の結露を取り除きます。テトラサイクリンはまた、プレートに添加されている場合は、この抗生物質が光感受性であるように、次いでアルミホイルでそれらを覆う。
      5. 次の日、Eの懸濁液を乾燥NGMプレートをシード大腸菌 、穏やかにボルテックスされている（OP50株は第1.1.2項を参照）。交配用のプレートを作るために、（小さな円を形成するために）各プレートの中央にOP50の〜50μlを加える。ワーム株を維持するためのプレートを作るために（OP50の〜100〜200μlの各NGMプレートをシードそれは）、プレートの大きな領域をカバーしていることを確認してください。
      6. 播種したプレートを室温で乾燥O / Nをしてみましょう。
      7. 次の日、上下逆に乾燥したNGMプレートを回転させ、4℃でプラスチック製の保存容器にそれらを積み重ねる注意：プレートを〜3-4週間まで使用可能である。テトラサイクリンを含むプレートを暗所に保管してください。
   2. 食べ物
      1. Eを使用してくださいCの食料源として、[ 線虫遺伝学センター（http://www.cbs.umn.edu/cgc CGC）から] 大腸菌 OP50 。虫注：OP50は、-80℃（50％（v / v）のグリセロール中の比1:1）でグリセロールストックとして保存することができる。
      2. NGMプレート用のOP50を作るために、グリセロールストックの少量使用してストリークプレートを作る（<10μLを、滅菌したピペットチップを使用します）。 LB寒天プレート（試薬/材料の表中のレシピ）に細菌を広げて〜16時間、37℃でそれを残す。注：汚染に問題がある場合は、ストレプトマイシン耐性OP50を使用することができ、ndはストレプトマイシンをLB寒天プレート（50μg/ ml）を添加することができる。
      3. 次の日、単一のコロニーを採取し、500ミリリットルのフラスコ中の液体LB培地（試薬/材料の表中のレシピ）の100ミリリットルに接種。
      4. 培養は、振盪しながら37℃でO / Nで成長しましょう​​。
      5. 次の日、NGMプレートに播種するための細菌懸濁液を使用しています。注：OP50を、50mlのコニカルチューブに等分し、約4-6週間4℃で保存することができる。
2. RNAiは
   Cで 、供給がRNA媒介干渉（特定の遺伝子産物をノックダウンするRNAi）を実行するための主要な方法の一つです虫。C.虫の雌雄同体は、Eを供給することができ、誘導時のdsRNAを発現する給電ベクターで形質転換された大腸菌株 HT115。このdsRNAは（またはそのフラグメント）は、通常、特定の遺伝子標的の実質的なノックダウンを生じ、生殖腺に伝達される。
   1. RNAiのプレート
      1. 前述したように（NGMプレートを準備します第1.1.1項）を参照してくださいだけでなく、1 M IPTG（イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシドの1ミリリットルを追加します。）dsRNAの発現を誘導し、50 mg / mlのアンピシリン（アンプ500μlのは、dsRNAを発現ベクターにはアンプです耐性暖かいメディア（45〜50℃）まで）。
      2. プレートを乾燥させた後に、Eの50〜100μL〜でそれらをシード大腸菌 HT115（1.2.2項を参照）。注：非シードプレートを約4〜5週間、4℃で保存することができる。
      3. 播種したプレートを室温で一晩乾燥させます。
      4. 次の日、上下逆に乾燥したRNAi板を回し、15〜20℃でプラスチック製保存容器に保管して注：播種したプレートが約2〜3週間までのためのRNAiの効率を維持します。
   2. RNAiの食品
      1. Eを使用してください（CGCから、1.1.2項を参照）、大腸菌 HT115は、目的の遺伝子をcDNAを含む送りベクトルL4440、L4440かで形質転換された。注：ゲノム中のオープンリーディングフレームの大部分を標的とする摂食ライブラリーすでに作られ、HT115に変換L4440内（クローン可能ですされてきた。 例えばANI -1 ^20〜21のためにY49E10.19から断片を含む、。http://www.gurdon.cam.ac.uk/〜ahringerlab /ページ/ rnai.html）。注：HT115は、C（50％v / vのグリセロール中の比1:1）-80℃でグリセロールストックとして維持することができる。
      2. 目的の遺伝子をターゲットに新たな構築物を作製するために、IPTGによって誘導可能であるフランキングT7プロモーター、間L4440ベクトルマップとクローンのcDNAを参照してください。
      3. 形質転換のための標準プロトコル（ 例えば 、化学的にコンピテント細菌を作り、熱ショック変換を実行）を使用して、L4440構築物でHT115を変換します。
      4. （1.1.2項を参照）OP50について記載したように、LB寒天プレート上のグリセロールストックが、プレートからのストリーク細菌はまた、アンピシリンの50μg/ mlのが含まれている必要があります。注意：事前に既存のL4440構成要素を使っている場合は、セクション1.2.2.2-1.2.2.3をスキップします。
      5. 単一のコロニーを選び、5ミリリットルを接種LB培地50 mg / mlのストック（LBアンプ）からのアンピシリン5μLを含む、振とうしながら37℃で配置します。
      6. 〜16時間後、O / N培養液50μlを新たなLBアンプ·メディアの5ミリリットルを接種し、37℃で振とうしながら7-8時間、文化を育てる
      7. 4,000〜8,000×gで1分間遠心細菌は、上清を廃棄し、新しいLBアンプメディア500μlのペレットを再懸濁。
      8. （1.2.1項を参照）、上記のようなRNAiプレートをシードするこの菌液を使用してください。注意：HT115は、すぐに使用されるべきであると保存しないでください。

2。ワーム株を栽培

C.を維持標準プロトコル¹に従ってNGMプレート上CGCから注文エレガンス株。このプロトコルのために使用した株は次のとおりです。Cを虫 VARブリストル、野生型（CGC N2のひずみID）と、UNC-119（tm4063）; wgIs102 [HAM-1 :: TY1 :: EGFP :: 3XFLAG + UNC-119（+）]（CGC OP102におけるひずみID）と、UNC-119（ED3）; ltIs44pAA173 [ パイ-1P-mCherry :: PH（PLC1delta1）+ UNC-11 9（+）]（CGC OD70でのひずみのID）; AJM-1（ok160）; jcEx44 [AJM-1 :: GFP + ROL-6（su1006）]（CGC SU159におけるひずみID）と、UNC-119（ED3） ; xnIs96 [pJN455（HMR-1P :: HMR-1 :: GFP :: UNC-54 3'UTR + UNC-119（+）]（CGC FT250でのひずみのID）。

1. 新鮮なNGMプレートに正しい表現型を示す〜3の若い大人の雌雄同体を選ぶ。注：N2（ブリストルvar.;野生型）は15〜25℃の間に維持することができるが、それらは、より高い温度でより速く密度に達する。ウォーム密度が高い場合には、新しい在庫がなされるべきである。
2. 蛍光タンパク質の最適な発現のために20〜25℃で全ての蛍光株（ 例えば 、GFPおよび/ ​​またはmCherry発現ワーム）を保つ。ウォーム密度が高く、食品が低いときに新しい在庫がなされるべきである。
3. ワームをピックアップし、使用プル終わり（〜長さ3〜5 CM）で融合白金線で引っ張らガラスピペットから作られたピック。滑らかなエッジに線を平らに。雌雄同体アップ」スクープ」にピックを使用して、新しいプレートに転送します。株の交差汚染を回避するために使用との間に線を炎。

3。 RNAiは

1. RNAiを実施する
   1. まず、ワームからOP50細菌を除去するために〜30〜60分間播種されていないのNGMプレート上〜8のL4雌雄同体の場所。
   2. その後、NGMアンプ、IPTGプレートに8雌雄同体を置き、目的の遺伝子にdsRNAを発現L4440プラスミド運ぶHT115を播種（ たとえばANI-1;。1.2を参照のこと）〜24時間。注意：目的の遺伝子に応じて、または（ノックダウンの強さに依存してもよい）所望の表現、ワームは時間の短いか長い期間のRNAiプレート上に残すことができ（24時間後に、新鮮なRNAiに雌雄同体を配置プレート）。
   3. NEGのためのative制御、RNAiのプレートの上に置いてワームは、空L4440ベクターを有するHT115を播種。注：これらの胚がない表現型を持つべきではない。
   4. 陽性対照のために、十分に特徴付けられた表現型を有する遺伝子を標的dsRNAを発現するRNAiプレートにワームを置く。注：24時間および雌雄同体は48時間後に滅菌されている後のρ-1（Y51H4A.3）のために、胚は100％の致死的である。
2. RNAiの有効性
   RNAiによるノックダウンのレベルはいくつかの組織が他のものより耐性があることがあり、特に以来、テストする必要があります。中旬胚発生の間、ほとんどの組織は、RNAiと小文字が区別されますが、後半に胚または幼虫において、神経細胞は、RNAi耐性である。異なる菌株は、RNAi感度（ 例えば、RRF-3）を改善する、または（神経プロモーターのunc-119により発現される導入遺伝子と組み合わせて、例えばのsid-1）組織特異的RNAiを生成するために使用することができる。
   1. ウエスタンブロット法
      Cを使用した免疫ブロッティング虫のタンパク質は、することができます標準プロトコル²²に従って行う。
      1. RNAiを行った後、約2分間煮沸することによって20〜30μlの1×SDS-PAGE試料緩衝液と溶解を追加し、微量遠心管中〜（胚で充填）妊娠10雌雄同体を収集する。同様に、対照サンプルのために別のチューブにN2虫を集める。注：雌雄同体の数は、一次抗体の感度に依存して変化し得る。
      2. 試料緩衝液中で対照試料（ 例えば、3から100パーセント）の希釈液を作成する。 （％ゲルは、目的のタンパク質の大きさによって異なります）コントロールおよびRNAiのサンプルをロードし、標準プロトコルに従って、SDS-PAGEによって実行されます。
      3. 膜にゲルを移し、標準プロトコルに従って免疫ブロッティングを行う。注意：使用する異なる一次および二次抗体の希釈液を各抗体について推奨されている。
      4. 開発（ 例えば化学発光を使用している場合）またはスキャン（ 例えば 、蛍光を使用している場合）イムノブロットをして目を比較電子のRNAiのレーン対N2レーンにおけるバンドの密度、およびノックダウンのレベルを決定する（ 例えば、RNAiのレーンの密度は12％の対照レーンに一致し、これは、タンパク質が88％減少することを示唆している）。注：マドックスら ^23を参照してください、ANI-1ノックダウンの効率を確認するには
   2. 免疫染色
      Cの免疫染色エレガンスは、標準的なプロトコール²²に従って行うことができる。
      1. RNAiを行った後、2つの方法のいずれかを使用して妊娠雌雄同体と収穫の胚を収集します。のいずれかの方法で、1.5ミリリットル中のM9バッファー内の場所の雌雄同体（試薬/材料の表中のレシピ）遠心分離を介してシリコン処理マイクロチューブ、ペレット（1,000〜4,000×g）でください。注：同様にN2妊娠雌雄同体を収集します。
      2. M9溶液を除去。
      3. 3分間のマイクロ遠心チューブに漂白溶液1ml（1 MのNaOH、5％の漂白剤）を添加することによって胚を追い出す。同様に、漂白N2彼コントロールスライドを作るためにrmaphrodites。
      4. 渦優しく、その後すぐに遠心分離（4,000〜8,000 XG）を介して胚をペレットと漂白液を除去します。注意：ワームは、漂白剤とインキュベートする合計時間が5分を超えてはならない。
      5. ポリ-L-リジンコートした顕微鏡スライド上にガラスパスツールピペットを用いて移植胚、胚はトリス緩衝生理食塩水（50mMのトリスpH7.5、150mMのNaCl TBS）で3×洗浄する。注意：コートにポリ-L-リジンでガラス顕微鏡スライドを、最初のスライドを拭くと、ポリ-L-リジンの降下（約20から30μl）を追加し、表面全体に均等に広げ、乾燥させます。最適な結果を得るために、コートスライド2回。胚（セクション3.2.2.1-3.2.2.5）を収集するための代替方法は、ポリ-L-リジンコートした顕微鏡スライド上にM9の滴を配置し、液滴中に妊娠10〜雌雄同体を選択することである。
      6. 各顕微鏡用スライドの上にカバースリップ（胚のほとんどが含まれている領域への）と場所を追加します。液体窒素中でスライドする。注意：ドロップに直接入れ雌雄同体のために、雌雄同体をこじ開けると、胚を追放するためにカバースリップの上に圧力をかけた。
      7. 直ちに液体窒素中でそれらを凍結後にカバースリップをオフにフリックで胚を凍結割れ。
      8. 胚を修正するために20分間氷冷メタノール中でスライドを置きます。注：一部の抗原は、例えばパラホルムアルデヒドなどの架橋固定剤が好ましい場合がある。 Duerr ²²からプロトコルを参照してください。
      9. 10分毎に、スライドを洗浄することによって胚を再水和すると透過性をトリス緩衝生理食塩水でのTween-20（50mMのトリスpH7.5、150mMのNaCl、0.1％Tween-20をTBST）を含有する4倍。
      10. 胚の大部分を含む領域を中心に、各スライドを乾燥させ、液体ブロッキングペン（ 例えば 、PAPペン）を使用して、胚の周りに円を描く。
      11. 各スライド（丸で囲んだ部分）にし、インキュベート、5％正常ロバ血清（ブロックNDS）とのTBST〜100μLを追加RTで20分。注：「湿っ室」（湿ったペーパータオルを含む蓋付きなどの皿）でスライドを置きます。
      12. ブロックを削除し、各スライド（丸で囲んだ部分）に（TBSTで希釈）の一次抗体の〜50〜100μLを加え、室温で2時間インキュベートする。注意：抗体によっては、希釈およびインキュベーション時間は変更になる場合があります。 GFPを検出するために、我々は、1/200希釈の抗マウス抗GFP一次抗体を使用する。 ANI-1を検出するために、我々は（親切エイミーShaubマドックス、ノースカロライナ大学チャペルヒル校で提供される）1600分の1希釈抗ウサギ抗ANI-1次抗体を使用しています。より長いインキュベーション時間については、4℃でスライドを配置する
      13. （可能な場合は、将来の使用のために保管し）、一次抗体を除去し、スライドを5分間ずつ、TBSで3回洗浄します。
      14. 最後の洗浄液を除去して、各スライド（丸で囲んだ部分）に〜（TBSTで希釈）二次抗体の50〜100μLを加え、室温で2時間インキュベートする。注意：抗体によっては、希釈は変更になる場合があります。 GFPを検出するために、我々はAを使用1/250希釈でのNTIマウスAlexaフルーア488二次抗体。 ANI-1を検出するために、我々は1/250に希釈した抗ウサギアレクサフルーア568二次抗体を使用しています。
      15. 二次抗体を除去し、スライドを5分間ずつ、TBSで3回洗浄します。注：; 1/500で5分間、TBSTで希釈DNA染色には、DAPIの〜50〜100μlの（1 mg / mlの4 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール）を加える。
      16. DAPIを取り外し、スライドを5分間ずつ、TBSで2回洗う。注：DAPI染色を行わない場合は、この余分な洗浄工程を省略。
      17. 封入剤の15μlを37℃（4％n-プロピル3.4.5 - トリヒドロキシ（プロピルガレート）、50 mMトリス、pHが9に予熱〜、0.1Mトリス（pH 9）で1クイックウォッシュを行う削除し、追加します各スライド（丸で囲んだ部分）に50％グリセロール）。
      18. 余分な液体を吸い上げるとマニキュアでスライドをシール（丸で囲んだエリア内の封入剤の上に）各スライドにカバースリップを追加します。注意：スライドは-20℃で保存することができます
      19. 上の胚を観察する広視野蛍光顕微鏡、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いてスライドする。重要なのは、コントロール（N2または非RNAi）と胚を用いて、最適なピクセル強度の画像を収集するために設定を調整します。その後、同じ設定を使用したRNAi胚から画像を収集する。コントロール対のために収集された画像の例挙-1のRNAi胚は、図2Bに示されている。

4。ライブイメージングや収穫胚スライドの調製

1. ライブイメージングのためのアガロースパッドの調製
   1. それらの上にテープを1〜2ストリップで2他のスライド、それぞれの間のきれいな、事前温め顕微鏡スライドを置きます。
   2. ガラスパスツールピペットを用いて、スライドに（加熱された蒸留水に溶解した）Vアガロース/ Wの2％の1滴を追加します。
   3. すぐにアガロースドロップを平らにするために垂直に最初のスライドの上に第二に、クリーンな顕微鏡スライドを配置。注：近隣上のテープをスライドESはパッド用厚さを提供します。
   4. 一番上のスライドを削除する前に、1〜2分間、アガロースパッド乾かします。下にアガロースパッドを壊さないように注意し、トップスライドをオフにスライドさせます。注意：たまにパッドは、トップスライドに転送され、まだ使用可能である限り、それはそのまま残りますように。
   5. 以下に説明するように（ステップ4.2を参照）、その調製後、数分以内に、アガロースパッド上に胚を移す。注：パッドは不透明な外観を有するべきであることが明らかになると、それは使用するにはあまりにも乾燥している。
2. 収穫胚
   1. Sulston らから派生してライブイメージングのための胚を収集するため、次のプロトコルを使用します^。24
   2. NGMまたはRNAiプレートから約4〜6妊娠大人（飢えない）を選んで、うつ病のスライドに十分にM9バッファ20〜30μLに配置します。
   3. に（または外陰部付近）受精のいずれかの側にワームをカットする滅菌外科用メスを使用し溶液中に胚をリリース。
   4. ガラスキャピラリ/ピペットに接続されているマウスピースとゴムホースを使用し、小さな穴があり、口のピペッティングにより胚を吸引する引っ張った。あるいは、パスツールピペットのゴム球に取り付けられたキャピラリーガラス管で胚を集める。
   5. ワームの残骸から分離を助けるために、また、M9緩衝液を含む第2のウェルに吸着胚を転送します。
   6. その後、吸引新たに調製したアガロースパッド上胚（ステップ4.1を参照）。
   7. 一緒に1、X、Y平面で撮影することができる胚の数を増やすために（歯のピックに接着）まつげを使用してクランプ胚。注：酸素欠乏を回避するために、一緒に10以上の胚を凝集しない。
   8. 撮像中に胚の脱水を防ぐために、（溶融して1:1:1組み合わせ、ワセリン、ラノリン、パラフィン）次に、カバースリップでスライドをカバーし、部分的に事前に加熱された液体VALAPでそれを封印。注：追加のM9バッファーCAN胚はイメージングのための十分な液体があることを確認するためにパッドに追加される。 VALAPの代わりに、ワセリンは、部分的にカバースリップをシールするために使用することができるが、それはカバーガラスが滑りと顕微鏡対物レンズの上に得ることができるせる低剛性である。

5。ライブイメージング

1. 神経芽細胞を可視化するために、蛍光タンパク質に結合神経芽細胞固有のタンパク質を発現するワーム株を取得し（ 例えば HAM-1：GFP、CGC OP102でのひずみのID）。細胞膜を検出するには、異なる蛍光タンパク質（。：PH、CGC OD70でのひずみのID など mCherry）に付着した脂質を認識するタンパク質ドメインを表現するワーム株を使用しています。
2. 蛍光性の雌雄同体から収穫胚（プロトコル4を参照のこと）（プロトコル3および4参照）、上述のようにスライドを調製コントロールまたは挙-1のRNAiプレート上で維持した。
3. 落射蛍光顕微鏡による4Dの画像胚の（x、y、z及び時間経過）。 WIのいずれかを使用defieldシステム[GFP及びテキサスレッドためのフィルタを使用して自動化された蛍光顕微鏡、60Xまたは100Xまでの目標、高解像度CCD（電荷結合素子）カメラ、高度に自動ステージ（ 例えばピエゾZ）と専門取得ソフトウェア]またはlivescan掃引フィールド共焦点顕微鏡[488 nmおよび561 nmのレーザー、100Xまでの目標、EMCCD（電子増倍CCD）カメラ、高度に自動ステージ（ 例えばピエゾZ）と専門取得ソフトウェアで自動蛍光顕微鏡]。注：広視野システムの場合、LEDとEMCCDカメラを使用して毒性を制限する。また、スピニングディスク共焦点顕微鏡は、掃引磁場システムの代わりに使用することができる。
4. いずれかのシステム上の画像神経芽細胞分裂には、10倍を使用して胚または20Xの目標のYフレームをXを見つけ、胚は背側のインターカレーションを受けている最適なX、Yフレームを選択（前腹側筐体にステップを、 図1（a））やアールを早い段階での腹側筐体（; 図1A最初の細胞分裂後〜350分）。
5. 掃引視野顕微鏡では、50のスリット、40％の出力で488 nmおよび561 nmの100 mWのレーザーを使用しています。 （制御可能な場合）広視野システムでは、低〜中光強度で、GFPおよびテキサスレッドフィルターを使用しています。注：広視野システムの場合、LEDは、低い光毒性を有すると好ましい。
6. どちらのシステムでは、60Xまたは100X油浸対物レンズを使用し、10分、合計0.2〜2分ごとの20 Zスタックを収集します。注：なお、HAM-1：GFPとmCherry：PHプローブは比較的高レベルで発現し、各プローブの露光時間が異なる顕微鏡のために最適化されなければならない。注：広視野システムでは、少数のZスタックは、光毒性を制限し、より長い期間にわたる画像化のために、少数の時点を使用することをお勧めします。
7. 傭兵を使用する場合（広視野システムでUV光に胚の曝露によって引き起こされる光毒性を最小限にするためにユリィバルブ）、30％の開口部を閉じて（）調整可能な照明システムを使用して、光強度を低下させる。注：利得は、システムのいずれかを使用して必要とされないが、他の顕微鏡が最適なピクセル強度の画像を得るために、ゲインの使用を必要とする可能性が異なる開口数を有する低い強度または目的の光源を有してもよい。任意の観察された表現型は人工光毒性によるものではないことを確実にするために、制御胚を使用して条件をテストします。

6。顕微鏡データの分析

1. TIFFをとして画像、エクスポートファイルを分析し、そのようなJavaベースの画像処理プログラム（ 例えば ImageJの、NIH、http://rsbweb.nih.gov/ij/）などの特殊なソフトウェアを使用してスタックとしてのTIFFを開きます。注：画像を収集するために使用される収集ソフトウェアに応じて、ファイルは元の形式で保持することができ、ImageJのオープン。メタデータは、ファイルに保持されるので、これは好ましい。
2. スタックを分離する「画像」を選択した時点と、必要に応じて、Zプレーンに。注：20のZ平面のスタックが取られているが、神経芽細胞の多くは、<1μm厚の中期後期胚形成の間にあり、わずか数、Z平面が必要とされている。
3. 各時点で選択され、Z平面を再スタックし、別々のZ-スタック投影を行う。そして、時系列を作るために一緒に各時点の予測を積み重ねる。
4. 各チャンネルの明るさ/とやコントラストを調整します。
5. その後、関心、トリミング領域を選択します（し、必要に応じて回転）領域を。
6. 「マージチャンネル」機能を使用してマージされた画像を作成して、各チャンネルごとに異なる​​色を選択します。 RGBにマージされた画像を変換する。
7. より明確にイメージを視覚化するためのステップ6.3または6.4（「編集」下での使用「反転」機能）から各チャンネルのグレースケール画像を反転。
8. ベクトルベースの​​SOFTWの数字を作るために8ビットのTIFFなど、すべての最終的な画像を保存プログラムやQuickTimeファイルが映画を作るようです。
9. 画素サイズの測定は、（ 例えば、画像のスケールバーを含むために）必要な場合は、胚の大きさを測定するために、ImageJの、または他の画像処理ソフトウェアを使用する。注意：異なる目的を使用して収集した画像は、異なるピクセルサイズを持つことになります。

結果

この実験的なプロトコルは、C言語でどのように画像細胞分裂に説明します中期胚発生中の線虫胚 。特に、表皮の形態形成を容易にすることができる、どのように画像神経芽細胞に説明します。上皮形態形成は、上皮細胞形状の変化、遊走および接着の組み合わせに発生するだけでなく、根底にある神経芽細胞（ 図1B）から、化学的または機械的な合図に依存している。神経芽細胞は、それらの移行^10,14,25を調節する腹側表皮細胞の表面上の受容体によって受信されるガイダンスキューを分泌する。さらに、神経芽細胞は腹側表皮細胞²⁶の移行に貢献する機械的な力を提供することができる、高度に増殖性である。このプロトコルは、中期胚発生の間に神経芽細胞の細胞分裂を研究するために使用することができる。まず、神経芽細胞（HAM-1：GFP）を可視化するためのマーカーを共発現胚細胞質分裂（mCherry：PH）を受けているが生成されます。 HAM-1：GFPは、GFP（緑色蛍光タンパク質）は、核²⁷神経芽細胞に局在するタンパク質をタグ化発現、および中間胚...

ディスカッション

このプロトコルは、中期胚発生時の画像の細胞分裂への顕微鏡の様々な種類の使用が記載されている。特に、このプロトコルは、どのように表皮の形態形成を容易にすることができる神経芽細胞の分裂、細胞をイメージに強調しています。細胞間連絡は、後生動物の発生およびC.中の組織形成に重要である虫は、生体内で組織形成を研究するための優れたモデルです。うまく組織の相互作用を描いつのイベントは、上皮細胞の層で胚を覆う上皮の形態形成である。具体的には、腹側の筐体には、腹側表皮細胞は、胚の腹面を囲むように移行するプロセスであり、根底にある神経芽細胞に依存しています。神経芽細胞は、化学的または機械的な手がかりを提供し、神経芽細胞の位置が変更された場合、腹側エンクロージャが損なわれる。腹側筐体が正しく発生するの神経芽細胞の数（または極性）も、必須であってもよいそれが彼らの分裂を制御するメカニズムを理解することが重要である。このプロトコルは、Cを使用して生体組織内でどのように画像細胞分裂に説明します虫 2の蛍光プローブ（mCherry：PH形質膜およびHAM-1の概要を説明する：神経芽細胞核を標識す...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
寒天	バイオショップカナダ株式会社	#AGR001.1	C. elegans NGM、RNAiプレートの作製について
Agar	Bio Basic Inc.	#9002-18-0	バクテリアLB寒天プレートを作るために
Agarose	BioShop Canada Inc.	#AGA001.500
抗マウス Alexa Fluor 488 抗体	Life Technologies Corporation (Invitrogen)	#A11029
抗マウス抗GFP抗体	Roche Applied Science	#11814460001
抗ウサギ Alexa Fluor 568抗体	Life Technologies Corporation (Invitrogen)	#A11011
Ampicillin	BioShop Canada Inc.	#AMP201.5	粉末を4°Cで保管します。Cおよび-20°Cで溶解したアンピシリン。C
バクトペトン (ペプトンA)	バイオベーシック株式会社
CaCl2(塩化カルシウム)	BioShop Canada Inc.	#C302.1
コレステロール	バイオショップカナダ株式会社	#CHL380.25	タノール
DAPI に	Sigma-Aldrich	#D9542	核酸(DNA)の染色に使用
Glycerol	BioShop Canada Inc.	#GLY001.1
IPTG(イソプロピルチオβ;-ガラクトシド)	バイオベーシック(株)	#367-93-1	粉末と溶解したIPTGを-20°Cで保存します。C
KH2PO4(リン酸カリウム、一塩基性)	BioShop Canada Inc.	#PPM666.1
K2HPO4 (リン酸カリウム、二塩基性)	BioShop Canada Inc.	#PPD303.1
L4440 (給餌ベクトル)	Addgene	#1654	グリセロールストックとして-80°Cで保管してください。C
MgSO<サブ>4  (硫酸マグネシウム)	バイオショップカナダ株式会社	#MAG511.500
NaCl (塩化ナトリウム)	バイオベーシック	#7647-14-5
Na2HPO4 (リン酸ナトリウム、二塩基性)	バイオベーシック株式会社	#7558-79-4
正常ロバ血清 (NDS)	Wisent Bioproducts	#035-110
n-プロピル-3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸 (没食子酸プロピル)	Alfa Aesar	#A10877
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	#P8920	最適な結果を得るには、顕微鏡スライドを3回コーティングします
ストレプトマイシン	バイオショップカナダ株式会社	#STP101.50	粉末を4°Cで保存します。Cおよび-20°Cで溶解したストレプトマイシン。C
テトラサイクリン	バイオショップカナダ株式会社	#TET701.10	粉末を4°Cで保管します。Cおよび-20°Cで溶解したテトラサイクリン。C
Tween-20	バイオベーシック株式会社	CAS#9005-64-5
トリプトン	バイオショップカナダ株式会社	#TRP402.500
酵母エキス	バイオベーシック株式会社	#8013-01-2