造血前駆細胞の養子移入を使用して、パイエル板におけるマウス形質細胞様樹状細胞の開発を評価

サマリー

このプロトコルは、FACSを介した細胞の分離、流体力学的遺伝子導入、およびパイエル板の免疫サブセットのフロー分析を含む技術を使用して、一般的な樹状細胞前駆体からのパイエル板での形質細胞様樹状細胞の分化を評価するための実験手順について説明します。

要約

このプロトコルは、腸のパイエル板（PP）に形質細胞様樹状細胞（PDC）を生成するために、精製された造血前駆細胞の能力を分析する方法について詳しく説明します。一般的な樹状細胞前駆体（のCDP、LIN ^-のc-kit ^LO CD115 ⁺のFlt3 ^+）は 、FACSによりC57BL6マウスの骨髄から精製し、PPの大幅のpDCの人口が不足しているレシピエントマウスに移し、この場合、IFNAR ^{- / -}マウスは、転写レシピエントとして使用した。一部のマウスでは、樹状細胞増殖因子Flt3リガンド（Flt3Lを）の過剰発現は、Flt3Lをコードするプラスミドの流体力学的遺伝子導入（HGT）を用いて、従来のCDPの養子移入に施行された。のFlt3Lの過剰発現は、転送（または内因性）造血前駆細胞から発生するDC集団を拡張します。前駆転送後7〜10日で、養子移入前駆細胞から発生するのpDCは、上の受容細胞と区別された転送のCDPが⁺ CD45.1いると受信者がCD45.2 ⁺のあることからpDCを持つCD45マーカー発現に基づい。 PP中のpDC集団に寄与するとのFlt3Lに応答する転写のCDPの能力は、レシピエントマウスからのPPの単一細胞懸濁液のフローサイトメトリーにより評価した。この方法は、他の前駆細胞集団は、PPのpDCを生成することができるかどうかを試験するために使用することができる。さらに、このアプローチは、HGTを介して循環するサイトカインを操作することによって、推定発達因子および/または適切なノックダウン、ノックアウトまたは過剰発現に前駆細胞サブセットを転送することにより、PP中のpDC発達に影響を与えると予測される因子の役割を調べるために使用することができる。この方法はまた、PPとのpDCはPP内の他の免疫サブセットの頻度または機能にどのように影響するかの分析を可能にすることができる。 ^{- / -}マウス、深刻な枯渇PP pDCを野生型マウスと比較して、このようにallowiを示し、この方法のユニークな特徴はIFNARの使用で致死照射からの交絡の影響がない状態でのPPのpDCのNG再構成。

概要

ここでは、一般的な樹状細胞前駆体（のCDP）はパイエル板（PP）の中の形質細胞様樹状細胞（PDC）の人口を生じさせることができるかどうかを評価するためのプロトコルを示しています。この方法を使用しての全体的な目標は、パイエル板（PPたpDC）中のpDCの発生調節を評価することであった。これが重要である理由は、PPのpDCは骨髄、血液および脾臓を含む他の組織に見出さのpDCは異なるので、それはPPのpDCに及び他のpDCの集団が発達および/または機能的に関連しているかどうかは不明であるということである。具体的には、pDCは広く、私はToll様受容体7と迅速なIFNの分泌^1-3による9（TLR-7/9）の刺激に応答して、造血系内（IFN）生産インターフェロンプリンシパルタイプであることで知られています。しかし、PPのpDCは、私がTLRアゴニスト刺激^4,5に応じて型IFNの産生が不足している。また、PPたpDCはまた、骨髄および脾臓で発見さたpDCと異なる型からの信号を必要とする私は（IFN）受容体（IFNAR1）をインターフェロンまたはIFNは彼らの開発および/ ​​または蓄積⁵用の分子STAT1シグナル伝達。これらのデータは、個別の調節機構がPPの他の器官のpDCに対するpDCに（ 例えば 、骨髄、脾臓^）5を制御する可能性を示唆している。

この方法の開発につながった理論的根拠は、樹状細胞（DC）生物学の理解における最近の進歩に基づいていた。ほとんどは、全てではない、DCサブセットがFMS様チロシンキナーゼ3受容体（の^{Flt3）6-10を}発現する造血前駆細胞から派生したが、DCの開発は古典的な骨髄およびリンパ経路に限定されるものではない。たとえば、のFlt3 ⁺は骨髄系共通前駆細胞（CMPの、LIN ^- IL-7R ^- SCA-1 ^-のc-kit ⁺ CD34 ^+FcγRの^{LO / - ）}のCDP（LIN ^-のc-kit ^LO CD115 ⁺のFlt3 ^+）を生じさせる、whicHは、さらにPDCと従来のDC（の^CDC）9,10に分化する。これとは対照的に、のFlt3 ⁺リンパ球系共通前駆細胞（CLPの、LIN ^- IL-7R ⁺ SCA-1 ^LOのc-Kit ^LO）は pDCに¹¹に、主に開発しています。したがって、従来の研究では、典型的な分析は、骨髄、脾臓および/または血液のpDCサブセットに制限されているがpDCには、のFlt3Lの調節下に少なくとも2つの異なる造血前駆細胞集団から生じる示す。このように、PPのpDCを生成前駆細胞集団（S）は、調査を必要とした。 PPのpDCの起源を理解することは、彼らが他のpDC集団と共通の発生経路を共有しているかどうかに光を当てる、または、PPでの生成中に別個の機構を利用します。

ここに記載されたアプローチのユニークな利点は、造血前駆細胞の養子移入の受容体としてのPPのpDCの深刻な不足を示しているマウスを使用することである。遺伝子を持つマウスまたはSTAT1（ のStat1 ^{- / - ）}をコードする遺伝子IFNAR1（ ^{- / -}マウスIFNAR）中チック欠失はPPのpDC ⁵の著しい減少を明らかにした。したがって、これらの株は、養子免疫伝達試験は、例えば、致死的照射のような強力な細胞アブレーションレジームの非存在下で行うことができるように、PP用のpDCが低減された環境を提供する。ここで紹介する方法のさらなる強さのFlt3Lの上昇循環量を刺激する流体力学的な遺伝子導入（HGT）を使用することである。これは、組換えタンパク質の注入に対して、 生体内でのFlt3Lを誘導するためのコスト効果的なアプローチを提供します。私たちの研究室にあるものを含む多数の研究は、実験条件^5,12,13様々なサイトカイン量を誘導するためにHGTを採用しています。

DCの労働力と正確な免疫機能の分割は、免疫学の主要な関心事である。特に、pDCは、経口寛容および全身抗ウイルスの重要なメディエーターである応答は、まだ彼らはまた、自己免疫および癌^14〜17の発展と持続性に貢献すると思われる。ここに記載されているプロトコルは、PPのpDCを規制発達のメカニズムをより十分に検討できるようになります。また、このアプローチは、研究がPP pDCの機能を評価することを可能にし、PPの内の他の集団の免疫調節および機能の理解に拡張することができる。

プロトコル

制度上の承認は、マウスを含む、本明細書に記載されているすべての実験操作のために、事前に取得する必要があります。これらは、骨髄前駆細胞の単離のためのC57BL6マウスの使用を含む、IFNAR ^{- / -}養子造血前駆細胞の転写およびインビボでのサイトカインの過剰発現のためHGTの使用のためのレシピエントとしてマウス。適切な住宅や動物のケアにも研究者や機関が提供する必要があります。さらに、制度の承認は、流体力学的な遺伝子導入（ すなわち 、組換えDNAの承認）に使用されるプラスミドが必要な場合があります。ここに記載された研究は、UT MDアンダーソンがんセンターの施設内動物管理使用委員会によって承認された。

1。流体力学的遺伝子導入（HGT）

このステップは、生体 ⁵ の DC拡大のためのFlt3L循環誘導するためのCDPの養子移入に2日前までに行う必要があります。 PRepare少なくとも5レシピエントマウス/グループ。

1. 効率的なHGTを達成するために、レシピエントIFNARの血管^{- / -}マウス（CD45.2 ^+）を 5〜10分間の加熱ランプにマウスを曝露することによって拡張されるべきである。
2. 拘束装置内にマウスを置き、70％エタノールで尾を消毒する。
3. 27 Gの針を用いて尾静脈に無菌PBS 2mlにコードするプラスミドのFlt3L5μgのを注入する。示されるように、対照コホートのために、尾静脈を介して、空のベクター（PORF）5μgのを注入する。
4. 尾静脈注射の有害な効果がないことを確認するために15〜30分間マウスを監視します。 2日間の住宅施設にマウスを返します。

2。マウス骨髄から造血前駆細胞の分離

このステップは、2日HGTから行ってください。受信者IFNARへの養子移入のための骨髄前駆細胞の供給源として、コンジェニックCD45.1 ⁺マウスを使用^{- /}- 動物（CD45.2 ^+）。このプロトコルでは、コンジェニック系統は、ドナーとレシピエント由来のDCを区別するために、ならびにによるMHCミスマッチに対する免疫媒介性枯渇を回避するために必要とされる。約10〜20マウスは、転移実験のために造血前駆細胞（10 ⁵細胞/レシピエントマウス）の十分な数を提供するために必要とされるであろう。

1. CO ₂窒息と頸椎脱臼により10ジェニックのCD45.1 ⁺マウスを安楽死させる。
2. 解剖トレイ上の各枝肉を置き、70％エタノールで腹部と脚を殺菌。
3. 半ば腹部の切開を行い、脚の長さに沿って皮膚をカット、各脚に腹部から皮膚を通ってカット。
4. 静かにそれぞれの脚から皮膚を除去し、切断され、鋭利なハサミを使用して股関節の枝肉から足を外します。
5. 慎重に鋭い刃を使用して、それぞれの脚の大腿骨と脛骨から筋肉を取り外す。
6. 削除する両方の鋭いメスで大腿骨および脛骨の端部は、（10％の熱不活性化ウシ胎児血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1 mMピルビン酸ナトリウムおよび50μMのβ-メルカプトエタノールをRMPI）完全RPMIを含有する培養皿に骨を配置する。
7. 27 Gの針に接続された完全RPMIの1ミリリットルを含む注射器を準備します。
8. 大腿骨や脛骨の一端に27 G針を挿入します。そっと骨に完全RPMIを注入することにより、大腿骨や脛骨から骨髄をフラッシュします。その骨髄細胞が骨から除去されていることを確認し、これは視覚的に濁っ追放媒体を検出することによって達成することができる。
9. 徹底的に骨髄細胞を除去するために、各大腿骨と脛骨3回洗い流す繰り返します。
10. 静かに培養皿の上下3-5Xを、細胞をピペッティングすることによって単一細胞懸濁液を準備します。
11. 新しいculturに滲出細胞を配置する、40μMの細胞ストレーナーを通して骨髄細胞を渡すことによって、破片を除去Eディッシュ。無菌注射器プランジャの端部と穏やかな圧力によってストレーナに表示されるすべての細胞塊を混乱させる。
12. 溶解製造者の指示に従って商業RBC溶解緩衝液で総骨髄細胞懸濁液中に存在する赤血球（RBC）。 2ミリリットルRBC溶解buffer/4-6×10 ^7個の細胞（1マウスから、一般的に細胞）と室温で5分間のインキュベーション時間を使用してください。
13. （1×PBS + 2 mMのEDTA +1％FBS）、ペレット化細胞を遠心分離により穏やかに洗浄液を吸引する10ミリリットルFACS緩衝液に再懸濁し、穏やかに培地を吸引し、500×gで4分間の遠心分離によって細胞をペレット化することにより骨髄細胞を洗浄バッファ。
14. ステップ2.13で説明したように2回の洗浄の合計のため、洗浄を繰り返します。

3。蛍光活性化細胞のCDPを隔離するために選別（FACS）

このステップは、初期の負の選択手順にMidiMACS電池セパレータとMacのLD列へのアクセスを必要とする蛍光標識抗体で染色した後、多色の前駆サブセットを浄化するために、少なくとも3レーザーでだけでなく、FACS装置。

1. ステップ2.14における2回目の洗浄の後、骨髄細胞を数える。ステップ2.13に記載のように遠心分離により細胞をペレット化し、FACS緩衝液30μlあたり4×10 ⁷個の細胞の最終濃度を達成するために、FACS緩衝液に再懸濁する。
2. FACSのための細胞を調製するために、系列陰性細胞を最初に磁気ビーズカラムクロマトグラフィーを用いて骨髄液から系統陽性細胞を除去するネガティブ選択技術によって濃縮される。 CD3、CD19、CD11cの、のCD11bおよびTER-119 ABS：負の選択手順については、造血系統マーカーを認識し、以下の市販のラット抗マウス抗体（ABS）の各1μgのを追加します。 Abは、FACS緩衝液中の30μlの細胞懸濁液に2μlの/抗体の量で添加されるべきである。
3. 30 4℃で細胞懸濁液をインキュベート分。ステップ2.13で説明したようにインキュベートした後、FACS緩衝液10mlで細胞を2回洗浄します。
4. FACS緩衝液中4×10 ⁷ cells/40200μlの最終濃度を達成するために細胞を再懸濁。細胞懸濁液の各40μLあたりのヤギ抗ラットIgGを磁気マイクロビーズの20を添加する。穏やかに混合し、30分間、4℃でインキュベートする。ステップ2.13で説明したようにFACS緩衝液10mlで細胞を洗浄。
5. FACS緩衝液500μl中に10 ⁸の骨髄細胞まで再懸濁する。
6. 製造者の指示に従ってMidiMACS電池セパレータへのMACS LD列をロードし、2ミリリットルのFACS緩衝液でカラムを前すすぎ。
7. FACS緩衝液2.5mlに5×10 ⁸細胞まで装填カラムに骨髄細胞懸濁液を適用する。確保コレクションチューブ（15mlコニカルチューブ）をカラムの下に配置されている。コラムFACS緩衝/洗浄の2ミリリットルで3回洗浄し、について濃縮される列を通過した細胞を回収系統陰性細胞。カラムから溶出した物質で細胞を（洗浄スルー）カウントします。
8. FACSにより造血前駆細胞サブセットの正の選択を実行するには、次の蛍光共役ABSで染色細胞：IL-7R（パシフィックブルー）のFlt3（PE）、SCA-1（PE.Cy7）、CD115（APC）、C-KIT （APC.Cy7）ABSに加え、CD3、CD19、CD11cの、のCD11b、F4/80及びTER119に対して向け系統マーカーのAbの混合物（すべてPerCP抗体のCy5.5で標識された）。総容量100μlで各抗体の0.5〜1μlを使用する。 20〜30分、4℃で細胞懸濁液をインキュベートする。
9. FACS緩衝液中に再懸濁ステップ2.13に示されるように、×10 ⁷細胞/ ml 2-3の濃度で細胞を洗浄する。細胞塊を除去するために、35μMセルストレーナーキャップチューブを介して細胞をフィルタリングします。この最後のステップは、FACS装置を詰まら避けることが重要です。
10. FACSステージにFACSチューブに細胞懸濁液を置き、CDPが（LIN ^-のc-kit ^LO CD115 ⁺のFlt3 ^+）を並べ替えるには指示されたマーカープロファイルに基づい。完全RPMIの5ミリリットルを含む15ミリリットルチューブに精製した細胞を収集する。
11. FACSの実行終了時に選別された細胞の絶対数を記録します。養子移入実験のための無菌PBSにステップ2.13再懸濁に示されるように、遠心分離により細胞をペレット化。

4。 CDPを養子移入

このステップは、典型的には、レシピエントマウスが収容されている動物施設で行われる。 FACS機の位置に応じて、前の養子移入に動物施設に精製された前駆細胞集団の輸送を含み得る。前駆細胞の懸濁液は、無菌に維持し、氷上で輸送されるべきである。

1. 100μlの滅菌PBSの総容量で10 ^5、精製の​​CDPを希釈することにより、注射のための細胞懸濁液を準備します。 27のG針に取り付けられたシリンジ内の細胞懸濁液を置きます。
2. 受信者を公開IFNAR ^{- / -} 尾静脈を介して効率的な注入を達成するために5〜10分間の加熱ランプマウス（CD45.2 ^+）。
3. 拘束装置内にマウスを置き、70％エタノールで尾を消毒する。
4. 27 Gの針を用いて尾静脈に100μlのPBS中の10 ⁵ FACS精製の​​CDPを注入する。
5. 尾静脈注射の有害な効果がないことを確認するために15〜30分間マウスを監視します。住宅施設にマウスを返します。

5。 pDCの量のPPと測定物の単離

1. 養子移入次の7〜10日で、レシピエントマウスを安楽死させる。優しく切開により、マウスを開き、腸を公開します。
2. 腸全体を削除し、PBSに浸したペーパータオルの上に置きます。細かい鉗子やハサミを使用して、小腸の壁に沿って表示されているすべてのプロジェクト参加を収集します。 C57BL6およびIFNAR ^{- / -}マウスは、一般的に見られる孤立リンパ濾胞と異なる5月10日、PP /マウスを持っている小腸¹⁸に沿って。プロジェクト参加は非常に慎重にすべてのPPが特定され、解剖されていることを確認、単一のマウスの中に、多くの場合、構造的に異なることに注意してください。
3. PBSを含むペトリ皿にのPPを置き、糞を削除するために鉗子を使用しています。プロジェクト参加の清掃に二回、この手順を繰り返します。
4. 37℃で1時間激しく撹拌しながら50ミリリットルのフラスコ中の10ミリリットル1Xハンクス液（HBSS）中の1 mg / mlのコラゲナーゼIVとダイジェストのPP
5. 無菌注射器プランジャとストレーナーを通して40μmのセルストレーナーと力セルの上の区画に消化されたPPを配置します。を15mlコニカルチューブ中のPPの細胞懸濁液を収集する。
6. 37％パーコール液（RPMI培地中で37％パーコール）の6ミリリットルで5分間再懸濁用の500×gで遠心分離することにより、歪PP細胞をペレット化。穏やかパーコール段階勾配を形成するために、細胞懸濁液の下に（RPMI培地中で、70％パーコール）70％パーコール溶液6mlを置く。
7. 20分Aの遠心細胞遠心機とT 800 XGが解消 。単核細胞を、70分の37％の界面に移動します。遠心分離後、単核細胞集団は、界面領域での慎重なピペット操作によって収集されるべきである。ペレットを遠心分離によって細胞を回収し、完全RPMI /洗浄、50mlの二回洗浄する。大容量は、完全なパーコール除去を確実にするために使用される。
8. CD45.1（APC.Cy7）、CD45.2（PE：養子移入前駆細胞（CD45.1 ^+）またはレシピエントマウス（CD45.2 ^+）に由来するマウスのpDCを検出するために、以下の抗体を用いて収集されたPP細胞を染色。Cy7で）のCD11c（パシフィックブルー）のCD11b（PerCP抗体のCy5.5）、B220（APC）、シグレック-H（PE）およびPDCA-1（FITC）ABS。ステップ3.9および3.10に示すようにPP細胞のフローサイトメトリー解析を行う。 B220 ⁺シグレックH ⁺ PDCA-1 ⁺表現^-そののCD11c ⁺のCD11bでのpDCを識別します。 ％のpDC xに：絶対pDCの番号は以下の式によって決定することができるタルPP細胞数= PPのpDC。

結果

我々の結果は、プロトコル2および3に詳述されるように、マウス骨髄細胞からのCDPの単離（ 図1）のためのゲート戦略を示している。 CDPは、全骨髄細胞の約0.1％を含み、およそ4-6×10 ⁴のCDPは、一匹のマウスから単離することができる。養子移入すると、CDPははPDCとCDCは¹⁰に分化する。

のCDPのFACS精製の ​​ための図1のゲーティング戦略は。骨髄細胞は、C57BL6マウスから採取した。リネージュ陽性細胞は、MACSのマイクロビーズ媒介選択を用いて系統マーカー（CD3、CD19、CD11bの、CD11cの...

ディスカッション

（ ^{- / -}マウスなどIFNAR）について説明養子転写技術は、ここにPPのpDCが不足しているレシピエントマウスにおけるPPのpDCの人口のCDPの寄与を評価した。将来の実験では、それは、PPのpDCはのFlt3 ⁺のCLPから派生するかどうか、特に、PPたpDCを生成する際に、他の前駆細胞サブセットの可能性を評価することが重要になります。この質問は、PPのpDCがPP積算⁵ IFNAR-STAT1シグナルに一意に敏感であり、なぜそれが不明なままであることから重要であり、PPのpDCは、他の器官におけるpDCに同様の発達手がかりに従ってください。

理論的には、この方法はまた、全ての器官におけるpDCの集団を欠くマウスにおいて実行されてもよい。例えば、転写因子E2-2、pDCの「マスター調節因子」（ すなわちTCF4 ^{- / -}マウス）の欠乏によるマウスは、印象的なのpDC枯渇^19を示しています。しかし、TCF...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C57BL/6J	ジャックス	664
B6.SJL	JAX	2014
RPMI	Invitrogen	11875-093
15 ml コニカルチューブ	BD Biosciences 352095
50 ml コニカルチューブ	BD Biosciences	352070
滅菌外科用ピンセット
滅菌済み小型ペアハサミ
滅菌済み大型ペアハサミ
40 μm細胞ストレーナーBD	Biosciences	352340
35 μm細胞ストレーナーキャップチューブ	BD Biosciences	352235
RBC溶解バッファー	Sigma	R7757
FACSバッファー			PBS、2 mM EDTA、1% FCS、フィルター滅菌
Percoll	GE Healthcare	17089102
10x HBSS	Sigma	H4641
Collagenase IV	Worthington	LS004188
ヤギ抗ラットIgGマイクロビーズ	Milteyni Biotec	130-048-501
LDカラム	Milteyni Biotec	130-042-901
ラット抗D3	BDバイオサイエンス	555273
ラット抗CD19	BDバイオサイエンス553783
ラット抗CD11b	BDバイオサイエンス553308
ラット抗CD11c	BDバイオサイエンス
ラット 抗Ter119	BD Biosciences	553671
抗CD3 (PerCP)	eBiosciences	45-0031
抗CD19 (PerCP)	eBiosciences	45-0193
抗CD11b (PerCP)	eBiosciences	45-0112
抗CD11c (PerCP)	eBiosciences	45-0114
抗F4/80 (PerCP)	eBiosciences	45-4801
抗Ter119 (PerCP)	eBiosciences	45-5921
抗SCA-1 (PE.Cy7)	eBiosciences	25-5981
抗CD115 (APC)	eBiosciences	17-1152
Anti-c-kit (APC.Cy7)	eBiosciences	47-1171
抗IL-7R (パシフィックブルー)	eBiosciences	48-1271
Anti-Flt3 (PE)	eBiosciences	12-1351
Anti-CD45.1 (APC.Cy7)	BDバイオサイエンス	560579
抗CD45.2(PE.Cy7)	Biolegend	109830
抗CD11c (Pacific Blue)	eBiosciences	48-0114
Anti-B220 (APC)	eBiosciences	25-0452
Anti-Siglec-H (PE)	eBiosciences	12-0333
Anti-PDCA-1 (FITC)	eBiosciences	Nov-72
Cell Sorter	BD Biosciences		e.g. BDフォルテッサ
ヒートランプ
マウス拘束
具1mlシリンジ	ベクトンディキンソン	309602
27½G針(滅菌)	ベクトン・ディキンソン	305109