4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する

Summary

タイムラプス共焦点イメージングは​​、胚発生を特徴づけるための有用な強力な技術である。ここでは、方法論を記述し、野生型では頭蓋顔面形態形成を特徴づけるとともに、PDGFRA、Smad5を、そしてSMO変異胚。

Abstract

タイムラプスイメージングは​​、形態形成の過程を直接観察を可能にした技術、あるいは形状の生成である。原因遺伝子操作への光学的透明度と従順に、ゼブラフィッシュ胚は生きている胚における形態形成の経時的分析を行うことで人気のモデル生物となっています。ライブゼブラフィッシュ胚の共焦点イメージングは​​、対象となる組織が持続的な導入遺伝子または注入された色素、蛍光マーカーで標識されている必要があります。プロセスは、胚が健全な発展が正常に進行するように麻酔し、所定の位置に保持されることを要求する。画像化のためのパラメータは、三次元成長を考慮して設定する必要があり、開発の迅速なスナップショットを取得している間に個々の細胞の解決の要求のバランスを取る。我々の結果は、蛍光標識されたゼブラフィッシュ胚のインビボイメージングにおける長期を実行し、多様な組織における行動を検出するための能力を実証頭蓋顔面異常を引き起こす頭蓋神経堤。麻酔および取り付けに起因する発達の遅れは最小限であり、胚はプロセスによって無傷である。タイムラプス画像化された胚を液体培地に戻され、その後、画像化や開発の後のポイントで固定することができる。トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の増加量および十分に特徴付けられた運命のマッピングや移植技術を用いて、任意の所望の組織を画像化することは可能です。このように、in vivoイメージングの経時は、変異型とマイクロインジェクションされた胚の分析を含めたゼブラフィッシュ遺伝的方法で強力に兼ね備えています。

Introduction

頭蓋顔面形態形成は、複数の細胞型の協調的相互作用を必要とする複雑な多段階プロセスである。頭蓋顔面骨格の大部分は神経堤細胞に由来し、その多くは、咽頭のアーチ¹と呼ばれる一過性の構造に背側神経管から移行する必要があります。多くの組織と同様に、頭蓋顔面骨格の形態形成は、特定の発生時点での胚の静止画像によって理解することができるよりも複雑である。それは時間のかかる実行することであるが、in vivoでのタイムラプス顕微鏡は、発生中の胚の細胞や組織での連続に説明します。タイムラプスシリーズの各画像は他の人に文脈を貸すと、現象が発生する理由推測ではなく、その時点で何が起きているか推測に向けて研究者の動きを支援します。

in vivoイメージングではこのように実験的なアプローチのための強力な説明的なツールです形態形成を誘導する経路を分解。ゼブラフィッシュゼブラフィッシュは、脊椎動物の胚発生の人気遺伝モデルであり、形態形成のin vivoイメージングのために特に適しています。近代的な、遺伝子導入およびゲノム修飾のための便利な方法が急速にゼブラフィッシュ研究者に利用可能なツールの数を進めています。これらのツールは、遺伝子操作し、顕微鏡検査のため、既に堅牢な方法を強化します。ほぼすべての所望の遺伝的文脈で、ほぼすべての組織のin vivoイメージングはファンタジーより現実に近い。

咽頭のアーチの形態形成運動は、神経堤と隣接する上皮、外胚葉と内胚葉の両方の間の相互作用のシグナリングによって案内される。頭蓋顔面骨格要素の形態形成を推進するために必要である上皮で表現多数のシグナル伝達分子があります。これらのシグナル伝達分子の中では、ソニック·ザ·ヘッジホッグ（Shhは）は非常に重要であるFまたは頭蓋顔面の開発^2-8。 SHHは、経口外胚葉および咽頭内胚葉^2,6,9,10の両方で表される。内胚葉におけるShhの発現は、アーチ^10、アーチ¹⁰内神経堤のパターニング、および頭蓋顔面骨格の¹¹の成長の形態形成の動きを規制している。

BMPシグナル伝達は、頭蓋顔面の開発¹²のためにも極めて重要であると咽頭のアーチの形態形成を変更することがあります。 BMPシグナル伝達は、咽頭のアーチ^13,14内堤の背/腹パターン形成を調節する。ゼブラフィッシュにおけるSmad5をの破壊は深刻な口蓋欠陥や正中線¹⁵に適切に融合するメッケル軟骨の障害が発生します。さらに、変異体はまた、正中線¹⁵で融合咽頭弓の要素^番目の 2 ^{番目、3番目} 、時には4で、腹側軟骨要素の減少との融合を表示。これらの融合が強くBMPシグナル伝達は、これらの咽頭要素の形態形成を指示することを示唆している。

PDGFシグナル伝達は、頭蓋顔面の開発のために必要であるが、咽頭弓の形態形成における未知の役割を持っています。マウスやゼブラフィッシュPDGFRA変異体の両方が深いmidfacial分裂文形成^16〜18を持っている。少なくともゼブラフィッシュでこのmidfacial分裂文形成は、適切な神経堤細胞の遊走¹⁶の故障が原因です。神経堤細胞は、咽頭のアーチを入力した後PDGFRAを発現し続ける。さらに、PDGFリガンドは、顔の上皮で発現され、咽頭のアーチ^16,19,20内で、このようにPDGFシグナル伝達はまた移行後に咽頭弓の形態形成における役割を果たしている可能性があります。しかし、PDGFRA変異体におけるアーチが行われていない咽頭の形態形成の解析を行う。

ここでは、pharyngulのインビボ共焦点顕微鏡法で証明するステージトランスジェニックゼブラフィッシュとは、この期間内に咽頭のアーチの形態形成を説明します。我々はさらに、BMP、PDGF及びShhシグナル伝達経路を破壊する変異によって影響される組織の挙動を示す。

Protocol

1。畜産および変異対立

1. ^21が説明されているようにゼブラフィッシュを上げ、繁殖。
2. 本研究で用いたゼブラフィッシュ突然変異対立遺伝子は^{、16 b1059} Smad5を^{B1100 22、}及びSMOの^{b577 23} PDGFRAた。これらのゼブラフィッシュの株のソースはZIRCが含まれています。

2。ソリューションと実装の準備

注：全ての溶液及び器具は、事前に行われ、将来の使用のために保存することができる。

1. 以前に^21を説明したように胚のメディア（EM）を作る。
2. 4グラム/ LのMS-222（トリカイン）を作る。 450ミリリットルの無菌の水に4gのリン酸二ナトリウムせ（Na ₂ HPO _4）に溶解する。この溶液に2グラムのMS-222を追加します。 7.0〜7.2以内のpHを調整する。 500ミリリットルの全容量に滅菌水を追加します。
3. オプション：4グラム/ Lのクローブ油を作る。 50mlコニカルチューブに0.2グラムの純粋な丁子油を秤量する。 50ミリリットルの全容量にEMを追加します。 4℃で保存する
4. 3パーセントをするmethylcelluloSE。沸騰さのEM + 0.1のHEPESの50ミリリットルを持参してください。暑さから削除します。溶液が均質になるまで1.5グラムのメチルセルロースで撹拌する。 4℃で保存する
5. 0.2％アガロースを作る。 50ミリリットルのEMに0.1グラムアガロースを追加します。電子レンジやホットプレート上で沸騰にEMを持参し、アガロースが溶解していることを確認してください。 4℃のマイクロチューブや店舗での500μlのボリュームに分割量注：必要に応じてボリュームを調整することができる。
6. キャピラリー火かき棒をする。 0.9ミリメートルのキャピ​​ラリ管内のスーパー接着剤の滴を配置します。ラインの約3〜4 mmは、管の端部を越えて延びるようにキャピラリーチューブの内側に6ポンドテストモノフィラメント釣り糸4-5センチの長さを挿入します。
7. 試料ごとに2つの橋かけカバースリップをする。スーパーグルー22 X 22から1のカバーガラス24×60から1、カバーガラスの各末端に真ん中の自由を残す。古い日未満の胚のためのシングル（エンドにつき1小さなカバーガラス）を作る、一から四Dは胚について（終了ごとに互いの上に2つの小さなカバーガラス）倍に胚5日またはそれ以上の年齢の古いAYS、またはトリプル（エンドにつき互いの上に3つの小さなカバーガラス）。
8. 高真空グリースで10ミリリットルの注射器を埋める。注：真空グリースは、長期間にわたって標本の脱水を防止するためのシール材として機能し、より揮発性のシーラントに比べて毒性の低い可能性を有する。

3。共焦点顕微鏡用の取り付けゼブラフィッシュ胚（図1を参照してください）

1. 麻酔メディアを準備します。完全に液体になるまで20秒間隔で電子レンジで0.2％アガロースの一定量を溶かす。 0.2％アガロースの195μLに0.2％アガロースまたは4グラム/ Lのチョウジ油の5μlを192μLに、MS-222の8μLを混ぜる。 42℃の加熱ブロックに維持する。注意：MS-222への長時間露光が胚ゼブラフィッシュ²⁴で行いチョウジ油よりも強い発達の遅れの原因となる。
2. 必要に応じて手動で孵化していないトランスジェニック胚は、直前に分析するために分析されるようにdechorionate。鉗子を用いて、ゆっくりテ胚が解放されるまで営業絨毛膜AR。
3. ゼブラフィッシュ胚を麻酔。胚培地24 mlに、MS-222の4グラム/ Lの株式の1ミリリットルを追加します。代わりに、魚の水²⁴の24ミリリットルに4グラム/ Lのチョウジ油の390μlを加える。注意：クローブ油が作用して、ゆっくりとそうタイムラプス顕微鏡検査前に、少なくとも15〜20分をこの手順を実行します。
4. 上向きの橋かけカバースリップの中心領域の周りに真空グリースのビードを配置します。ゆっくりと、そして橋やカバーガラスのエッジの内側に隣接しており、滑らかで連続的なビーズを作り、注射器の外に真空グリースを押してください。
5. 木製アプリケーターを用いて架橋したカバースリップの中央に4％のメチルセルロースの輪を広げた。
6. 画像化される胚を転送します。胚を麻酔されたときにガラスピペットにそれを作成する。胚がピペット内の液体の底に沈むことができるように垂直にピペットを保持する。アガロース溶液にピペットを移動し、胚がドロップすることができますアガロースに。液体を排出しないでください。
7. 試料を配置します。ピペットにいくつかのアガロース溶液および胚を描く。メチルセルロースの上にアガロース溶液の液滴で胚を追放。メチルセルロース上に下向きの胚を押して画像化のために必要に応じて胚を配向させる毛管ポーカーを使用してください。
8. 試料を密閉する。
   1. 下向きにし、取り付けられた1の上に1橋かけカバーガラスを配置します。ブリッジは、両方のカバーグラスに直接接触し、アガロースドロップシールを作るまでに挟まれたカバーガラスの両側に均等に力を加える。胚が適切に配向していることを確認してください。
   2. 真空グリースビーズに亀裂や隙間を滑らかにガラスに沿って木製のアプリケーターをこする。エッジから余分なグリースを拭き取ってください。

4。トランスジェニックゼブラフィッシュ胚のタイムラプス共焦点イメージング

（このプロトコルは、ツァイスLSM 710共焦点顕微鏡私たちのために最適化されていますZENイメージングソフトウェアをING、他のシステムで使用するために改変することができる。）

1. 機器をアクティブにします。共焦点顕微鏡と外部レーザー装置の電源をオンにします。共焦点顕微鏡に接続されたコンピュータの電源を入れます。オープンな共焦点イメージングソフトウェアおよび画像取得コントロールをアクティブにする "スタートシステム」を選択します。
2. 加熱されたステージを準備します。共焦点顕微鏡のステージングプラットフォームを下げ、所定の位置からの対物レンズを移動させる。電子加熱段階で​​デフォルトのステージを交換してください。加熱された段階のためのコントローラの電源をオンにし、29.5℃で温度を設定
3. 視野内の試験片を置きます。ステージ上に搭載試料を配置します。所定の位置に20倍の対物レンズを移動させ、ステージングプラットフォームを上げる。可視光発光体を活性化させ、接眼レンズに目を通す。視野内胚の頭を中央に配置します。
4. 実験の設定を定義します。
   1. 選択することにより、蛍光チャネルを活性化する検出されるべき蛍光波長チャネルごとにカラールックアップテーブル（LUT）を選択する。必要に応じて、必要なレーザ（RFP用など 561 nm）をオンにするソフトウェアで手動制御を使用しています。各蛍光チャネルに対して、600〜700の間に10.0レーザ強度​​と光電子増倍管電圧（HV又はゲイン）を設定する。 4に平均化し、16ビットのビット深度を設定します。
   2. zスタックおよび時系列のモジュールをアクティブにします。 5μm以下のZ分解能のためのピンホールを設定し、提案し、最適な距離に、Z間隔を設定します。
      注意：一般的に、5〜Zの解像度は、個々の細胞の解決中に各zスタック画像は、特定の時点で胚の「スナップショット」のために十分迅速に収集することができます。平均値を下げると、画像あたりの時間の量を減少させる。
   3. 画像間の所望の時間間隔（通常10〜20分）、実験の全体​​の長さを規定する。
5. 位置設定情報。
   1. ライブモードでカメラの電源を入れます。フォーカスを調整し、必要に応じて蛍光を見るためにレーザー強度を増加させる。必要に応じて、より広い視野のために0.6にデジタルズームを設定します。
   2. 関心のあるすべての構造が表示され、前方に伸長背側とのための視野に余裕があるように、ステージの位置を決めます。蛍光の上限値と下限値の胚を通じて焦点を当てています。最初と最後のZ-スタックスライス位置、これらの制限を超えて少なくとも100μm以上に設定してください。
6. 蛍光強度を最適化します。
   1. インジケータを範囲に表示LUTを設定します。蛍光構造が今白く見えるべきであり、視野の残りの部分は、（無検出）青または黒である必要があります。
   2. ちょうど飽和場所の下のレベルにHV /ゲインを上げる（赤）の画素が表示されます。必要に応じて、バックグラウンドの大部分が（青色）が検出されないようにオフセットを調整。両方より小さいピンホール径の増加レーザー強度をDEFイメージを改善します。注initionが、レーザー強度は、生体組織を維持するために低く保たなければならない。 HV /ゲインとピンホール径を増加させた（<5μm）を、一般的に増加し、レーザ強度​​よりも好ましい。
   3. 4にセットを平均化、タイムリーに画像を収集するのに十分な幅ピンホール径を保管してください。 Z-間隔は常にピンホール径の推奨最適な距離に設定する必要があります。異なる設定で、短いスキャン（平均= 1）を実行し、所望の解像度を実現する最小のレーザー強度を使用しています。
7. 所望の時間のための実験を​​実施します。その後、加熱された段階から胚を削除して、徐々にカバースリップを分離する。 30ミリメートルペトリ皿に、EMでのカバーガラスや胚を沈める。ガラスピペットを使用すると、静かにカバーガラスの外胚を洗浄し、ペトリ皿からカバースリップを削除します。開発を継続するために28.5℃のインキュベーターに胚を置きます。
8. 成長を比較してください。実験の最後に、個々のZsがかかる同様に、実験の開始時に試料に上演されましたが、28.5℃のインキュベーター中で、EMで育ったアガロースマウント兄弟胚のタックイメージ。
9. 必要に応じて、咽頭のアーチを測定します。測定値は、いくつかの共焦点ソフトウェアスイートで行うことができる。ここに見出さ測定は、個々のフレームの。LSMファイルをインポートし、Z-投影することによってFiji25を用いて行った。

Results

吻側方向（ 動画1）に移動しながら、野生型胚において、神経堤人口以下、咽頭のアーチは、前方/後方背側/腹軸に沿って細長く。 30時間後に受精（HPF）において、第咽頭弓の前方/後方の長さは、1.8〜1.9倍の背側/腹側の高さの間である。背側/腹側伸びが速く36.5 HPFまで、前方/後方の拡張よりも、着実に進む。ここから、背側/腹側の高さの高原の周りに104程度48 HPFを通して。前方/後方の拡張子は、全体的な前方/後方の長さは48 HPFで1.95倍の背側/腹側の高さにHPF 36.5で1.5倍の背側/腹側の高さの下から増加に伴って、48 HPFまで続く。

その前端で、第咽頭弓が上顎（背側）と下顎口腔外胚葉で区切って（腹側）ドメインを形成している。最初の咽頭弓の上顎ドメインはfを測定し、口腔外胚葉の後方頂点に、その遠位端をROMをこれは、30〜48 HPF間4.6ミクロン/時（R ² = 0.9374）で、線形回帰で近似率で成長し、48 HPF（ 動画1）で約104ミクロンの長さである。 ...

Discussion

タイムラプス共焦点顕微鏡は、開発の分析のための強力なツールです。ここでは、神経堤細胞を標識するトランスジェニックを用いて、重要なシグナル伝達経路のための変異体であるゼブラフィッシュにおける咽頭弓の形態形成を研究する方法の有用性を示す。組織レベルに加え分析では、時間経過の分析はまた、細胞スケール²⁸で解析に適用可能である。多くの広く使用されているゼブラフィッシュの方法はまた、モルホリノのマイクロインジェクションのmRNA、またはトランスジェニック構築物、並びに胚移植の間を含むタイムラプス顕微鏡実験、組み込むことができる。複数の現像組織の分析にのみ蛍光標識組織への能力によって、クロストークなしに異なる蛍光体の所望の数を検出するための共焦点顕微鏡の能力によって制限される。ゼブラフィッシュ胚のクラッチから撮像することができる個人の数厳しく制約されているが、高度な技術同じ期間に、いくつかの胚の自動画像化を可能にする。簡単に早い時点で識別されない突然変異体の経時的解析を実行しようとする場合に特に有用である。

タイムラプス共焦点画像から測定を行う場合には、いくつかの発達遅延...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6ポンドテストモノフィラメントライン	コートランドライン会社	SLB16
ガロースI	アムレスコ	0710
アルゴン	レーザーLASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
カルシウム	シグマアルドリッチ	C8106
キャピラリーチューブ、100 mm、0.9 mm ID	FHC	30-31-0
クローブオイル	ヒルテックカナダ	HB-102
高真空グリース	ダウ コーニング	2021846-0807
Isotemp ドライバスインキュベーター	Fisher Scientific	2050FS
レーザー走査型顕微鏡	Carl Zeiss AG	LSM 710
硫酸マグネシウム六水和物	Sigma-Aldrich	230391
顕微鏡カバーガラス、22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
顕微鏡カバーガラス、24 x 60-1	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-M
塩化カリウム	フィッシャーサイエンティフィック	M-11321
リン酸カリウム二塩基性	Sigma-Aldrich	P3786
塩化ナトリウム	ッシャーサイエンティフィ	M-11624
リン酸ナトリウム二塩基性	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.